錳摻雜低聚水飛薊超分子網絡診療一體平臺的開發與性能分析

柯月 馬志方 石強*

1（中國科學院長春應用化學研究所， 高分子物理與化學國家重點實驗室， 長春 130022）2（中國科學技術大學應用化學與工程學院， 合肥 230026）

目前，癌癥仍然是人類健康的主要威脅之一[1-3]，早診斷、早治療是提高癌癥患者生存率的關鍵。傳統的癌癥診斷主要包括超聲、磁共振成像（MRI）、CT 掃描和X 射線等成像方式，但這些方法的敏感性差、分辨率低，導致確診不及時從而錯過最佳的癌癥治療窗口；此外，疼痛和侵入性的組織活檢可能會導致不良的預后[4]。因此，開發高效且患者友好的診療一體化納米平臺成為癌癥納米醫學研究的目標[5]。

隨著納米醫學的進步，治療診斷學的創新概念和策略備受關注，具有潛在的臨床轉化優勢。診療制劑旨在使用相同的納米藥物的同時提供即時診斷和治療[6]，可以監測納米藥物在腫瘤部位的積累，監測其生物分布，根據特定觸發釋放藥物，并評估治療效果，為個性化醫療和患者友好的醫療診斷手段開發鋪平道路，有利于開發多模式腫瘤治療策略[7]。多種納米材料如聚合物、磁性納米粒和量子點等已被開發用于腫瘤檢測和診斷[8-9]，通過靶向和智能響應等策略增強成像靈敏度和分辨率，從而實現早期診斷和及時治療，以改善患者的預后療效[4]。

金屬-酚醛網絡是基于酚類配體和金屬離子之間強配位作用的組裝體系，因其具有良好的生物相容性、固有的生物降解性、多功能的負載能力、可控的尺寸和腫瘤微環境刺激響應性等特性備受關注[10]。金屬-酚醛網絡繼承了金屬離子和酚類自身特性，具有藥物遞送[11]、生物成像診斷[12]以及治療[13]等多種功能。錳離子（Mn2+）是一種優良的磁共振成像（MRI）造影劑，已有多種錳基納米材料被開發用作納米造影劑[14]。此外，Mn2+還具有化學動力學、免疫治療和調控腫瘤微環境等生理特性，能用于腫瘤治療材料的制備[15-16]。本研究將甲醛縮合的多酚類抗腫瘤活性藥物水飛薊低度聚合后引入錳離子源（MnCl2），形成新的配位交聯點，在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的輔助下，采用一鍋法制備了PVP-低聚水飛薊-錳三組分組裝的金屬-酚醛超分子網絡納米結構（PSM）。本方法制備條件簡單，可以通過控制投料比調控納米結構的形貌尺寸，并且能夠負載小分子藥物；同時，PSM 在酸性環境下能發生響應性降解，因此可用于智能響應性遞送系統開發[17]。基于此，本研究通過一鍋法制備了PVP-低聚水飛薊-錳三組分組裝的金屬-酚醛超分子網絡納米結構（PSM），采用多種方法對其結構和性能進行了表征，并著重分析了其診斷成像和抗腫瘤活性。PSM 納米結構的制備以及用于腫瘤診療示意圖見圖1。

圖1 PSM 納米結構制備以及診斷治療的示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation, diagnostic and treatment of PSM nanostructure

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Zetasizer Nano ZS 納米粒度分析儀（英國馬爾文公司）；JEOL JEM-2800 高分辨透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Vertex 70 傅里葉變換紅外光譜儀、D8 Advance X 射線衍射儀（德國布魯克公司）；X 射線光電子能譜（日本島津公司）；TGA 400 熱失重分析（美國鉑金埃爾默公司）；SPECTRO 電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS，德國斯派克公司）；Nano Drop 2000 紫外-可見分光光度計（美國賽默飛科學公司）；M7 小動物核磁共振成像系統（以色列生命科學初創公司）；Synergy 酶標儀（美國安捷倫公司）。

MnCl2·4H2O（分析純）、二甲基甲酰胺（DMF，分析純）和氨水（25%）（西隴科學公司）；水飛薊賓（98%，上海源葉生物有限公司）；PVP（分子量55000）和羅丹明B 6G（RB，99%）（西格瑪奧德里奇試劑公司）；甲醛（37%，麥克林試劑公司）；噻唑藍（MTT，98%，阿拉丁試劑公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 PSM納米結構的制備

