雙酶法輔助提取百香果原花青素及其抗氧化性研究

唐鵬程，王雪亭，尚文文，胡靜雯

（1.江蘇食品藥品職業技術學院藥學院，江蘇淮安 223003；2.江蘇食品藥品職業技術學院本科生院，江蘇淮安 223003）

原花青素（Proantho cyanidins，PC） 作為公認的天然抗氧化劑是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱[1-2]，具有消除自由基的能力，能夠高效地消除超氧陰離子自由基和羥基自由基，其清除自由基的能力是維E 的50 倍。雖然不是最強抗氧化劑，但是基于其水溶性的性質，總體吸收率遠遠領先于其他物質。

目前，從植物中提取原花青素的研究中已發現蓮子殼[3]、藍莓[4]、白刺果[5]、珊瑚樹葉[6]、鎖陽[7]、油茶殼[8]中都存在原花青素。近期的研究表明，百香果也含有原花青素[9-10]。利用雙酶輔助法提取百香果中原花青素，通過優化提取工藝，提高原花青素得率，并檢測其抗氧化活性。

1 材料與試劑

百香果，市售；

原花青素標準品、十二水合硫酸鐵胺（Ⅲ）、濃鹽酸、正丁醇、無水乙醇、DPPH 試劑。

2 試驗方法

2.1 原花青素提取

取新鮮百香果5 顆，去籽，用粉碎機粉碎1 min，得提取原料。準確稱取百香果原料1 g，纖維素酶和果膠酶10 mg。置于50 mL 燒杯中加入純水10 mL 并滴入酶，于恒溫40 ℃下與酶反應30 min。再添加乙醇溶液10 mL，升高溫度到70 ℃后，提取1 h，制得百香果皮中的原花青素的提取母液。

百香果原花青素提取率的計算公式：

2.2 原花青素檢測

試驗方法采用Lawrence J Porter 等人[11]的鐵鹽催化比色法。

2.2.1 配制鐵鹽催化比色法顯色劑溶液

將1.029 8 g 十二水合硫酸鐵銨（Ⅲ） 精確稱量并溶于濃度為2 mol/L 的鹽酸溶液4 mL 中，得到質量分數為2%的硫酸鐵銨溶液；另外，將正丁醇與濃度為2 mol/L 的鹽酸溶液按體積比V(正丁醇)∶V(鹽酸)=95∶5 混合均勻，即得正丁醇- 鹽酸溶液[12]。

2.2.2 原花青素測定

取10 mL 的試管，在其中分別加入樣液1.0 mL、正丁醇- 鹽酸溶液6.0 mL 和質量分數2%的硫酸鐵銨溶液0.2 mL 后，振蕩試管使其中液體充分混合均勻，在水浴100 ℃下反應40 min，反應結束后放在冰水中冷卻至常溫，使用紫外可見分光光度計于波長547 nm 下檢測該混合液的吸光度，以此來有效實現對原花青素含量的測定[12]。

2.2.3 建立原花青素標準曲線

稱取50.0 mg 的原花青素標準品放在25 mL 的容量瓶當中，使用無水乙醇將其定容至容量瓶的刻度線，充分搖勻后得到質量濃度為2 mg/mL 的原花青素標準品溶液。以4 mL 為基準，配制稀釋溶液使其各組的質量濃度分別為0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2 mg/mL，于波長547 nm 處測定各質量濃度的吸光度，建立吸光度對原花青素質量濃度的標準曲線[12]，得線性方程為：A=5.304 3C+0.004 86，R2=0.985 9。

標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線

2.3 果膠酶和纖維素酶配比的篩選

分別取10 mg 的果膠酶和纖維素酶溶于10 mL純水。取百香果1 g 加入20 mL 純水，按10 ∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10 的配比和1 組不加酶的對照組共分成12 組，在40 ℃下與酶反應30 min，加入乙醇溶液10 mL，升高溫度到70 ℃，提取1 h。比較各組提取率，得出酶的最佳配比。

2.4 混合酶最佳反應條件的確定

2.4.1 酶解溫度的確定

取百香果1 g，在果膠酶與纖維素酶配比為7∶3，溶液pH 值為4，乙醇體積分數為50%，料液比為1∶15（g∶mL），酶解時間1 h，測量溫度分別為30，35，40，45，50，55，60 ℃時對酶活性的影響。

2.4.2 酶解pH 值的確定

取百香果1 g，果膠酶與纖維素酶的配比為7∶3，乙醇體積分數為50%，料液比為1∶15（g∶mL），酶解溫度為40 ℃，酶解時間為1 h，酶解pH 值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，分別觀察酶溶解時的pH 值對酶活性的影響。

