改良劑對酸性植煙土壤化學性質、細菌群落結構和豐度的影響

譚智勇 王喜英 趙輝 劉杰 艾永峰 劉國權

摘要：研究不同改良劑對酸性植煙土壤細菌群落結構和豐度的影響，從微生物角度為改良劑的篩選及推廣應用提供科學依據。采用田間試驗，應用熒光定量PCR和高通量測序技術，研究改良劑（T1，硅鈣鉀鎂肥；T2，白云石粉；T3，硅鈣鉀鎂肥+生物炭；T4，白云石粉+生物炭）處理下土壤細菌的豐度和群落結構的變化特征，并分析驅動土壤細菌群落結構變化的主要因素。結果表明，添加改良劑均顯著提高了土壤pH值和細菌數量。T3處理細菌豐度最高，分別比CK、T1、T2、T4處理提高了61.29%、3.66%、17.89%、7.73%。施用改良劑顯著增加了土壤細菌群落α多樣性指數，以T3處理效果最明顯。在門水平上，放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門為優勢類群。其中，放線菌門、變形菌門、綠彎菌門的相對豐度在T3處理下顯著高于對照。層次聚類和PCoA結果表明，不同改良劑處理的土壤細菌群落結構差異明顯，其中T3、T4處理的群落結構相似，CK與其他處理間群落結構差異較大。土壤pH值和有機碳、速效磷、硝態氮含量是驅動土壤細菌數量和群落結構變化的主要因素。綜合分析，硅鈣鉀鎂肥+生物炭混施處理在緩解植煙土壤酸化、提高土壤細菌數量和群落多樣性、促進煙株生長發育等方面效果最好。

關鍵詞：改良劑；植煙土壤；細菌；實時熒光定量PCR；高通量測序

中圖分類號：S156.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0240-07

收稿日期：2022-11-21

基金項目：貴州省煙草公司銅仁市公司科技項目（編號：2022-03）；貴州省教育廳自然科學項目（編號：黔教合KY字［2019］175、黔教合KY字［2020］163）；銅仁市科技局項目（編號：2021-77）；銅仁學院碩士點及學科建設研究子項目（編號：trxyxwdxm-029）。

作者簡介：譚智勇（1986—），男，湖南臨澧人，博士，副教授，主要從事煙草科學與工程技術的研究。E-mail：328601771@qq.com。

通信作者：趙 輝，博士，教授，主要從事土壤微生態及作物栽培研究。E-mail：yancao504@163.com。

烤煙是我國重要的經濟作物之一，其種植面積和產質量均位居世界第一，具有較高的經濟價值。近年來，由于長期連作和過量使用化肥，導致土壤質量退化，表現為土壤酸化和生物多樣性減少，煙葉產質量下降^［1-2］。土壤酸化已成為煙葉生產中一個不可忽視的問題，嚴重制約著煙草產業的可持續發展。因此，在酸化日益嚴重的煙區，研究和利用土壤改良劑已成為保障烤煙產量、質量和土壤生態安全的重要措施之一。微生物是土壤生態系統的重要組成部分，參與了土壤生態系統的許多關鍵過程，包括營養循環、有機質周轉、土壤質量維持和毒素降解，可促進改善煙葉品質^［3］。微生物是評價土壤質量變化的重要預警指標之一^［4］。目前，施用石灰是克服土壤酸化的常用措施之一。然而，長期或大量施用石灰會引起土壤板結和土壤養分失衡，導致煙葉產量、質量下降^［5］。因此，為緩解土壤酸化和提高煙田土壤質量，迫切需要篩選出安全可靠的土壤改良劑。生物炭結構穩定，具有較大的比表面積，可減少土壤養分流失；且生物炭營養豐富，可為微生物提供良好的環境條件，提高作物養分的利用效率^［6］。在煙葉生產中，生物炭被廣泛用作土壤改良劑，在促進烤煙生長、改善微生物活性和抑制土傳病害等方面起著重要作用^［3，7］。尚杰等研究表明，施用生物炭可改善土壤環境和提高土壤微生物的生物量^［8］。Gao等研究發現，植煙土壤變形菌門和酸桿菌門的相對豐度隨生物炭施用量的增加而增加^［6］。相關研究認為，硅鈣鉀鎂肥作為堿性肥料，可有效緩解土壤酸化，提高土壤養分含量，促進煙草生長發育，也可克服石灰改良土壤存在的不足^［9］。白云石粉也具有改善土壤理化性質和提高煙葉產量、質量的作用。當前，在我國南方煙區普遍采用白云石粉作為酸性改良劑對土壤進行改良^［10］。劉春英研究發現，施用白云石粉增加了植煙土壤的細菌和真菌數量^［11］。

