基于UPLC-TQ-MS 探究野鴉椿酸在Caco-2 細胞單層模型上的吸收轉運研究

王 寧謝 莉丁文歡田 莉

(1.新疆醫科大學中醫學院,烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院,烏魯木齊 830011;3.新疆名醫名方與特色方劑學重點實驗室,烏魯木齊 830011)

野鴉椿酸(euscaphic acid,EA)又名薔薇酸,是一種存在于薔薇科類植物(如薔薇果、金櫻子等[1])中的三萜酸類化合物,分子式C30H48O5,分子量488.70,結構式見圖1,其不溶于水,可溶于甲醇、氯仿、DMSO 等有機溶劑[2]。

圖1 野鴉椿酸結構式Figure 1 Structural formula of euscaphic acid

野鴉椿酸具有抗氧化[3]和抗癌[4-5]等藥理活性,且無毒、無致突變作用[6]。目前,關于野鴉椿酸的吸收特性及體內過程研究未見文獻報道。來源于人類結腸和直腸癌的Caco-2 細胞經體外培養后可形成與小腸上皮細胞具有相似的微絨毛結構及細胞間緊密連接的單細胞層,且形態學、標志酶的功能表達及滲透特征與小腸上皮細胞類似,可作為模擬小腸上皮細胞吸收轉運的體外吸收模型,目前已被廣泛應用于藥物的腸吸收機制研究[7]。本研究采用Caco-2 細胞模型研究野鴉椿酸的吸收特性,為其后續藥效研究以及體內過程評價提供參考。

1 材料和方法

1.1 細胞株

Caco-2 人結直腸腺癌細胞株購自于武漢博士德生物工程有限公司,實驗所用細胞傳代數在22~42 代內(貨號:CX2266)。

1.2 主要試劑與儀器

野鴉椿酸對照品(批號:YRY097-210101,純度≥98%),購自成都儀捷睿生物科技有限公司;Transwell?12 孔轉運小室(批號:5662)、12 孔板、96孔板、培養瓶均購自美國Costar 公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(批號:FND622)購自依科賽生物科技有限公司; DMEM 培養基(批號:7121572)、非必需氨基酸(批號:11140050)、青霉素-鏈霉素雙抗液(批號:10378016)、胰蛋白酶(批號:25200056)、D-Hank’s 平衡鹽溶液(批號:88284)均購自美國Gibico 公司;熒光素鈉(批號:F8140)、維拉帕米(批號:IV0040)、環孢素A(批號:SC5120)、EGTA(批號:E8050)、無菌二甲基亞砜(DMSO)(批號:D8371)均購自索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)均購自美國Fisher Scientific 公司。超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(美國Waters公司);Millicell-ERS 電位儀(德國Meck millipore);Milli-Q 超純水系統(美國Millipore 公司);Motic AE51 熒光倒置顯微鏡( 日本尼康公司);MULTISKAN FC 酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司);HY-1 型快速漩渦混合器、pHS-5 型精密pH 計(上海儀電科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的配制

精密稱取野鴉椿酸5.00 mg,DMSO 溶解完全,再用HBSS 稀釋至濃度為100 μg/mL 儲備液,備用(DMSO＜0.1%)。

1.3.2 色譜及質譜條件

色譜條件:ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:30℃;樣品室溫度:4℃;流動相:A 相10 mmoL/L 乙酸銨;B 相為乙腈;洗脫方式:梯度洗脫(0~1 min,97% A;1~3 min,97% A→30% A;3~4 min,30% A→97% A;4~6 min,97% A);流量:0.3 mL/min;進樣體積:5 μL[8]。

質譜條件:電噴霧離子源,負離子掃描模式;離子源溫度150℃;錐孔反吹氣為氮氣(純度＞99.99%),流量50 L/h;脫溶劑氣為氮氣,溫度350℃,流量為650 L/h;多反應監測(MRM)模式采集,見表1[1]。

表1 野鴉椿酸質譜條件Table 1 Escaphic acid mass spectrometry conditions

1.3.3 野鴉椿酸方法學考察

用甲醇將野鴉椿酸儲備液梯度稀釋制備系列濃度標準溶液,按照“1.3.2”項下條件測定,繪制標準曲線,并考察精密度、重復性、穩定性和加樣回收率,計算RSD 值。

1.3.4 Caco-2 細胞模型驗證及細胞毒性試驗

將Caco-2 細胞以2.5×105/mL 密度接種至Transwell?12 孔板中,每孔接種0.5 mL,通過測定電阻值(TEER)和熒光素鈉的表觀滲透系數(Papp值)對細胞模型進行驗證[9]。