利用酚醛縮合反應[18]制備PSM 納米結構。將0.5 mL 水飛薊DMF 溶液（200 mg/mL）加入到4.5 mL乙醇溶液中， 攪拌均勻。在持續攪拌下分別加入18.5 mL PVP 溶液（150 mg）和0.225 mL 氨水，待溶液由淺綠色變為淺黃色后，加入0.19 mL 甲醛溶液（37%），室溫條件反應24 h。向上述溶液中分別加入40、50 和65 mg MnCl2·4H2O， 室溫下持續勻速攪拌24 h，16000 r/min 離心30 min， 收集不同水飛薊-MnCl2質量投料比（2.5∶1、2∶1 和1.5∶1）的沉淀并用去離子水洗滌3 次， 產物在50 ℃烘干過夜， 于陰涼處儲存備用。

1.2.2 模型藥物RB的負載

通過物理吸附方式負載模型藥物RB。向5 mL 1 mg/mL RB 溶液中加入1 mg PSM 納米結構，避光持續攪拌12 h，16000 r/min 離心30 min， 得到PSM@RB，用去離子水洗滌3 次，測定PSM@RB 的UV-Vis 吸收光譜。

分別配制0、1.5625、3.125、6.25 和12.5 μg/mL 的RB 溶液，測定其在525 nm 處吸光度，并繪制濃度測定標準曲線。保留離心過程中的上清液，測定其在525 nm 處吸光度，并根據濃度標準曲線計算上清液中RB 的質量，根據公式（1）和（2）分別計算載藥量（DLC）和載藥率（DLE）：

其中，mRB為投入RB 的總量（mg），ms為上清液中RB 的質量（mg），mtotal為載藥納米粒的質量（mg）。

1.2.3 PSM納米結構體外降解與藥物釋放

通過透析法評估PSM 納米結構的酸響應降解行為。將1 mL 5 mg/mL PSM 納米結構分散液分別在pH=7.4 和5.5 的50 mL PBS 緩沖溶液中進行透析（透析袋截留分子量為3500），置于搖床上，于37 ℃振蕩（30 r/min）， 在0、2、8.5、15 和24 h 時間點取樣，通過ICP-MS 法測定透析液中錳元素的釋放量。

通過離心法測定RB 吸光度變化評估納米結構藥物釋放行為。將1 mL PSM@RB（2 mg）分散液分別加到pH=5.5 或7.4 的PBS 緩沖液（19 mL）中，置于搖床上振蕩（30 r/min）， 分別在0、1、5.5、13、20 和36 h 等時間點取樣，16000 r/min 離心10 min， 測定上清液于525 nm 處的吸光度。

1.2.4 磁共振成像(MRI)性能測定

對體外PSM 納米結構的酸響應條件下的MRI 成像性能進行評估，為了模擬腫瘤部位酸性環境，按照Mn2+濃度分別配制5 組濃度梯度（0、0.0125、0.025、0.05 和0.1 mmol/L）的PSM 納米結構分散液，置于終體積為1 mL 的pH=7.4 和6.5 的PBS 緩沖體系中，搖床振蕩孵育24 h（30 r/min）， 通過小動物磁共振成像系統（1T MRI）分別測定溶液的T1 加權MRI 成像性能和T1 弛豫時間。

建立4T1 小鼠乳腺癌背部荷瘤模型進行體內實驗[19]。當腫瘤達到約120～150 mm3時，以25 mg/kg錳劑量分別向小鼠尾靜脈注射MnCl2溶液和PSM 納米結構分散液，在注射后0、1、2、6、12 和24 h 等特定時間點采用磁共振成像儀對小鼠體內T1 MRI 成像效果進行評估。

1.2.5 體外抗癌活性測定

通過細胞實驗評估PSM 納米結構的體外抗癌活性。將小鼠乳腺癌4T1 細胞復蘇，接種到96 孔細胞培養板（接種密度為每孔1.0×104個細胞），生長至完全貼壁。分別加入200 μL 不同濃度梯度（0、6.25、12.5、25、50 和100 μg/mL）的水飛薊（S）、MnCl2（M）、水飛薊-MnCl2混合液（SM）和PSM 納米結構完全培養基分散液，在細胞培養箱中孵育24 h。棄去上清液，各孔分別加入MTT 試劑反應4 h， 測定其在490 nm 處的吸光度。細胞存活率（Cell viability）根據公式（3）計算。