目前，生物炭、硅鈣鉀鎂肥、白云石粉單獨作為改良劑對植煙土壤理化性質^［3，7］、酶活性^［12］、煙葉產量和質量^［10］的影響等方面的研究較多，然而關于生物炭分別與硅鈣鉀鎂肥、白云石粉混施對植煙土壤微生物群落結構的影響未見報道。為此，本研究采用大田試驗，應用熒光定量PCR和高通量測序技術，開展硅鈣鉀鎂肥、白云石粉及與生物炭混施對植煙土壤細菌群落結構和豐度的影響，旨在為緩解植煙土壤酸化和改善土壤質量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及材料

試驗于2021年在貴州省江口縣獅子口村進行，108°32′58″E，27°48′32″N，海拔835 m。供試土壤為黃壤。土壤理化性質：pH值4.8，有機碳含量 27.57 g/kg，全氮含量1.58 g/kg。供試改良劑：生物炭（有機碳含量為75%，氮含量為1.4%～1.7%，pH值10.1）、硅鈣鉀鎂肥（SiO₂含量≥25%，CaO含量≥25%，K₂O含量≥20%，MgO含量≥12%，pH值8.5）、白云石粉（CaO含量≥31.86%，MgO含量≥22.02%，pH值8.8）。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素隨機試驗設計，分別為：CK，不加改良劑和生物炭；T1，硅鈣鉀鎂肥；T2，白云石粉；T3，硅鈣鉀鎂肥+生物炭（水稻秸稈）；T4，白云石粉+生物炭（水稻秸稈）。每個處理重復3次，行株距為1.00 m×0.55 m，每個小區面積為33 m²，四周設保護行2行。煙地施專用基肥750 kg/hm²、專用追肥225 kg/hm²，硅鈣鉀鎂肥、白云石粉施用量均為 0.2 kg/m²，生物炭施用量為0.45 kg/m²，均作為基肥條施，供試品種為云煙87。2021年4月28日移栽，田間管理措施按優質煙葉管理規程執行。

1.3 樣品采集

2021年6月30日進行根際土壤樣品采集和煙株農藝性狀調查。每個小區使用抖根法采集5株煙株根際的新鮮土壤樣品，混合形成單一樣品。土壤樣品經過2 mm篩選后，用于土壤化學性質和細菌群落的分析。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤化學指標測定

土壤pH值采用電位法測量，全氮含量測定采用凱氏定氮法，有機質含量測定采用重鉻酸鉀容量法，速效磷含量測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀含量測定采用火焰光度法，銨態氮含量測定采用靛酚藍比色法，硝態氮含量測定采用酚二磺酸比色法^［13］。

1.4.2 土壤細菌DNA提取、熒光定量PCR及高通量測序

使用DNA提取試劑盒從0.5 g土壤樣品中提取DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀對DNA純度和濃度進行檢測。利用熒光定量PCR技術對細菌豐度進行分析，擴增引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAC-3′）與519R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）^［14］。每個PCR擴增樣品重復3次，通過Minipre Kit獲得樣品質粒，根據樣品質粒的標準曲線，計算基因拷貝數。

