基于串聯質譜標簽定量蛋白質組學的痹祺膠囊治療類風濕性關節炎的作用機制

姚鵬飛 ，韓彥琪 ，張祥麟，許 浚 ，王 磊，李 新 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津中醫藥大學，天津 301617

2.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300462

4.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統轉化全國重點實驗室，天津 300462

5.天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，天津 300112

6.津藥達仁堂集團股份有限公司，天津 300193

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種系統性、對稱性、異質性的慢性自身免疫性疾病，主要病理特征為滑膜炎癥、血管翳生成、骨破壞及關節軟骨損傷等[1-2]。RA 發病機制復雜，屬中醫“痹癥”范疇，《素問·痹論》有“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”[3]，外邪入侵是RA 的主要病因。《類證治裁·痹證》記載：“諸痹，良由營衛先虛，腠理不密，風寒濕乘虛內侵”[4]，表明營衛不固、腠理疏豁、氣血虧虛是RA 的內在病因。目前西醫主要采用非甾體類抗炎藥、抗風濕藥、糖皮質激素以及生物制劑等藥物進行治療，但長期服用會對中樞系統、消化系統、心血管損傷和肝腎功能等造成不同程度的損害[5]。中藥在RA 的治療中具有抗炎、鎮痛、免疫調節等多重作用，通過對機體進行多方面調節，療效顯著，不良反應小，部分單味藥及其復方制劑已在臨床上得到廣泛應用[6]。

痹祺膠囊由馬錢子、黨參、白術、丹參、茯苓、牛膝、地龍、川芎、三七和甘草10 味中藥組成，具有益氣養血、祛風除濕、活血止痛的功效。臨床上用于治療氣血不足，風濕瘀阻，肌肉關節酸痛，關節腫大，風濕、RA，軟組織損傷等癥[7-8]。文獻報道，痹祺膠囊對RA 患者療效確切，能夠顯著降低患者紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、類風濕因子（rheumatoid factor，RF）、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）等病理指標，有效改善患者關節疼痛、晨僵及關節腫脹程度等癥狀，具有一定的骨保護作用，提高患者的生活質量[9-11]。基于此，本研究通過運用串聯質量標簽（tandem mass tags，TMT）技術對RA 大鼠膝關節組織進行蛋白質組學研究，通過分析不同組間的差異表達蛋白，為RA 的診斷和發病機制提供新的線索，并初步明確痹祺膠囊對RA 的治療機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量110～130 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養于溫度20～26 ℃、相對濕度45%～65%的屏障環境內。動物實驗經天津天誠新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會批準（No.2021031803）。

1.2 藥品與試劑

痹祺膠囊（批號408700）由天津達仁堂京萬紅藥業有限公司提供；醋酸潑尼松片（批號21020162）購自新鄉市常樂制藥有限責任公司；雷公藤總苷片（批號180502）購自上海復旦復華藥業有限公司；弗氏完全佐劑（批號SLCJ4384）購自美國Sigma 公司；雞II 型膠原蛋白（批號200323）購自Chondrex公司；胰蛋白酶（批號 20220408）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM，批號SLCB6518）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT，批號P1171）購自美國Promega 公司；尿素（批號STBJ7774）購自美國GibcoBRL 公司；乙二胺四乙酸（批號2398B510）、苯甲基磺酰氟（批號0106B036）、考馬斯亮藍染料G250（批號 0138B020）、過硫酸胺（批號BCBG6210V）購自美國Amresco 公司；十二烷基硫酸鈉（ 批號 031M0035V ）、TEMED （ 批號SHBC4286V）、溴酚藍（批號SHBL3668）購自美國Sigma 公司；乙腈（批號F21LCL201）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；TMT 試劑盒（批號WJ334398）購自美國Pierce 公司。

1.3 儀器

L-3000 型常規液相（RIGOL 公司）；Ultimate 3000 nano LC system 納升液相（美國DIONEX 公司）；Powerlook 2100XL-USB 掃描儀（英國UMAX 公司）；Fisher Q-Exactive 質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-7C 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