其中，ODtest為待測樣品孔的吸光度，ODcontrol為對照組僅加入細胞和空白培養基的吸光度，ODblank為未加細胞的空白孔的吸光度。

2 結果與討論

2.1 PSM納米結構的粒徑與形貌分布

水飛薊與MnCl2不同投料質量比得到的PSM 的透射電鏡（TEM）圖如圖2A 所示。當水飛薊與MnCl2投料質量比為2.5∶1 時，得到了粒徑約為80 nm 的球形納米粒子，顆粒邊緣粗糙有毛刺，粒子之間有粘連。這可能是由于在堿性溶劑中，水飛薊經甲醛縮合后的低聚物與加入的Mn2+發生配位作用，以Mn2+為交聯點生長成無定型球狀。當投料比為2∶1 時，納米粒的尺寸增大，形成邊緣更清晰的均一球體。投料比增至1.5∶1 時，球形納米粒之間發生聚集，出現更大粒徑的橢圓形納米結構，粒徑分布范圍更廣。TEM圖表明，MnCl2的添加量對納米球體形成具有重要的作用，PSM 納米結構可能是由多個超小無定型納米粒子聚集組裝形成的。進一步對投料比為2∶1 的PSM 納米結構進行高分辨透射電鏡表征（圖2B），可見碳（C）、氮（N）、氧（O）以及錳（Mn）元素均勻分布在PSM 納米微球球體表面，進一步證實了PSM 納米結構是通過Mn2+與低聚水飛薊酚羥基絡合交聯生長成均一的球體結構。

圖2 PSM 納米結構的形貌與元素分布：（A）水飛薊與氯化錳投料比不同時PSM 納米結構的透射電鏡圖，標尺為200 nm；（B）水飛薊與氯化錳投料比2∶1 的PSM 納米結構元素分布Fig.2 The morphology and structure of PSM nanostucture: (A) Transmission electron microsphere (TEM)images of PSM with different feeding ratio of silymarin to MnCl2,scale bar is 200 nm;(B)Elemental distribution of PSM nanoparticles with feeding ratio of 2∶1 of silymarin to MnCl2

進一步通過納米粒度儀測定了采用不同水飛薊-MnCl2投料質量比制得的納米結構的粒徑與表面電勢變化，結果如表1 所示。隨著MnCl2質量增加，PSM 納米結構的水合粒徑逐漸增大，當投料比從2.5∶1變化到1.5∶1 時，納米粒子粒徑從78.0 nm 增至156.3 nm；納米粒子的表面電位呈負電位，并略有降低。

表1 水飛薊與氯化錳不同質量投料比制備的PSM納米結構的粒徑與電勢Table 1 Size and Zeta potential of PSM nanoparticles prepared with different feed ratios of silymarin and MnCl2

以上結果表明，可以通過改變離子源MnCl2的比例來調整PSM 金屬-酚醛超分子網絡納米微球的尺寸。制備PSM 金屬-酚醛超分子網絡納米結構時，水飛薊與MnCl2最佳質量比為2∶1。由此，通過簡單的一鍋法制備了PSM 納米結構。

2.2 PSM納米粒結構的性質表征

PSM 的傅里葉變換紅外（FTIR）光譜圖見圖3A。紅外光譜中出現水飛薊的多酚苯環骨架伸縮振動峰（1588 和1512 cm?1）、碳氧鍵C—O 的伸縮振動峰（1228 cm?1）以及苯環指紋區C—H 鍵面外彎曲振動峰（820 cm?1）， 說明制備的PSM 納米結構由低聚水飛薊與PVP 組裝[20-21]。采用UV-Vis 吸收光譜測定了PSM 的吸收峰變化（圖3B），水飛薊溶液的最大吸收峰在300 nm 處，PSM 納米結構在240 nm 處出現了新的尖銳吸收峰，這可能是低聚水飛薊苯環及共軛體系π-π*或n-π*躍遷導致的。同時，PSM 納米結構在340～500 nm 之間出現寬帶吸收峰，這可能是Mn2+與低聚水飛薊配位后形成的電子遷移吸收譜帶。以上結果證實水飛薊分子經甲醛縮合低度交聯后通過與Mn2+配位組裝形成了金屬-酚醛超分子網絡納米結構PSM。

圖3 PSM 納米結構的結構與組成表征：（A）PSM 納米結構的紅外吸收光譜；（B）紫外-可見吸收光譜；（C）X 射線衍射（XRD）譜圖；（D～E）PSM 納米結構以及Mn 2p 的X-射線光電子能譜（XPS）圖；（F） 熱失重（TGA）分析PSR：未摻錳的低聚水飛薊Fig.3 Characterization of the structure and composition of PSM nanostructure: (A) Fourier transform infrared(FTIR)spectra of PSM;(B)UV-Vis absorption spectra of PSM and silymarin;(C)X-ray diffraction(XRD)spectra;(D–E)X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)spectra of PSM and Mn 2p;(F)Thermogravimetric analysis(TGA)PSR: silymarin oligomers without manganese doping