采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，擴增子在Illumina MiSeq平臺進行測序。對原始數據進行質量控制，采用Usearch軟件進行序列分析。具有≥97%相似性的序列被分配到相同的操作分類單元（OTU）。同時對OTU代表序列進行分類注釋。采用QIIME計算細菌的Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數。

1.5 數據分析

采用SPSS 22.0軟件對土壤化學性質、微生物的α多樣性和豐度進行單因素方差分析，使用R軟件進行層次聚類、主成分分析和冗余分析（RDA）。

2 結果與討論

2.1 改良劑對煙株農藝性狀的影響

由表1可知，不同改良劑處理均提高了煙株的農藝性狀。T1、T2、T3、T4處理均顯著提高了株高，分別比CK提高了13.3%、12.5%、19.6%、16.2%。T3處理的莖圍、最大葉長、最大葉寬、葉片數最高，分別比CK提高了16.2%、12.5%、13.2%、9.3%。T3、T4處理對煙株農藝性狀的促進作用優于T1、T2處理，說明硅鈣鉀鎂肥、白云石粉與生物炭配施優于硅鈣鉀鎂肥、白云石粉單施；其中，硅鈣鉀鎂+生物炭處理對煙株農藝性狀的促進效果更好。

2.2 改良劑對土壤化學性質的影響

由表2可知，T1、T2、T3、T4處理的土壤pH值和有機碳、速效鉀含量較CK均有所增加；其中，土壤pH值分別比CK提高了14.4%、31.4%、24.3%、30.1%。T3、T4處理的有機碳含量較高，分別為18.84、18.34 g/kg，分別比CK顯著提高了17.8%、14.7%。全氮含量在各處理中差異不顯著。各處理土壤速效磷含量為71.04～90.09 mg/kg、硝態氮含量為9.74～17.37 mg/kg，分別較CK降低了2.7%～23.3%、44.2%～68.7%。綜上，T3、T4處理對改善土壤酸化和提高土壤肥力的效果較優。

2.3 改良劑對土壤細菌豐度的影響

如圖1所示，不同處理土壤細菌16Sr RNA基因豐度為1.64×10⁹～2.94×10⁹，T1、T2、T3、T4處理后，細菌豐度顯著增加，分別比CK提高了56.0%、37.1%、61.7%、50.3%。T3處理細菌豐度分別比CK、T1、T2、T4提高了61.29%、3.66%、17.89%、7.73%。T1、T3處理細菌豐度明顯高于T2、T4處理。說明改良劑添加對土壤細菌數量有促進作用，其中硅鈣鉀鎂肥和生物炭復配處理效果明顯好于石灰及石灰生物炭配施處理。

如圖2所示，土壤細菌16S rRNA基因豐度與土壤pH值、有機碳含量呈顯著正相關（P<0.05），與速效磷含量呈顯著負相關（P<0.05），與硝態氮含量呈極顯著負相關（P<0.01）。

2.4 改良劑對細菌群落α多樣性指數的影響

利用Illumina MiSeq平臺對土壤細菌測序進行分析（表3）可知，所有處理的覆蓋率均大于0.97，說明測序能力能夠真實反映土壤細菌群落特征。CK、T1、T2、T3、T4處理下土壤細菌OTU數分別為 3 233.67、3 873.67、4 008.00、4 183.67、4 099.33個，且T1、T2、T3、T4處理均顯著高于CK。由此可知，改良劑顯著改變了煙田土壤細菌OTU水平上的物種組成。土壤細菌α多樣性指數變化趨勢大致相同，T3、T4處理的Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數顯著較高，其次是T2、T1處理，CK顯著較低。說明添加白云石粉、硅鈣鉀鎂肥、生物炭均可提高土壤細菌豐富度和多樣性，其中以硅鈣鉀鎂肥+生物炭的效果最明顯。

由圖2可知，Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數分別與土壤pH值、有機碳含量呈極顯著正相關關系，與速效磷、硝態氮含量呈極顯著負相關關系。