采用MTT 比色法考察野鴉椿酸對Caco-2 細胞的毒性,按照公式(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%,計算細胞的存活率[10]。

1.3.5 野鴉椿酸攝取試驗

(1)細胞模型建立

將Caco-2 細胞以2.5×105/mL 密度接種于12孔板中,每孔1 mL,連續培養18 d 后進行攝取試驗。

(2)時間對攝取的影響

12 孔板中每孔加入1 mL 25 μg/mL 的野鴉椿酸溶液,分別在0、10、30、60、90、120、150、180、210 min 取樣測定,每個時間點設置3 個復孔,考察時間對攝取的影響。

(3)溫度對攝取的影響

12 孔板中每孔加入1 mL 25 μg/mL 的野鴉椿酸溶液,分別置于4℃、25℃、37℃條件下中孵育180 min,每個溫度設置3 個復孔,考察溫度對攝取的影響。

(4)攝取樣品的制備

將攝取實驗結束后的每孔加入0.5 mL 胰酶消化細胞,1000 r/min 離心5 min,收集沉淀,加入RIPA 細胞裂解液于冰上裂解,水浴蒸干,甲醇復溶,12 000 r/min 離心10 min,取上清液按照“1.3.2”項下條件測定。

1.3.6 野鴉椿酸轉運試驗

(1)野鴉椿酸轉運液的配制

精密吸取一定量的野鴉椿酸儲備液稀釋制成12.5、25、50 μg/mL,作為野鴉椿酸雙向轉運的低、中、高濃度。并制備每毫升分別含有0.100 μmoL的鹽酸維拉帕米(Ver)、0.099 μmoL 環孢菌素A(CsA)和0.025 μmoL 乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)低、中、高濃度雙向轉運液。

(2)細胞模型建立

采用12 孔Transwell ?板進行雙向轉運實驗,包括AP 側→BL 側(即B→A,吸收轉運)和BL 側→AP 側(即A→B,分泌轉運)[11]。

A→B 轉運:將Caco-2 細胞以2.5×105/mL 密度每孔接種0.5 mL 于Transwell?12 孔板中,連續培養18 d 后,在AP 側(作為供給側)加入0.5 mL 的含藥HBSS 溶液,在BL 側(作為接受側)加入1.5 mL 空白液,分別在15、30、60、90、120、150 和180 min 時從BL 吸取200 μL 同時補加200 μL HBSS 緩沖液,水浴蒸干,甲醇復溶,12 000 r/min 離心10 min,取上清液按照“1.3.2”項下條件測定,分別考察不同濃度,不同抑制劑,螯合劑和不同pH 對野鴉椿酸雙向轉運的影響。

B→A 轉運:類似A→B 轉運。在BL 側(作為供給側)加入1.5 mL 的含藥HBSS 溶液,在AP 側(作為接受側)加入0.5 mL HBSS 空白液,按“A→B轉運”方法取樣測定。

1.3.7 計算公式

TEER(Ω·cm2)= (測定電阻-空白小室電阻)×Transwell 小室面積(1.12 cm2)

加入空白溶液的一側為接收側,接收側中的藥量視為其吸收量(Qr)。A→B 轉運試驗中,B 側室在任意時間點吸收的藥量記為(QrBi);B→A 轉運試驗中,A 側室在任意時間點吸收的藥量為(QrAi),具體計算見下公式:

A→B 轉運:Qr Bi=0.2×(Cr1+Cr2+Λ+Cr(i-1))+1.5×Cri

B→A 轉運:Qr di=0.2×(Cr1+Cr2+Λ+Cr(i-1))+0.5×Cd i

公式中,1.5 為B 側室所加的供試液體積(mL),0.5 為A 側室所加的供試液體積(mL),0.2為每次的取樣體積(mL),Cri為第i個時間點接受室的實測濃度(μg/mL)。

表觀滲透系數Papp(cm/s)公式計算如下:

其中dQ/dt 為單位時間藥物轉運量(μg/s),是以時間(s)為橫坐標,藥物累計吸收藥量(μg)為縱坐標所得直線的斜率;A為12 孔Transwell ?膜表面積(1.12 cm2),C0為供給側中加入藥物的初始濃度(μg/cm)。

外排比率(ER)公式計算如下:若比值大于2,則表明藥物在Caco-2 細胞中的轉運具有明顯的方向性,有外排轉運體參與轉運。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.1 軟件對數據進行方差分析(ANOVA),結果以平均數±標準差(±s)表示,組間差異的比較采用t檢驗,當P＜0.05 時,判定差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 野鴉椿酸方法學考察