采用XRD 測定了不同材料的晶體結構（圖3C），其中，水飛薊具有小分子晶體強烈的特征衍射峰，而在PSM 納米結構中此特征峰消失，說明PSM 納米結構可能是以各組分無定型的混合物形式存在的[22-23]。為了進一步探究PSM 納米結構的元素分布，測定了物質的X-射線光電子能譜（XPS）圖（圖3D和圖3E）。由圖3D 的XPS 譜可知，PSM 納米結構中存在C、N、O、Mn 元素，與高分辨透射電鏡結果（圖2B）一致。在PSM 的Mn 2p 譜（圖3C）中，Mn 元素位于641.6 和653.1 eV 處的2 個峰與Mn3O4的結合能一致，表明Mn 可能是通過與O 原子配位的方式形成超分子網絡配位交聯點。通過ICP-MS 和熱重分析（TGA）進一步測定PSM 納米結構的成分組成（圖3F）。采用ICP 測得Mn 元素含量約為25.3%，由TGA 得到Mn 組分含量約為27.1%，二者測得結果基本一致。通過未摻Mn 的低聚水飛薊（PSR）的TGA曲線計算，PSM 納米結構中水飛薊組分含量約為31.8%。

2.3 PSM藥物釋放與降解

測定了模型藥物RB 的紫外-可見吸收光譜（圖4A），根據其在525 nm 處的最大吸收峰繪制濃度標準曲線（圖4B）。負載RB 后的納米結構（PSM@RB）在525 nm 處出現RB 對應的特征吸收峰（圖4A），表明PSM 納米結構成功負載模型藥物RB。根據吸收峰強度以及RB 濃度標準曲線計算得到RB 的DLC 和DLE 分別為23.4%和4.7%。

圖4 PSM 納米結構的藥物負載以及體外酸響應釋放和降解：（A）負載RB 后紫外-可見光吸收光譜；（B）RB 的濃度標準曲線；（C）PSM@RB 在不同pH 下的藥物釋放曲線；（D）PSM 納米結構在不同pH值下降解釋放Mn 的曲線Fig.4 Drug loading and in vitro acid responsive release and degradation properties of PSM nanostructure:(A) UV-Vis spectra of PSM; (B) Standard concentration curve of Rhodamine B (RB); (C) Drug release curve of PSM@RB at different pH values; (D) Degradation release curves of Mn from PSM at different pH Values

通過測定PSM@RB 樣品在不同pH 值下的藥物釋放以及Mn 釋放曲線考察其酸降解性質。在酸性磷酸鹽緩沖液（pH=5.5）中，RB 在36 h 內的釋放量為71.5%，而在中性條件下，RB 的釋放量僅為50.9%（圖4C），說明PSM 納米結構具有在酸性條件下的藥物釋放性質。由于腫瘤部位在代謝過程中呈現弱酸性，因此PSM 納米結構有利于在腫瘤病灶部位釋放負載藥物[24]。ICP-MS 測定Mn 元素的釋放結果進一步證實了酸響應性和可降解特性（圖4D）。當pH 值從5.5 上升到7.4 時，Mn 在24 h 內釋放量從48.5%下降至10.7%，這證明PSM 納米結構能特定響應酸性微環境發生降解。以上結果表明，PSM 納米結構能夠通過酸響應性降解實現藥物遞送目的。

2.4 PSM納米結構的MRI性能分析

將含有不同Mn2+濃度梯度的PSM 納米結構分散在不同緩沖體系（pH=7.4 和6.5）中孵育24 h， 通過磁共振成像儀進行T1 加權成像。如圖5A 所示，隨著Mn2+濃度增加，T1 信號逐漸增強，證明PSM 納米結構MRI 成像具有濃度依賴性；同時，在酸性環境中，T1 加權圖像信號也較中性環境略有增強，這可能是酸性條件下納米結構發生降解快速釋放的順磁性Mn2+引起的[25]。此外，根據不同梯度濃度的PSM 納米粒結構的T1 弛豫時間，測定了弛豫率r1（1/T1），如圖5B 所示，在酸性條件下，r1從8.8 L/（mmol·S）升至10.1 L/（mmol·S）。體外MRI 成像結果表明，制備的PSM 納米結構具有酸響應的腫瘤診斷成像的造影劑潛能[24]。