2.5 改良劑對細菌群落組成的影響

由圖3可知，在門水平上，得到9個平均相對豐度>1%的類群（放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、藍藻門和硝化螺旋菌門），其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門的相對豐度分別為29.13%～34.49%、17.88%～24.74%、13.01%～19.07%、9.64%～13.58%，占細菌總類群相對豐度的73.61%～87.95%，為優勢類群。其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門在不同處理之間有極差異顯著；厚壁菌門和硝化螺旋菌門在不同處理之間差異顯著。與CK相比，T3、T4處理對芽單胞菌門的相對豐度有促進作用，對厚壁菌門的相對豐度有抑制作用。

施入改良劑增加了放線菌門、變形菌門、綠彎菌門的相對豐度。T1、T3、T4處理的放線菌門相對豐度分別比CK增加了11.59%、18.40%、17.28%。變形菌門的相對豐度在T2（22.95%）、T3（24.74%）、T4（23.07%）處理中顯著高于CK（17.88%）。綠彎菌門的相對豐度在T3處理中顯著高于其他處理，分別比CK、T1、T2、T4處理提高了46.63%、33.20%、36.20%、16.44%。施入改良劑顯著降低了酸桿菌門的相對豐度，T3、T4處理降幅最大。結果表明，改良劑對土壤細菌群落組成有顯著影響，其中以硅鈣鉀鎂+生物炭和白云石粉+生物炭改良劑的影響最大。

2.6 土壤化學性質與微生物群落結構的關系

不同改良劑處理的土壤細菌群落結構差異明顯，除T4處理外，其他處理的3次重復聚類在一起。其中，T2、T3、T4處理聚類較近，CK與其他處理距離較遠（圖4-a）。主坐標分析（PCoA）進一步證實了這種差異。CK與其他處理分布在不同的象限，并且與T1、T2、T3、T4處理相距較遠，說明CK與其他處理之間差異較大。T3、T4處理在同一象限，且距離較近，說明兩者土壤細菌群落結構相似度較高（圖4-b）。

對細菌群落結構與土壤理化性質進行冗余分析。RDA1、RDA2分別解釋了土壤細菌群落變異的76.07%、2.55%，累積解釋了總變異的78.62%（圖5）。土壤pH值和有機碳、速效磷、硝態氮含量對土壤細菌群落結構有極顯著影響（表4）。

3 討論與結論

施用改良劑通過調控pH值的變化，影響土壤有效養分的轉化。土壤pH值過低可導致土壤養分流失加快和肥力下降，對煙株生長發育有抑制作用^［15］。相關研究認為，白云石粉、硅鈣鉀鎂肥、生物炭單施均可提高酸性植煙土壤pH值^［15-19］。李昱等研究認為，施用白云石粉對提高植煙土壤pH值和改善煙葉品質效果顯著^［18］。然而，姜超強等研究認為，白云石粉對提高土壤pH值效果不明顯^［16］。本研究進一步證明，白云石粉對土壤pH值提高的效果優于硅鈣鉀鎂肥。生物炭配施處理下土壤有機碳含量較高，提高了土壤碳含量。施用改良劑后，土壤速效磷、硝態氮的含量降低，其中白云石粉+生物炭和硅鈣鉀鎂肥+生物炭配施處理顯著低于對照，可能由于T3、T4處理煙株長勢較好，吸收了較多的速效磷、硝態氮。