2.4.3 酶解時間的確定

取百香果1 g 時，果膠酶與纖維素酶的配比為7∶3，乙醇體積分數為50%，料液比為1∶15（g∶mL），酶解溫度為40 ℃，溶液pH 值為4，酶解時間為0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00 h 時對酶活性的影響。

2.4.4 正交試驗

在酶解溫度、酶解pH 值和酶解時間3 個單因素的條件下，以提取率為考查指標進行設計正交試驗。

正交試驗的因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗的因素與水平設計

2.5 不同提取條件對百香果原花青素提取率的影響

2.5.1 反應溫度對百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在乙醇體積分數50%，料液比1∶15（g∶mL），反應時間1 h，酶解溫度分別為30，40，50，60，70，80，90，100 ℃時，研究酶解溫度對原花青素提取率的影響。

2.5.2 乙醇體積分數對百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在酶解溫度70 ℃，料液比1∶15（g∶mL），酶解時間1 h 的條件下考查乙醇體積分數分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%對原花青素提取率的影響。

2.5.3 料液比對百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在酶解溫度70 ℃，乙醇體積分數50%，酶解時間1 h，料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g∶mL） 時，研究料液比對原花青素提取率的影響。

2.5.4 酶解時間對百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在酶解溫度70 ℃，乙醇體積分數50%，料液比1∶15（g∶mL），酶解時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h時，研究酶解時間對原花青素提取率的影響。

2.6 響應面法優化百香果原花青素提取工藝

在單因素的條件下，選定溫度為70 ℃時進行反應，把乙醇體積分數、料液比和酶解時間作為變量，用百香果皮中提取的原花青素提取率作為響應值，運用Minitab 19 軟件，進行L9（34）試驗。

L9（34）因素與水平設計見表2。

表2 L9（34）因素與水平設計

2.7 抗氧化性檢測

取1.8 mg DPPH 用乙醇溶液50 mL 定容，得DPPH- 乙醇溶液。取4 mL DPPH- 乙醇溶液，分別加入不同濃度的百香果原花青素樣品液，振蕩后，避光靜置30 min，于波長517 nm 處測定吸光度，進行3 組平行試驗，計算百香果原花青素對DPPH 自由基的清除活性[13]。清除率計算公式為：

式中：A0——避光前的吸光度；

A1——靜置30 min 后的吸光度。

3 結果與分析

3.1 果膠酶和纖維素酶的最佳配比的確定

2 種酶的不同配比對百香果中花青素提取率的影響見表3，2 種酶的不同配比對百香果中花青素提取率的影響見圖2。

表3 2 種酶的不同配比對百香果中花青素提取率的影響

圖2 2 種酶的不同配比對百香果中花青素提取率的影響

由圖2 可知，果膠酶的加入對百香果中原花青素的提取率有促進作用，當果膠酶∶纖維素酶達到7∶3 時，提取率會達到最大值。

3.2 混合酶最佳酶解條件的確定

3.2.1 酶解溫度的確定

研究酶解溫度分別為30，35，40，45，50，55，60 ℃時，原花青素的提取率。

酶解溫度對提取率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對提取率的影響

由圖3 可知，適當提高溫度可以提高酶活性。當酶解溫度超過40 ℃時，酶活性降低。因此，最佳酶解溫度為40 ℃。

3.2.2 酶解pH 值的確定

研究酶解pH 值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0 時，原花青素的提取率。

pH 值對提取率的影響見圖4。

圖4 pH 值對提取率的影響

由圖4 可知，該混合酶在pH 值為4 時，提取率達到0.025%，酶活性最高，隨著pH 值增大，提取率顯著下降，酶活性迅速下降。

3.2.3 酶解時間的確定

研究酶解時間分別為0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00 h 時，原花青素的提取率。

酶解時間對提取率的影響見圖5。

由圖5 可知，用雙酶輔助提取時，酶解時間0.75 h 的提取率最大，隨著酶解時間的延長原花青素得率逐漸降低。

3.2.4 正交試驗

正交試驗結果見表4。

表4 正交試驗結果

由表4 可知，當酶解溫度為40 ℃，酶溶解pH值為4，酶解時間為0.75 h 時是酶解的最適條件，與單因素試驗結果一致。

3.3 不同提取條件對百香果中原花青素提取率的影響

3.3.1 酶解溫度對百香果中原花青素提取率的影響

酶解溫度對提取率的影響見圖6。

圖6 酶解溫度對提取率的影響

由圖6 可知，百香果中原花青素的提取率隨著酶解溫度的上升逐漸增長。酶解溫度對酶解體系的萃取效果具有雙重效應。一方面，溫度升高有利于改善體系傳質效能，加大擴散系數，利于原花青素向溶劑中擴散，提高萃取率；另一方面，隨著提取溫度的升高，短時間內高溫分解原花青素的量低于提取的原花青素的量。為避免乙醇大量揮發，影響料液比和乙醇體積分數，酶解溫度定為70 ℃。

