IBS-D 大鼠腸道菌群-短鏈脂肪酸代謝軸變化特點及丁酸鈉干預作用研究

占 凱吳皓萌鄭 歡秦書敏楊元明黃紹剛

(1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院,廣州 510120;2.廣州中醫藥大學東莞醫院,廣東 東莞 523000;3.省部共建中醫濕證國家重點實驗室,廣州 510120)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是最常見的功能性腸病,以腹痛、腹脹或腹部不適并伴有排便習慣改變為主要臨床表現,基于羅馬IV 標準下的全球患病率約為3.6%~4.0%[1],中國的患病率約為1.4%~11.5%[2]。IBS 有四種亞型,腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是IBS 最主要的亞型,約占IBS 患者數的21.0%~74.1%[2]。腸道菌群作為眾多致病因素和機制的交匯點參與了IBS 的發病過程。既往研究顯示,與健康人群相比,IBS 患者存在明顯腸道菌群失調,且在各亞型IBS 患者中,以IBS-D 腸道菌群失調最為嚴重[3-4]。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等,是結腸細菌通過膳食碳水化合物和一些氨基酸發酵的主要代謝產物,與機體內臟高敏[5]、宿主腸道免疫[6]及腸道屏障功能[7]等密切相關。本研究旨在通過16S rRNA 測序和靶向代謝組學分析IBS-D大鼠模型的腸道菌群-短鏈脂肪酸代謝軸變化特點,以及探討丁酸鈉對該軸的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

17 只SPF 級Wistar 雄性大鼠,7 周齡,體重為(200±20)g,購買于南方醫科大學實驗動物中心[SCXK(粵)2021-0041]。本課題動物實驗經廣州中醫藥大學第二臨床醫學院(廣東省中醫院)倫理委員會批準(BF2020-028-01),實驗動物被飼養于廣東省中醫院科研樓動物中心[SYXK(粵)2018-0094],飼養環境溫度(22±1)℃,濕度(50±10)%,12 h/12 h 明暗交替周期,并提供足夠的食物和水,所有動物適應性飼養1 周后開始實驗,實驗操作遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

丁酸鈉(美國MedChemExpres 公司,批號:27305);醋酸(上海阿拉丁公司,貨號:A298827);DNA 抽提試劑盒(上海索寶生物科技有限公司,貨號:D5625-01);FastPfu 聚合酶(中國環凱微生物公司,貨號:HKE031-01A)。

超微量分光光度計(美國 Thermo Fisher Scientific 公司,型號:NanoDrop2000);MISEQ 測序儀(美國Illumina 公司,型號:Illumina Miseq);PCR儀(美國Applied Biosystems 公司,型號:Applied Biosystems GeneAmp?9700 型);小型離心機(德國,Eppendorf 公司,型號:Eppendorf 5430 R);粉碎研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司,型號:TL-48R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將17 只SPF 級Wistar 雄性大鼠隨機分為正常組(5 只)、模型組(5 只)、丁酸鈉腹腔注射組(7只)。

1.3.2 束縛應激+醋酸灌腸建立IBS-D 大鼠模型

大鼠適應飼養1 周后,予以4%醋酸灌腸1 次,具體方法參考文獻[8]:灌腸前大鼠禁食24 h,乙醚麻醉后,插入涂抹有潤滑劑的灌胃針8 cm,注入1 mL 4%(40 mL/L)醋酸溶液,緩慢拔出灌胃針,用手壓迫肛門并將大鼠尾巴抬高30 s, 30 s 后注入1 mL 0.9%NaCl 溶液沖洗,放回籠中自由活動進食水。與此同時,除正常組外的其余2 組大鼠,每日予自制束縛袋(專利號:ZL201820882292.X)束縛2 h(大鼠無法自由活動,可正常呼吸和排便),每天上午10:00~12:00,持續3 周。