雄性SD 大鼠適應性喂養1 周后，隨機選取10只作為對照組，其余大鼠在左側足跎肉墊處皮內注射雞II 型膠原蛋白（0.1 mL/只），對照組注射等體積生理鹽水。在第1 次注射免疫的第7 天，在背部注射0.1 mL 相同乳劑加強免疫，觀察大鼠狀態至造模第15 天，篩選雙側關節出現炎癥腫脹的大鼠隨機分為模型組、潑尼松（10 mg/kg）組、雷公藤總苷（10 mg/kg）組和痹祺膠囊各劑量（0.05、0.10、0.20、0.40 g/kg）組，每組10 只。各給藥組連續ig 給藥15 d，對照組及模型組ig 等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。末次給藥前禁食不禁水12 h 以上，末次給藥結束1 h 后，麻醉，腹主動脈采血，取對照組（C）、模型組（M）、痹祺膠囊0.4 g/kg 組（BQ）的大鼠左膝關節組織，每組隨機取3 個樣本混為1 個重復樣本，每組3 個重復用于蛋白質組學研究。

2.2 樣品蛋白提取及濃度測定

在組織樣品中加入裂解液，置于研磨機中勻漿混勻后，4 ℃、20 000×g離心30 min。取上清后加入預冷的TCA-丙酮，?20 ℃沉淀2 h 以上。純丙酮洗滌，4 ℃、20 000×g離心30 min 后棄上清，在沉淀加入純丙酮，?20 ℃沉淀20 min，重復3 次，清洗沉淀。在沉淀中加入裂解液，超聲5 min 助溶，20 000×g離心30 min，取上清。加入DTT 至終濃度10 mmol/L。56 ℃水浴1 h，隨后迅速加入IAM至終濃度55 mmol/L，暗處靜置1 h。20 000×g離心30 min，取上清，使用BCA 法對蛋白進行定量，取1 μL 蛋白提取液（0.2 mg/mL）進行濃度測定。根據定量結果進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳檢測，判定蛋白濃度的準確度及蛋白提取質量。

2.3 蛋白質酶解及肽段TMT 標記

分別取每個樣品30 μg 加入到10 K 超濾管中，4 ℃、14 000×g離心40 min 后，棄上清液。隨即加入200 μL TEAB 溶液（50 mmol/L），4℃、14 000×g離心40 min，棄上清液。加入1 μg/μL Trypsin，100 μg 蛋白質底物加入3.3 μg 酶，37 ℃水浴24 h。凍干消化液，然后每管加入25 μL TEAB（200 mmol/L）復溶肽段。每管加入41 μL 乙腈，加入TMT 標記試劑，混勻后，室溫孵育1 h；加入8 μL 5%羥胺，室溫放置15 min，真空濃縮儀抽干。

2.4 肽段預分離

使用RIGOL L-3220 型常規液相進行肽段預分離純化，色譜條件：Gemini NX-C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm），流動相為5%乙腈水溶液（A）-95%乙腈水溶液（B），梯度洗脫：0～95 min，100%A；95～101 min，100%～95% A；101～107 min，95%～91% A；107～113 min，91%～87% A；113～119 min，87%～81% A；119～125 min，81%～20%A；125～130 min，20%～95% A；體積流量1 mL/min。準備樣品：標記后抽干的樣品用1 mL 5%乙腈水溶液溶解，15 000×g離心10 min，取上清進行測試，得到預分離色譜圖，按照色譜圖分布，將出峰較少的組分進行合并，最終合并成10 個組分，凍干后使用C18反相色譜進行除鹽。

2.5 蛋白質譜檢測

將10個預分離的樣品采用Dionex ultimate 3000 nano LC system 納升液相進行分離。流動相A 為0.1%甲酸-2%乙腈水溶液，B 為0.1%甲酸-98%乙腈水溶液，洗脫梯度：0～40 min，95% A；40～45 min，95%～70% A；45～48 min，70%～40% A；48～55 min，40%～20% A；55～65 min，20%～95% A；體積流量0.4 μL/min。分離后使用Q-Exactive 質譜儀檢測肽段信號，質譜條件及參數為正離子模式，母離子掃描范圍m/z350～2000，二級分辨率35 000，毛細管溫度320 ℃，離子源電壓1800 V，碎裂模式高能碰撞解離（higher collision energy dissociation，HCD），歸一化碰撞能量為30 eV。