2.1.1 線性考察

野鴉椿酸的標準曲線為A=30214C+19246(r=0.9999),濃度范圍為0.10~32.00 μg/mL,見圖2。

圖2 野鴉椿酸的MRM 質譜圖Figure 2 MRM mass spectra of euscaphic acid

2.1.2 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率

野鴉椿酸的精密度、重復性、穩定性均有RSD值＜2.00%,平均回收率為99.75%, RSD 值為1.14%,表明該測定方法準確度高,見表2。

表2 野鴉椿酸的加樣回收率(n=6)Table 2 Recovery of euscaphic acid

2.2 Caco-2 細胞模型評價及細胞毒性試驗

2.2.1 Caco-2 細胞模型的評價

Caco-2 細胞細胞培養至20 d 時,TEER 值為703 Ω/cm2,熒光素鈉的表觀滲透系數Papp值為(4.06±0.17)×10-7cm/s,表明所建立Caco-2 細胞模型符合攝取和轉運實驗要求。

2.2.2 野鴉椿酸細胞毒性實驗

野鴉椿酸的濃度在50 μg/mL 以內,Caco-2 細胞的存活率在95%以上。在此基礎上,雙向轉運的低、中、高濃度分別設置為12.5、25、50 μg/mL。

2.3 野鴉椿酸攝取實驗

2.3.1 時間對攝取的影響

在0~180 min 內,隨著時間延長野鴉椿酸的吸收量逐漸增加,180 min 吸收量為(8.38±0.87)μg/mg,之后呈下降趨勢,后續考察時間設為180 min,見圖3。

圖3 野鴉椿酸不同時間的攝取量(n=3)Figure 3 Content of different time of intake euscaphic acid

2.3.2 溫度對攝取的影響

結果表明,隨著溫度升高,野鴉椿酸的吸收量逐漸增加,37℃吸收量為(8.38±0.87)μg/mg,后續考察溫度設為37℃,見圖4。

圖4 不同溫度下野鴉椿酸的攝取量(n=3)Figure 4 Content for different temperature intake euscaphic acid

2.4 野鴉椿酸雙向轉運實驗

2.4.1 濃度對野鴉椿酸雙向轉運的影響

野鴉椿酸的Qr值和Papp值隨著濃度增加而增加,并呈正相關,且Papp值＞10-6cm/s;A→B 的Qr值明顯低于B→A 的Qr值,RB→A/A→B值范圍為1.20~1.40,見表3。表明野鴉椿酸吸收良好,主要轉運方式為被動轉運,且無明顯方向性。

表3 不同濃度野鴉椿酸對Caco-2 細胞模型Qr、Papp 和RB→A/A→B 值的影響(n=3)Table 3 Effect of different concentrations of euscaphic acid on Qr, Papp and RB→A/A→B values in Caco-2 cell model

2.4.2 P-gp 抑制劑對野鴉椿酸雙向轉運的影響

加入P-糖蛋白(P-gp)抑制劑Ver 和CsA 后,野鴉椿酸雙向轉運的Qr值和Papp值無明顯變化,RB→A/A→B值范圍為1.20~1.40,表明野鴉椿酸不是P-gp 的底物,見表4。

表4 P-gp 抑制劑對野鴉椿酸在Caco-2 細胞模型Qr、Papp 和RB→A/A→B 值的影響(n=3)Table 4 Effect of P-gp inhibitors on euscaphic acid in Caco-2 cell model Qr, Papp and RB→A/A→B values

2.4.3 EGTA 螯合劑對野鴉椿酸雙向轉運的影響

加入EGTA 螯合劑后,野鴉椿酸雙向轉運的Qr值和Papp值無明顯變化,RB→A/A→B值范圍為1.10~1.40,表明野鴉椿酸不存在細胞旁路轉運,見表5。

表5 EGTA 螯合劑對野鴉椿酸在Caco-2 細胞模型Qr、Papp 和RB→A/A→B 值的影響(n=3)Table 5 Effect of EGTA on euscaphic acid in Caco-2 cell model Qr, Papp and RB→A/A→B values

2.4.4 pH 對野鴉椿酸雙向轉運的影響

在設定的pH 中,野鴉椿酸的Qr值和Papp值存在明顯差異(P＜0.01),見表6。Qr值和Papp值均有pH=6.00＞pH=5.00＞pH=7.20,RB→A/A→B值范圍為0.80~1.40,表明弱酸性環境有利于野鴉椿酸的轉運。

