閩北風吹肉制成中微生物組成及多樣性變化

范 俐，秦鑫宇，周聰麟，李 力

（武夷學院茶與食品學院，福建南平 354300）

閩北風吹肉（又稱閩北臘肉） 是以新鮮豬肉為原料，經過腌制、風干等多道工序加工而成，香氣濃郁、滋味鮮美、風味獨特而深受廣大消費者的喜愛[1]。風吹肉因水分較少而限制了有害微生物的滋生，保存期較長[2]。微生物發酵是影響風吹肉制品成熟度、口感風味的重要環節[3]。微生物對蛋白質、脂肪、碳水化合物進行降解[4-5]，形成酸、醛、酮、酯、次黃嘌呤、短肽等物質，使臘肉制品呈現特殊的風味。

通過從家庭作坊式生產的風吹肉制品，結合高通量測序技術（High-throughput sequencing，HTS），研究閩北風吹肉風干過程中微生物菌群組成及多樣性，查找影響風味的關鍵菌群。HTS 可快速、準確、全面地反映不同樣品中微生物群落的組成，鑒定一些低豐度及不可培養的微生物[7]，還可以提供實用的基因組成和相關分布[8]。董蘊等人[9]基于變性梯度凝膠電泳和MiSeq 高通量測序技術綜合分析發現恩施地區臘肉中優勢菌群主要是葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬和假交替單胞菌屬。周瑩等人[10]采用高通量測序技術對不同加工階段的徽派臘肉中微生物進行分析，發現成熟中期和成熟結束的臘肉中主要優勢菌為葡萄球菌、鹽弧菌和放線菌。李彥虎[11]分析陜西傳統臘肉制品中微生物多樣性，發現環絲菌屬、肉桿菌屬、乳桿菌屬等為優勢細菌屬。目前，對閩北風吹肉中微生物菌群的研究仍未見報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用自制傳統閩北風吹肉進行試驗。以長條新鮮凍豬肉（長30～40 cm，寬3～5 cm），共12 條，約10 kg，在常溫潔凈水中浸泡解凍3 h，瀝干水分進行腌制。

腌制原料及用量見表1。

表1 腌制原料及用量/g

將處理的豬肉條放進鋁盆中，以白酒涂抹均勻，加入老抽均勻涂抹，最后將食鹽、白砂糖、十三香混合后倒入涂抹，揉搓15 min 左右，用保鮮膜封上盆口，放入4 ℃的冰箱中冷藏腌制4 d，腌制期間每隔1 d 翻一次肉，4 d 后用將肉掛在通風良好，干凈衛生的環境中風干，風干16 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

風吹肉風干期間，采集0，4，8，12，16 d 樣品（五平行），用無菌錫紙包裹，在裝入密封袋中，分別編號A，B，C，D，E，經液氮冷凍后，存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 基因組DNA 抽提

風吹肉樣品中總DNA 的抽取選用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），參照使用說明從樣品中提取DNA。使用Qubit 2.0 分光光度計定量DNA，并通過0.8% 瓊脂糖凝膠電泳確定DNA 提取的完整性。

1.2.3 PCR 擴增

以稀釋后的基因組總DNA 為模板，靶向擴增細菌16S rRNA 基因，擴增引物分別為27F/1492R。選用真菌特異性引物ITS1/ITS2 對ITS 區域進行擴增。PCR 反應采用3 份（3 個平行） 20 μL 的混合液，其中包括5×FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、2 個引物（5 μmol/L） 各0.8 μL、0.4 μL FastPfu 聚合酶、10 ng 的模板DNA、補水至20 μL。PCR 反應條件：預變性為95 ℃，5 min，然后95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，45 s，共27 個循環，72 ℃退火10 min，于4 ℃條件下保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司） 切膠回收PCR 產物，Tris-HCl 洗脫，并進行質量檢測及建庫。

1.2.4 測序數據處理

使用UPARSE version 7.1（http：//drive5.com/uparse/） 以98.65%的相似性截斷值對OTU 進行聚類，利用UCHIME 識別并刪除嵌合序列。采用RDP 分類器（http：//rdp Classifier） 分析各16S rRNA 基因序列與Silva（SSU132） 16S rRNA 數據庫的系統進化關系，置信閾值為70%。擴增子測序由上海百澤龍生物技術有限公司完成。使用Biozeron 云平臺（http：//www.cloud.biomicroclass.com/CloudPlatform） 對微生物進行α 多樣性和β 多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 高通量測序數據統計與分析

按照98.65% 相似性對非重復序列（不含單序列） 進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，生成OTU 表格。

細菌和真菌高通量測序結果統計見表2。

表2 細菌和真菌高通量測序結果統計/個

根據表2 可知，細菌中共獲得7 870 個OTUs，涵蓋16 個門，217 個屬，683 個種；真菌中共獲得5 957 個OTUs，涵蓋3 個門，97 個屬，189 個種。