2.6 蛋白質鑒定及定量分析

將質譜原始文件輸入到PD（Proteome Discoverer 1.4，Thermo）軟件對質譜譜圖進行篩選，譜圖篩選母離子范圍m/z350～6000，二級質譜圖中最小峰數10，信噪比閾值1.5。PD 軟件根據Mascot 2.3 搜索結果和篩選后的譜圖進行蛋白鑒定，參數設置：固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M）、Gln→Pyro-Glu（N-term Q）、TMT 6 plex（K）、TMT 6plex（N-term），一級質量偏差為1.5×10?5，二級質量偏差為6×10?6，最大允許露切數為1，酶的類型為Trypsin。鑒定所用蛋白數據庫為Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）。定量分析時蛋白定量取值類型為Median，最小肽段數為1，歸一化方法為Median。對結果進行ANOVA 方差分析，進行差異顯著性評估。選取P＜0.05、差異倍數≥1.2 或差異倍數≤0.83 的蛋白為差異表達蛋白。

2.7 差異表達蛋白聚焦分析

對MvsC、BQvsM 2 個比較組的差異表達蛋白進行Venn 圖分析，得到痹祺膠囊干預后有回調趨勢的蛋白，進一步與GeneCards、OMIN 數據庫檢索得到的RA 疾病靶點進行交集分析，從而獲取痹祺膠囊治療后與RA 疾病相關的回調蛋白。

2.8 生物信息學分析

通過OmicsBean 數據庫對RA 相關的回調蛋白進行生物信息學分析，分別從細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）3 個方面對靶點蛋白進行基因本體（gene ontology，GO）功能分析，同時對靶點蛋白進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路分析。

2.9 統計學分析

使用R version 3.6.1 進行數據統計，兩組間比較采用ANOVA 方差分析。

3 結果

3.1 差異表達蛋白結果分析

以P＜0.05、差異倍數≥1.2 或差異倍數≤0.83為條件篩選MvsC、BQvsM、BQvsC 的差異蛋白（顯著上調表達蛋白和顯著下調表達蛋白），統計得到的差異表達蛋白火山圖見圖1。結果顯示，MvsC 組共有1583 個差異表達蛋白，其中上調蛋白有784 個，下調蛋白有799 個；BQvsM 組共有234 個差異表達蛋白，其中上調蛋白有124 個，下調蛋白有110 個；BQvsC 組共有1548 個差異表達蛋白，其中上調蛋白有761 個，下調蛋白有787 個。

圖1 火山結果示意圖Fig.1 Volcanic result diagram

通過對痹祺膠囊治療前后的差異表達蛋白進行Venn 圖分析（圖2）。結果發現治療前后共有187 個蛋白重疊，其中有121 個差異表達蛋白具有回調趨勢（熱圖分析見圖3），其中69 個蛋白在M 組中表達升高，經痹祺膠囊治療后顯著下調；52 個蛋白在M 組中表達降低，痹祺膠囊治療后顯著上調。由于這121 個蛋白在造模前后和給藥治療后均發生了顯著的差異表達變化，初步推斷它們與RA 的發病以及痹祺膠囊的干預途徑密切相關，極有可能成為痹祺膠囊治療RA 的潛在靶標蛋白。

圖2 各組差異蛋白Venn 圖Fig.2 Venn digram of differential protein analysis in each group

圖3 121 個回調蛋白熱圖Fig.3 Heat map of 121 callback proteins

3.2 回調蛋白聚焦分析

為了進一步聚焦痹祺膠囊對RA 作用的核心靶點，通過GeneCards、OMIN 數據庫檢索RA 疾病靶點，共得到5082 個疾病靶點，通過與121 個回調蛋白進行交集分析，最終得到38 個與RA 疾病相關的回調蛋白，相關信息見表1，初步認為38 個蛋白為痹祺膠囊干預的核心靶點。

表1 與RA 疾病相關的回調蛋白信息Table 1 Callback protein information associated with RA disease

3.3 生物信息學分析

GO 分析結果見圖4（以P值最小的前20 個條目進行做圖分析）。分析結果發現，38 個核心回調蛋白在CC 方面主要參與細胞外囊泡、外泌體、基質、細胞外空間成分的構成，也涉及多種細胞器、細胞質、核糖體亞基以及細胞膜結構的組成。在BP方面主要涉及對代謝過程、分子功能、多種生物過程的調控，調節有機物間的相互作用及反應等生物過程。在MF 方面主要參與多種蛋白質、蛋白酶、整合素、細胞黏附分子、RNA 結合等生物成分的結合過程，調節生物結構成分、多種蛋白酶及細胞外基質結構成分的活性。由此可推斷痹祺膠囊可能通過干預上述生物過程及功能，多方面調節機體機能，進而發揮對RA 的治療作用。