土壤微生物是土壤生態系統中最活躍的成分，對環境變化非常敏感^［20］。Shen等研究認為，土壤酸化引起土壤環境惡化，抑制微生物活性，導致微生物總量下降^［21］。本研究中，施用改良劑均顯著增加了土壤細菌數量，可能是由于土壤pH值升高，有利于微生物生長和繁殖^［22］。T3、T4處理的土壤細菌數量較高，可能由于添加生物炭提高了土壤有機碳含量，為微生物生長提供了充足的碳源^［23］。高雪峰等研究認為，植物長勢好，根系分泌物多，有利于促進細菌數量的增加^［24］。硅鈣鉀鎂肥+生物炭處理煙株農藝性狀（株高、莖圍、葉長、葉寬、葉片數）均顯著高于對照，煙株長勢好，根系通過分泌較多的代謝物，可為微生物生長提供營養和能源。土壤微生物群落多樣性是土壤生態特征的關鍵指標，一定程度上可以反映土壤的肥力^［25］。本研究中，土壤細菌群落豐富度和多樣性指數均以T3、T4處理較高，可能與添加生物炭有關。Shen等研究表明，生物炭富營養、多孔性和吸附性能，可為土壤微生物生長和繁殖提供良好的環境^［21］。施用生物炭后，土壤養分發生了改變，可影響土壤微生物群落組成^［26］。其中，T3處理下土壤微生物多樣性指數略高于T4處理，可能由于硅鈣鉀鎂肥與生物炭混施在改善土壤環境質量方面優于白云石粉和生物炭混施；由于硅鈣鉀鎂肥可為煙草生長提供鉀，有利于促進煙株生長和改善根系發育，根系分泌物增多，有利于微生物生長^［9］。土壤pH值是決定土壤細菌多樣性的重要因素，本研究表明，土壤pH值與土壤細菌多樣性有極顯著相關性，與前人的研究結論^［27］一致。

土壤養分含量對調控微生物群落具有重要作用，是土壤微生物存活、物種組成、代謝的關鍵決定因素^［6，28］。土壤pH值通過影響土壤細菌生理代謝、微生物群落間競爭關系或抑制非適應性微生物生長，從而改變土壤細菌群落^［7，12］。放線菌門在動植物殘體分解過程中起著重要作用，有利于土壤氮轉化，可產生抗生素，減少病原微生物侵害^［27］。本研究中，放線菌門相對豐度為各處理中含量最豐富的細菌類群，平均相對豐度為30％左右。放線菌門相對豐度在對照中最低，說明施用改良劑對放線菌門相對豐度有促進作用，可提高土壤對病原菌的拮抗能力，有利于土壤質量改善。變形菌門具有嗜營養的特點，適宜生長在pH值和有機質含量較高的環境^［29］。變形菌門相對豐度在硅鈣鉀鎂肥+生物炭、白云石粉+生物炭處理中最高，可能由于生物炭是一種高碳含量的堿性產品，施用后增加了土壤pH值和有機質含量^［30］，有利于變形菌門生長。綠彎菌門與地上生物量呈顯著正相關關系^［31］。綠彎菌門相對豐度在硅鈣鉀鎂肥+生物炭中顯著高于其他處理，可能與煙株長勢較好有關，有利于綠彎菌門生長。酸桿菌門相對豐度在對照處理中顯著高于其他處理，可能由于酸桿菌門是嗜酸性細菌，酸性土壤環境有利于酸桿菌門的代謝活動^［32］。同時，對照處理的土壤有機碳、速效鉀等指標均低于其他處理，但酸桿菌門相對豐度增加。由此可知，酸桿菌門喜好營養貧乏的環境，屬于貧營養型細菌^［27］。通過冗余分析探討了土壤細菌群落與土壤理化性質之間的相關性，揭示了土壤微生物群落受特定土壤理化性質的影響。本研究結果表明，植煙土壤細菌群落與pH值和有機碳、速效磷、硝態氮含量有極顯著相關性。施用改良劑后，植煙土壤酸化得到改善，土壤養分也隨之發生變化，導致植煙土壤細菌群落結構受到嚴重影響。

施用改良劑可提高土壤pH值和有機碳、速效鉀含量，增加植煙土壤細菌數量、群落豐富度及多樣性，促進煙株生長。其中，硅鈣鉀鎂肥+生物炭混施處理對緩解土壤酸化和改善土壤微環境效果最優，在烤煙生產中具有較好的應用前景。

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