1.3.3 給藥方法及劑量

造模開始后,丁酸鈉腹腔注射組即予以丁酸鈉腹腔注射干預14 d,500 mg/(kg·d)[9]。其余組予以相對應劑量生理鹽水腹腔注射。

1.3.4 取材

糞便:給藥結束后,按照無菌原則收集大鼠糞便,即收集糞便時使用高溫高壓消毒的鑷子、Eppendorf(EP)管及無菌培養皿。帶好無菌手套后,提起大鼠尾巴,用準備好的75%酒精棉球消毒大鼠肛周,刺激大鼠排便至無菌培養皿中,用無菌鑷子將糞便轉移至1.5 mL EP 管中,避免不同組間交叉污染,標號,置于液氮罐中,隨后轉移至-80℃冰箱中儲存待檢。

1.3.5 指標檢測及方法

(1)各組大鼠一般指標測定

觀察模型組與正常組大鼠形態變化,包括皮毛色澤、活動能力變化、神態、活動度、糞便、飲食等情況;每周測量大鼠體重變化、進食量、飲水量及排便情況。

(2)腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評分

在給藥結束后第1 天,用自制的結腸測壓計檢測各組大鼠腹壁撤退反射。檢測前輕輕觸碰大鼠肛門,排便后將涂抹有石蠟油的球囊塞入肛門內8 cm,將連接球囊的管子固定在大鼠尾巴根部。待大鼠平靜后,緩慢向球囊充氣至氣壓為20、40、60 及80 mmHg,20 s 內觀察大鼠腹壁對腸腔球囊擴張刺激的反應,根據AWR 評分標準進行評分。

(3)糞便含水率測定

給藥結束后當天收集所有大鼠的糞便,用離心管采集大鼠糞便,微量天平稱重并記錄后,放置于烘箱2 h,之后再次稱重并記錄。糞便含水率=(烘干前糞便重量-烘干后糞便重量)/烘干前糞重量×100%。

(4)大鼠腸道菌群16S rRNA 檢測

收集大鼠糞便,用DNA 提取試劑盒提取糞便中的總DNA 并檢測其提取質量,然后用338F 和806R引物對V3~V4 可變區進行PCR 擴增。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,UnionCity,加利福尼亞州,美國)進行純化,Tris-HCl 洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega, 美國)進行檢測定量。根據Illumina MiSeq 平臺(Illumina,圣地亞哥,美國)標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300 的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序。

(5)短鏈脂肪酸氣相色譜-質譜聯用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)檢測

量取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸純標準品適量,用乙醚配制成14 個混合標準濃度梯度。色譜條件:色譜柱Agilent HP-INNOWAX 毛細管柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm);分流進樣,進樣量1 μL,分流比10 ∶1。進樣口溫度250℃;離子源溫度230℃;傳輸線溫度250℃,四極桿溫度150℃。程序升溫起始溫度90℃;然后以10℃/min升溫至120℃;再以5℃/min 升溫至150℃;最后以25℃/min 升溫至250℃維持2 min。載氣為氦氣,載氣流速1.0 mL/min。MS 條件:電子轟擊電離源,SIM 掃描方式,電子能量70 eV。取大鼠糞便上清液上機測試驗證方法可行性,待總離子流色譜圖明確8 個短鏈脂肪酸均能夠區分開后,對SCFA 標準液的濃度系列分別進行GC-MS 檢測。經精密度、重復性、回收率檢測無誤后對所有樣品進行定量分析。SCFA 含量(μg/g)= 濃度(μg/mL)×0.5/取樣量(mg)×1000。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23 軟件進行數據處理,畫圖采用Prism 8 軟件,符合正態分布的數據以平均數±標準差(±s)表示,不符合正態分布的數據采用M(P25,P75)表示。符合正態分布且方差齊性的數據,兩間比較采用t檢驗;符合正態分布但方差不齊的數據,兩間比較采用t’檢驗;不符合正態分布的數據,兩組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗,以P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 一般狀態觀察

與正常組相比較,給予4%醋酸灌腸及束縛應激后,大鼠進食量、飲水量減少,自主活動減少,反應遲鈍、蜷縮、扎堆,毛發凌亂,聞聲易驚,肛周污穢,持續排出淺棕色不成形大便,無血便,伴有少量黏液。與模型組對比,經丁酸鈉干預后,進食量、飲水量稍增加,大鼠大便性狀稍成形,自主活動增加,毛色稍光澤。