3.3.2 乙醇體積分數對百香果原花青素提取率的影響

乙醇體積分數對提取率的影響見圖7。

圖7 乙醇體積分數對提取率的影響

由圖7 可知，當乙醇體積分數過低或過高都不利于百香果皮中原花青素的提取，當乙醇體積分數達到60%時，原花青素的提取率達到了最佳值0.39%。原花青素作為多酚化合物，容易溶解在水和大多數的有機溶劑當中，當從百香果皮中提取出的原花青素的極性與當前系統的極性相像時，更容易被提取。

3.3.3 料液比對百香果原花青素提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖8。

圖8 料液比對提取率的影響

由圖8 可知，從百香果中提取原花青素的速率隨料液比先增加后降低。當料液比為1∶10（g∶mL），提取率達到最佳值0.52%。

3.3.4 酶解時間對百香果原花青素提取率的影響

酶解時間對提取率的影響見圖9。

圖9 酶解時間對提取率的影響

由圖9 可知，當酶解時間不充足時，存在于百香果皮中的原花青素不能完全擴散到乙醇和水的混合溶劑當中，使得體系萃取的效果不完全；當酶解時間超過2.0 h 時，原花青素會因為分解量激增，對產率的提高造成不利影響。當酶解時間為1.5 h 時，可以實現對百香果中原花青素的有效提取。

3.4 響應面法優化百香果原花青素的提取工藝

3.4.1 建立模型

響應試驗結果見表5。

表5 響應試驗結果

利用Minitab 19 軟件對試驗結果進行擬合。

3.4.2 響應面分析與優化

兩因素交互作用對提取率影響的響應面圖和等高線圖見圖10。

圖10 兩因素交互作用對提取率影響的響應面圖和等高線圖

利用Minitab19 軟件通過響應面法分析了乙醇體值基本吻合，說明該試驗基于響應面法優化得出的提取工藝準確可信。

3.5 抗氧化性檢測

百香果原花青素對DPPH 自由基清除率的影響見圖11。

由圖11 可知，百香果原花青素對DPPH 自由基具有更高的清除能力，并且隨著原花青素濃度的增加。在試驗中還發現，百香果原花青素與DPPH 自由積分數、料液比和酶解時間之間的相互作用，繪制了以百香果中的原花青素為響應值的響應面3D 曲面圖。依據圖中各因素的趨勢，可以直觀地反映出該因子對百香果中的原花青素提取率的影響程度。由圖10（a） （b） （e） （f） 可知，當原花青素的提取率隨料液比先增大后減小。由圖10（c） 和10（d） 可知，當料液比大于一定的乙醇體積分數時，適當延長提取時間有利于提高提取率。

由響應面的三維曲面圖可知，響應值存在最大值。通過Minitab19 軟件模擬優化，得到百香果原花青素提取最優的理論工藝為乙醇體積分數54%，料液比1∶6.8，反應時間1.44 h，該條件下提取率為0.94%。

3.4.3 響應面法的可靠性

為驗證理論模型的可靠性，在經過酶解的最優方法處理后，選取乙醇體積分數54%，料液比1∶6.8，酶解溫度70 ℃，酶解時間1.44 h，做3 次平行試驗，提取率分別為0.959%，1.125%，1.096%，計算出3 次試驗的平均提取率為1.06%，與模擬出理論基的反應十分迅速，滴入原花青素提取液立即褪為透明色。

4 結論

經試驗研究發現，以百香果皮為原材料提取原花青素的最佳工藝為料液比1∶6.8，乙醇體積分數54%，先在果膠酶∶纖維素酶7∶3，pH 值4，40 ℃的條件下酶解0.75 h，再70 ℃提取1.44 h，在這種條件下原花青素的提取率可達到1.06%。同時，經檢測發現百香果中的原花青素具有較強的抗氧化性。

圖11 百香果原花青素對DPPH 自由基清除率的影響