樣品中細菌（a） 和真菌（b） 群落共享和獨有的OTU 的韋恩圖分析見圖1。

圖1 樣品中細菌（a） 和真菌（b） 群落共享和獨有的OTU 的韋恩圖分析

由圖1 可知，各時期樣品中細菌（a） 和真菌（b） 群落共享和獨有的OTU 數目不同，說明不同時期樣品中微生物分類有明顯差異。

2.2 不同風干時期臘肉中微生物群落α 多樣性分析

臘肉樣品細菌（a） 和真菌（b） 群落α 多樣性見表3。

表3 臘肉樣品細菌（a） 和真菌（b） 群落α 多樣性（a） 細菌

由表3（a） 可知，細菌中Chao1 和ACE 指數在風干A，B，C 期不斷增大，說明在這3 個時期里，風吹肉中細菌數目和種類在不斷增加；D 時期有所降低，E 時期指數又增大，可能E 時期一些耐鹽菌恢復生長繁殖。Shannon 和Simpson 指數在A，B，E時期顯著升高說明此時物種的豐度和均勻度很高。

由表3（B） 可知，真菌中Chao1，ACE，Shannon 和Simpson 指數與細菌中的變化相似，A，B，C，E 時期指數增大，說明風吹肉中真菌豐度和均勻度在提高，但總體低于細菌豐度和均勻度，與OTU 數據表結論一致。

（b） 真菌

2.3 樣品中基于屬水平的菌群組成

對風吹肉微生物中主要優勢菌屬（前20 位） 進行分析。

臘肉樣品中優勢細菌（a） 和真菌（b） 菌屬（前20） 及其在樣品中的相對豐度見表4。

表4 臘肉樣品中優勢細菌（a） 和真菌（b） 菌屬（前20）及其在樣品中的相對豐度（a） 細菌

由表4 可知，細菌群落共檢測出16 個門類，其中放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門占絕對優勢。在屬水平上，相對豐度大于1%的主要優勢菌為放線菌（36.5%）、葡萄球菌屬（27.2%）、羅河桿菌屬（8.1%）、嗜冷桿菌屬（6.7%）、沉積物桿狀菌屬（6.1%）、考克氏菌屬（3.4%）、弗蘭克氏菌屬（1.6%）、短根瘤菌屬（1.6%）。這結論與母雨等人[12]研究結果相同，即盤縣火腿中發現葡萄球菌屬為優勢菌屬；有些研究表明魏斯氏菌屬（0.27%）、巨球菌屬（0.26%）、乳球菌屬（0.18%） 是臘肉發酵中重要菌屬[7，13]，但在研究中其含量較少，可能因環境及風干天數不同的條件影響。

真菌群落中共檢測出3 個門類，排名前20 的菌屬分屬于子囊菌門和擔子菌門，在屬水平上，相對豐度大于1%的主要優勢菌為德巴利氏酵母屬（68.9%）、Kurtzmaniella（11.6%）、紅酵母屬（9.9%）、鐮刀菌屬（2.0%）、念珠菌屬（2.0%）、交鏈孢屬（1.3%），表明酵母菌為主要優勢真菌，酵母菌屬于兼性菌，在發酵時可吸收掉殘存氧氣，從而能夠抑制臘肉氧化酸敗，能阻止有害微生物的滋生，還對臘肉風味的形成有促進作用[14-17]。

（b） 真菌

2.4 優勢菌在屬水平上的群落演替

為了揭示各時期樣品中菌群豐度變化和群落動態演替規律，基于屬分類水平，將樣品中細菌和真菌相對豐度＞1%的菌群繪制微生物群落分布柱形圖。

不同時期臘肉樣品中的細菌（a） 和真菌（b）物種分布見圖2。

圖2 不同時期臘肉樣品中的細菌（a） 和真菌（b） 物種分布

由圖2（a） 可知，在各時期的風吹肉樣品中細菌群落演替比較明顯。葡萄球菌屬在風干的A 時期僅為0.6%，B 時期相對豐度達到42.6%，E 時期為31.0%；羅河桿菌屬在A 時期樣品中的相對豐度為25.6%，在B，C，D 這3 個時期中不斷降低。說明葡萄球菌屬、羅河桿菌屬在風吹肉生產早期（1～4 d）有重要作用。

風干各時期中的真菌群落動態演替具有很強的可比性。由圖2（b） 可知，A 時期群落多樣性最大，B，C，D 期在不斷減少，與前面Shannon 和Simpson指數相一致。其中，德巴利氏酵母菌屬A 時期最低14.7%，D 時期最高90.1%，德巴利氏酵母菌可促進高級醇、乙酸酯和脂肪酸酯的生成[18]。Kurtzmaniella和紅酵母屬在整個過程中呈現出不規則的變化；A時期的鐮刀菌屬相對豐度為12.7%、念珠菌屬為7.5%、交鏈孢屬為8.0%，在后期風干過程中逐漸降低為零，可能與風吹肉含水量降低和鹽分相對增加相關。

3 結論

采用高通量測序分析對閩北風吹肉中微生物多樣性進行分析。結果表明，風吹肉中細菌共獲得7 870 個OTUs，涵蓋16 個門，217 個屬，683 個種；真菌共獲得5 957 個OTUs，涵蓋3 個門，97 個屬，189 個種。在5 個不同的風干時期都有各自獨有的OTU，揭示了不同時期微生物群落的多樣性。

風吹肉中的細菌主要優勢菌門為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門；優勢菌屬為放線菌屬（Actinomycetia unclassified）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、羅河桿菌屬（Rhodanobacter） 以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）；真菌主要優勢菌門為子囊菌門和擔子菌門；優勢菌屬為德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、Kurtzmaniella及紅酵母屬（Rhodotorula）。從門水平和屬水平來看，細菌的優勢菌種多于真菌，α 多樣性也發現細菌的群落多樣性優于真菌，說明細菌在風吹發酵過程中比真菌發揮更重要的作用。