圖4 RA 相關的回調表達蛋白GO 功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis of RA-related callback proteins

3.4 通路富集分析

通路富集分析（圖5）發現，38 個核心回調蛋白參與了RA 信號通路，與免疫和炎癥相關的通路如T、B 細胞受體信號通路、Th1 和Th2 細胞分化信號通路、Th17 細胞分化信號通路、白細胞跨內皮遷移等，與骨破壞相關的通路如破骨細胞分化信號通路，與血管翳生成相關通路如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路，與活血相關信號通路如血管平滑肌收縮、花生四烯酸代謝等。結果表明，痹祺膠囊可能通過干預β2 整合素（integrin subunit beta 2，ITGB2）、鈣調磷酸酶B 亞基（calcineurin subunit B type 1，PPP3R1）、鈣調蛋白2（calmodulin 2，CALM2）、前列腺素合成酶（prostacyclin synthase，PTGIS）及FOMD 等核心蛋白的表達，調節與免疫、炎癥、破骨細胞分化、血管平滑肌及血管翳生成等相關信號通路，進而發揮免疫抑制、抗炎、活血、抑制破骨細胞分化及血管翳生成等作用，從而達到對RA 的治療效果。

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

4 討論

RA 是一種病因不明的進行性自身免疫性疾病，主要發病部位在于骨膜組織及其下的軟骨，表現為滑膜炎、軟骨損傷、多關節炎癥及損傷等。中醫學認為RA 屬于“痹證”范疇，與“風、寒、濕”外邪入侵機體有關，其侵入人體，進而閉阻經絡，淤血痰濁，致使氣血不通，不通則痛，最終邪氣停留于關節，日久而成痹，最終出現關節腫大變形、淤血疼痛等癥狀[12-13]。痹祺膠囊具有益氣養血、祛風除濕、活血止痛的功效，對RA 具有良好的療效。本研究通過蛋白質組學實驗發現，痹祺膠囊通過調節多個蛋白的表達，干預了RA 信號通路、免疫及炎癥信號傳遞、破骨細胞分化等過程，進而發揮免疫抑制、抗炎、軟骨保護及活血等作用（圖6）。

圖6 痹祺膠囊作用機制預測圖Fig.6 Biqi Capsule mechanism prediction diagram

RA 作為自身免疫系統性疾病，涉及多種免疫器官及免疫細胞、滑膜細胞及細胞因子表達等過程。現代藥理學研究表明，痹祺膠囊可通過下調白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、IL-18 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎癥因子表達，調節T 細胞分化及Th1/Th2 細胞因子的平衡，有效抑制關節炎癥及滑膜增殖[14-15]；T 淋巴細胞的增殖及分化在RA 的發病過程中具有重要作用。細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是一類介導細胞間和細胞與基質間起黏附作用的糖蛋白，在RA 滑膜炎癥及免疫調節的形成過程中起重要作用[16]；ITGB2 作為T 細胞增殖及活化過程中的關鍵蛋白，通過與ICAM-1 特異性結合，進而引起T 細胞的黏附、遷移，同時刺激T 細胞活化，活化的T 細胞會促進多種細胞因子的釋放，致使機體免疫系統紊亂，同時伴隨炎癥的發生[17]。此外，白細胞跨內皮細胞遷移與自身免疫和炎癥形成密切相關。在組織損傷或感染時，表達在白細胞上的ITGB2與血管內皮上的黏附分子ICAM-1、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）相互結合，緊密黏附后穿越內皮細胞及基膜，跨內皮細胞遷移而離開血管，從而引發自身免疫反應及炎癥[18-19]。另外，蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 gene，PTPN22）是參與T 細胞信號調節的分子之一，其通過去磷酸化和失活T 細胞受體相關的激酶及其底物來防止T 細胞激活，可作為T 細胞激活負調節因子[20-21]。β2 微球蛋白（Beta-2-microglobulin，B2M）通常與主要組織相容性復合體 I（major histocompatibility complex I，MHC-I）負責多種免疫細胞的抗原呈遞，參與T 細胞的激活過程，可作為RA 診斷的標志物及治療的潛在靶點[22-23]。本研究發現，與對照組比較，模型組ITGB2、B2M 的表達顯著升高，PTPN22 表達顯著降低，而經痹祺膠囊干預后均可顯著回調，由此可見痹祺膠囊可通過抑制ITGB2、B2M 表達，增加PTPN22 表達，從而抑制T 淋巴細胞活化及抗原遞呈，影響其功能的發揮，進而降低IL-6、IL-17、TNF-α、γ-干擾素（interferonγ，IFN-γ）等下游細胞因子表達；同時也可有效阻止白細胞跨內皮細胞遷移過程，抑制白細胞募集，共同發揮免疫抑制及抗炎作用。