圖5 PSM 納米結構體外和體內MRI 成像性能測定：（A～B）不同濃度梯度的PSM 分散液的T1 加權成像以及對應的弛豫率r1（緩沖體系的pH 值分別為7.4 和6.5，濃度單位為mmol/L）；（C）4T1-荷瘤小鼠分別注射MnCl2 和PSM 溶液后在不同時間點的T1 加權成像Fig.5 Measurement of MRI performance of PSM nanostructure in vitro and in vivo:(A–B)T1 weighted imaging of different concentrations of PSM dispersion and corresponding T1 relaxation rate r1 (pH at 7.4 and 6.5,respectively);(C)T1 weighted imaging of 4T1-tumor bearing mice injected with MnCl2 and PSM formulations at different time points

對MnCl2和PSM 在4T1 荷瘤小鼠體內MRI 的成像能力進行評估（圖5C）。靜脈注射MnCl2溶液后，荷瘤小鼠體內T1 加權成像在2 h 達到最強，主要富集在肝臟及腎臟部位，在腫瘤部位信號較弱；隨著時間延長，信號降低，注射24 h 后，在腎臟部位信號顯著降低，這表明MnCl2在小鼠體內循環時間短，容易被肝腎清除。對比MnCl2處理的小鼠，注射PSM 溶液的小鼠腫瘤部位具有明顯的T1 信號富集，并隨著時間延長而逐漸增強，在12 h 強度達到最大，表明PSM 納米粒在腫瘤部位發生了酸響應釋放Mn2+，特異性增強了病灶部位成像效果。在24 h 體內的T1 信號仍然沒有明顯變化，說明PSM 納米結構具有更長的體內循環時間。上述體內外MRI 結果表明，制備的PSM 納米結構具有酸響應激活MRI 以及體內長循環的特性，有望在腫瘤診斷成像以及腫瘤治療過程的監測中廣泛應用[26]。

2.5 PSM納米結構的體外抗腫瘤活性

利用4T 小鼠乳腺癌細胞研究PSM 納米結構的體外抗腫瘤活性，通過細胞毒性實驗（MTT 法）測定PSM 納米結構對4T1 小鼠乳腺瘤細胞的殺傷力，結果見圖6。

圖6 不同濃度的制劑處理的4T1 細胞存活率：（A）水飛薊；（B）MnCl2 溶液；（C）水飛薊-MnCl2 混合溶液；（D）PSM 納米結構各組分實際濃度按照PSM 納米結構質量濃度對應的百分含量計算（水飛薊：31.8%；Mn2+：27.1%）Fig.6 Cell viability of small molecules and PSM at different concentration levels: (A) Silymarin; (B) MnCl2 solution; (C) Silymarin-MnCl2 mixed solution; (D) PSM nanoparticlesThe actual concentration of each component is calculated as the percentage corresponding to the mass concentration of PSM nanostructures (Silymarin: 31.8%；Mn2+: 27.1%)

對于不同小分子藥物組處理的4T1 小鼠乳腺瘤細胞，藥物濃度在25 μg/mL 以下時基本沒有毒性，細胞存活率均在80%以上。藥物濃度升至50 μg/mL 時，MnCl2和水飛薊-MnCl2混合溶液處理的實驗組4T1小鼠乳腺瘤細胞存活率略有降低，低于80%，顯示出輕微的細胞毒性，這主要是由于高濃度Mn2+的輕微抗癌活性導致的。對比其它實驗組，PSM 在濃度為6.25 μg/mL 時表現出細胞毒性，而且隨著濃度增大，4T1 小鼠乳腺瘤細胞存活率下降幅度增大，細胞殺傷力更強；當PSM 濃度達到100 μg/mL 時，4T1 小鼠乳腺瘤細胞存活率為56%。PSM 納米結構的抗腫瘤活性可能來自于兩方面：（1）納米結構中水飛薊以低聚物的形式存在，相較于小分子單體，具有更強的抗癌活性[27]；（2）來自于PSM 納米結構的Mn2+能夠通過多種抗腫瘤通路激活誘導產生更強的抗癌活性[28]。

3 結論

通過簡單的一鍋法制備了PVP-低聚水飛薊-錳3 種組分組裝的金屬-酚醛超分子網絡納米結構PSM，其錳含量達25.3%，并且具有酸性響應降解性質，可在模擬腫瘤微酸性環境中發生降解釋放Mn2+，并實現模擬藥物的高效遞送，具有潛在的載體應用價值。實驗結果表明，此材料在體外實驗中表現出良好的MRI 性能。對于荷瘤小鼠，制備的PSM 納米結構在體內具有較長的循環時間（＞24 h）。此外，4T1 小鼠乳腺瘤細胞毒性實驗表明，PSM 納米結構具有抗腫瘤活性，100 μg/mL 時4T1 小鼠乳腺瘤細胞存活率低至56%。本工作對于腫瘤治療和腫瘤監測具有參考價值，為構建診療一體納米材料的研究工作提供了思路。