2.2 體重增長情況

如圖1 所示,與正常組相比較,模型組大鼠體質量呈負增長,在造模第1 周最為明顯,之后體重呈緩慢增長趨勢。丁酸鈉干預后,大鼠體重與模型組大鼠無明顯差異,但呈平穩增長。提過提示腹瀉可使大鼠體重明顯降低,丁酸鈉可在一定程度上緩解束縛應激聯合醋酸灌腸導致的腹瀉,改善IBS-D 大鼠體重。

圖1 各組大鼠體重變化情況Figure 1 Weight change of rats in each group

2.3 腹壁撤退反射(AWR)評分

AWR 實驗是評估大鼠內臟高敏感應用最廣泛的手段。如表1 所示,與正常組相比較,模型組大鼠在40 mmHg、60 mmHg 及80 mmHg 壓力的AWR 評分均升高,差異具有統計學意義,提示內臟高敏誘導成功。與模型組相比較,丁酸鈉組大鼠在60 mmHg 壓力的AWR 評分較模型組顯著下降,在40 mmHg 和80 mmHg 壓力的AWR 評分雖均有下降的趨勢,但均無統計學意義。

表1 各組大鼠AWR 評分結果Table 1 AWR score of rats in each group

2.4 糞便含水率

在造模期間,醋酸灌腸聯合束縛應激所誘導的大鼠均出現不成形大便,腹瀉率為100%。與正常組相比,模型組糞便含水率明顯升高;經丁酸鈉干預后,丁酸鈉組大鼠糞便含水率較模型組降低,差異顯著。具體如圖2 所示。

注:與模型組比較,***P＜0.001。圖2 各組大鼠糞便含水率Note.Compared with model group,***P＜0.001.Figure 2 Water content in feces of rats in each group

2.5 各組大鼠腸道菌群測序

2.5.1 α 多樣性

α 多樣性是評估菌群豐富度和均勻度的指標,如圖3 所示,與正常組相比,模型組大鼠Chao1 指數、Faith-pd 指數及Observed-otus 指數有下降的趨勢,但均無統計學差異。與模型組比較,丁酸鈉組以上指數雖有增加的趨勢,但也均無統計學意義。Shannon 指數在各組之間均無明顯變化。

圖3 各組大鼠腸道菌群α 多樣性Figure 3 α diversity of gut microbiota in each group of rats

2.5.2 β 多樣性

基于unweighted-unifrace 距離來進行PCoA 分析(圖4A)和NMDS 分析(圖4B),結果均顯示正常組、模型組及丁酸鈉組糞便樣本距離接近,提示三組大鼠糞便群落組成結構相似,β 多樣性無明顯差異。

圖4 各組大鼠腸道菌群β 多樣性Figure 4 β diversity of gut microbiota in each group of rats

2.5.3 各組大鼠腸道菌群門、屬水平變化情況

在門水平(圖5A),三組大鼠均以厚壁菌門(Firmicutes)、糖細菌門(Saccharobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)及變形菌門(Proteobacteria)為主要組成,其中厚壁菌門(Firmicutes)均占比70%以上。與正常組比較,模型組厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門均有下降的趨勢,但無統計學差異。與模型組比較,丁酸鈉有逆轉上述菌群下降的趨勢。在屬水平(圖5B),與正常組比較,我們發現模型組乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等相對豐度明顯下降,而布勞特氏菌屬(Blautia)相對豐度明顯升高;經丁酸鈉干預后,乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬及雙歧桿菌屬相對豐度升高但無統計學差異,布勞特氏菌屬相對豐度明顯下降(圖5C、5D)。

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。圖5 各組大鼠腸道菌群門、屬水平變化情況Note.Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 5 Relative abundances of gut microbiota at phylum and species level in each group of rats

2.6 各組大鼠糞便短鏈脂肪酸含量測定

研究結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠糞便乙酸含量明顯升高,丁酸及戊酸含量顯著降低,丙酸、異丁酸及異戊酸含量無明顯差異;與模型組比較,我們發現腹腔注射丁酸鈉可顯著提高大鼠腸道丁酸及戊酸的含量,而對乙酸的表達無明顯作用(圖6)。

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。圖6 各組大鼠糞便SCFA 含量Note.Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 6 Fecal SCFA content in each group of rats