表6 pH 值對野鴉椿酸在Caco-2 細胞模型Qr、Papp 和RB→A/A→B 值的影響(n=3)Table 6 Effect of pH on euscaphic acid in Caco-2 cell model Qr, Papp and RB→A/A→B values

3 討論

Caco-2 單層細胞模型可模擬小腸上皮細胞的形態和功能,其對藥物的吸收特性與藥物在腸道的吸收相關性良好,因此,建立和驗證可靠、穩定、重復性好的Caco-2 細胞體外吸收模型是進行藥物吸收特性的基礎,并以細胞形態學特征、TEER、Papp和堿性磷酸酶活性等指標進行驗證[12]。本研究建立了Caco-2 單層細胞吸收模型,并評估了細胞形態學、TEER 和熒光素鈉Papp值等指標,表明建模成功,符合后續攝取和轉運實驗要求。采用Caco-2 單層細胞吸收模型研究藥物吸收特性,細胞存活率應高于85%,當細胞存活率低于85%后,Caco-2 單層細胞吸收模型的TEER 明顯降低。采用MTT 法考察野鴉椿酸對Caco-2 細胞的毒性[10]。結果顯示,當野鴉椿酸濃度≤50 μg/mL 時,細胞存活率＞95%,因此,后續實驗中設置的低、中、高濃度(12.5、25、50 μg/mL)符合要求。

表觀滲透系數(Papp)是反映物質在腸道內的吸收能力。在人的空腸中0~100%吸收率的物質在Caco-2 細胞中轉運的Papp值介于5×10-8~5×10-5cm/s 之間。吸收良好藥物的Papp值＞10×10-6cm/s;中等吸收藥物的Papp值為1.0×10-6~1.0×10-5cm/s;吸收不良藥物的Papp值＜1.0×10-6cm/s[13]。本研究結果顯示,野鴉椿酸的Papp值與濃度呈正相關,介于(61.41±2.92)×10-4~ (167.18±6.72)×10-4cm/s 之間,屬于吸收良好物質。在Caco-2 細胞吸收模型中,外排比率(RB→A/A→B)可評價藥物雙向轉運是否具有方向性。當RB→A/A→B值接近于1時,表明藥物主要以被動擴散方式轉運;當RB-A/A-B值＜＜1(一般＜0.6)時,表明藥物主要被小腸頂側膜的轉運載體所攝取[14];而當RB-A/A-B值＞＞1 時(一般＞1.5),表明藥物被小腸頂側膜的轉運蛋白外排。野鴉椿酸的RB→A/A→B介于0.8~1.4 之間,表明其轉運以被動擴散方式為主。

在Caco-2 單層細胞吸收模型中,當藥物是P-gp的底物,P-gp 會降低其攝取以及雙向轉運速率,而P-gp 抑制劑能夠發揮拮抗作用,從而促進藥物的吸收[15]。本研究選取2 種典型的P-gp 抑制劑Ver 和CsA,考察它們對野鴉椿酸在Caco-2 細胞中攝取轉運的影響。結果表明,加入P-gp 抑制劑后野鴉椿酸的Qr和Papp值均無明顯變化,表明野鴉椿酸不是P-gp 的底物。EGTA 是Ca2+專屬螯合劑,其可通過拮抗Ca2+通過細胞膜進入細胞,減少細胞收縮,打開細胞之間的間隙,從而明顯增加藥物的轉運能力。結果表明,加入EGTA 后,野鴉椿酸雙向轉運的Qr和Papp值均無明顯變化(P＞0.05),即野鴉椿酸不存在細胞旁路轉運[16]。

腸道吸收理論認為藥物電離后呈離子狀態,不易通過腸道屏障被吸收,而藥物電離主要由于溶劑pH 值發生改變[17-18]。本實驗考察了不同pH 值(7.20、6.00、5.00)對野鴉椿酸吸收特性的影響。結果表明,當(pH=6.00)條件下野鴉椿酸的Qr和Papp值最高,在中性(pH=7.20)條件下Qr和Papp值最低,由于野鴉椿酸為三萜酸類化合物,弱酸性環境抑制了電離,有利于其透膜吸收。

綜上所述,基于Caco-2 細胞模型研究了野鴉椿酸的雙向轉運特性,考察了不同濃度、pH、溫度、時間、P-gp 抑制劑對藥物吸收的影響。結果表明,野鴉椿酸雙向轉運特性包括主動轉運和被動擴散,在設定的濃度內吸收良好,同時弱酸性的環境可提高野鴉椿酸的轉運吸收,提高其生物利用度。