Ca2+作為第二信使，參與調節機體多種生物過程及功能，包括細胞存活、增殖、凋亡及免疫應答，同時參與多種疾病過程，與RA 發病密切相關[24]，王中華等[25]通過基于網絡藥理學與GEO 芯片方法探究發現鈣信號通路是痹祺膠囊治療RA 的關鍵通路，可通過調節基因功能發揮作用。T 細胞、B 細胞及其他免疫細胞表面上的抗體與攜帶抗原肽的抗原提呈細胞結合，通過激活與不同磷脂酶C 亞型偶聯的G 蛋白偶聯受體，刺激三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，InsP3）的形成，InsP3 擴散至細胞內通過與其受體結合后導致細胞內Ca2+濃度迅速升高[26-27]，Ca2+與CALM2結合形成復合物，與PPP3R1結合后激活鈣調神經磷酸酶，激活T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）級聯信號反應的正調控[27-28]，最終調節Th1、Th2、Th17 細胞分化并產生IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17 等細胞因子，同時使得活化后的B 細胞產生免疫球蛋白，進而在機體自身免疫反應及炎癥反應中共同發揮調節作用[29-31]。另一方面，在破骨細胞分化過程中，骨髓基質細胞和成骨細胞分泌的抑制核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）與破骨細胞表面的核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結合，經磷脂酶C（phospholipase C，PLC）激活3InsP3-Ca2+信號通路，鈣信號通過活化NFAT的轉錄，促進與破骨分化相關基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）、基質金屬蛋白酶-1（matrix metallopeptidase-1，MMP-1）和MMP-3 等表達，促使破骨細胞發生融合、細胞骨架重塑和發揮骨吸收功能[32-33]，研究發現，痹祺膠囊能顯著下調RANKL 表達，上調骨保護素（osteoprotegerin，OPG）表達，從而抑制滑膜增生，減輕關節軟骨及骨破壞[34-35]。同時，Ca2+也參與血管平滑肌收縮信號通路，PLC-β 激活后，啟動Ca2+信號通路，肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）可由CALM2 激活，進而對肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進行磷酸化，使肌動球蛋白得以激活肌球蛋白三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶，最終引起血管平滑肌的收縮[36]。本實驗發現，RA 模型組CALM2 和PPP3R1 的表達顯著高于對照組，經痹祺膠囊干預后有顯著回調趨勢，由此推測，痹祺膠囊通過抑制CALM2 和PPP3R1 表達，進而阻礙鈣信號轉導，抑制NFAT 的轉錄，有效抑制T 細胞、B 細胞中細胞因子的表達，抑制與破骨分化相關基因的表達及血管平滑肌收縮，從而發揮免疫抑制、抗炎、抑制骨吸收及活血等作用。

在花生四烯酸代謝中，PTGIS 會促進其代謝產生前列環素（prostaglandin I2，PGI2），其具有強烈的舒張血管和抑制血小板聚集的作用[37]，同時也具有一定的抗炎及免疫調節作用[38-39]。實驗發現，痹祺膠囊可使PTGIS 表達升高，通過調節花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集，發揮活血功效。

綜上分析，痹祺膠囊通過影響ITGB2、CALM2、PPP3R1、PTPN22、B2M、PTGIS 等關鍵蛋白的表達，抑制T 淋巴細胞的活化、增殖及白細胞跨內皮細胞遷移，阻止Ca2+通路的信號傳導，調控花生四烯酸代謝等生物過程，發揮免疫抑制、抗炎、抑制骨吸收及活血等藥理作用。后續仍需針對這些關鍵靶點蛋白進行相關驗證性實驗研究，以進一步明確痹祺膠囊治療RA 的作用機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突