2.7 腸道菌群與SCFAs 相關性

如圖7 所示,Spearman 相關性分析顯示,芽孢桿 菌 屬 (Elusimicrobium)、 考 拉 桿 菌 屬(Phascolarctobacterium) 及 聚 集 桿 菌 屬(Aggregatibacter)與丁酸呈顯著正相關。薩特氏菌屬(Sutterella)、Reyranella與戊酸呈顯著負相關,而芽孢桿菌屬(Elusimicrobium)與戊酸呈顯著正相關,具有統計學意義。

注:橫軸為SCFAs,縱軸為腸道細菌。通過計算獲得R 值(秩相關)和P 值。R 值在圖中以不同顏色展示正相關(紅色)或負相關(藍色),*P＜0.05,**P＜0.01。圖7 腸道細菌與SCFAs 相關性分析Note.Horizontal axis is SCFAs, and the vertical axis is gut microbiota.R value (rank correlation) and P value are obtained by calculation.R value shows positive correlation (red) or negative correlation (blue) in different colors,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 7 Correlation between gut microbiota and SCFAs

3 討論

本研究結果顯示,4%醋酸灌腸聯合束縛應激誘導的IBS-D 大鼠模型可以成功模擬IBS-D 患者的腹瀉及內臟高敏表型,且該類大鼠模型表現為以乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬等相對豐度明顯降低、布勞特氏菌屬相對豐度升高為特征的糞便菌群失調;和以糞便乙酸含量升高,丁酸、戊酸含量降低為特征的SCFAs 代謝失調。與此同時,我們發現丁酸鈉可能通過改善腸道菌群-SCFAs 代謝軸失調而緩解IBSD 大鼠腹瀉及內臟高敏表型。

IBS-D 是目前公認的與腸道微生態聯系最為密切的疾病之一。人體分布的共生微生物有80%生活在消化道內,細胞總數超過1014個,約為人體自身細胞數量的1.3~2.3 倍[3]。羅馬IV 指出腸道菌群失調是IBS-D 的重要機制之一,腸道菌群結構及數量的改變是腸道內臟高敏感、免疫過度激活、腸動力增強、低度炎性反應狀態及黏膜屏障功能受損等腸道穩態失調的重要誘因,參與IBS 重要病理基礎的構成[10-11]。本研究結果顯示三組大鼠腸道菌群的α 多樣性差異無統計學意義,這與目前在IBSD 患者發現的腸道菌群多樣性變化是一致的[12-14]。但是在屬水平,我們發現模型組乳酸桿菌屬(Lactobacillus)及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)相對豐度明顯下降。研究表明,乳酸桿菌(Lactobacillus)是人體腸道中一種豐富的益生菌,不僅具有營養功能,還具有調節腸道功能紊亂、調節免疫及抗腫瘤等作用[15-16]。一些研究還證實乳酸桿菌可提高黏膜屏障功能,主要通過以下三個途徑[17]:(1)增加緊密連接蛋白的表達;(2)促進黏液分泌基因的表達,從而減少病原體與上皮細胞的結合;(3)抑制炎癥的發展。目前關于乳酸桿菌(Lactobacillus)在抑制腸道炎癥方面的研究眾多,如在葡聚糖硫酸酯鈉和2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的結腸炎動物模型、潰瘍性結腸炎患者及克羅恩病患者的治療中均顯示出了良好的抗炎效果;這種抗炎作用可通過上調Toll 樣受體的負調節因子抑制絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB 信號通路的激活實現。而雙歧桿菌屬不僅可以刺激γ-氨基丁酸的產生調節腦-腸軸,從而改善焦慮和抑郁[18];還可以通過調節Treg/Th2 反應和腸道菌群重塑改善葡聚糖硫酸鈉誘導的慢性結腸炎。予以丁酸鈉干預后,IBS-D 大鼠腸道乳酸桿菌屬及乳酸桿菌屬相對豐度均有增加的趨勢,表明丁酸鈉有增加IBS-D 益生菌的潛力。近期研究表明,IBS 患者布勞特氏菌屬(Blautia)相對豐度顯著增加[19],患者腹瀉癥狀與該菌豐度呈正相關,被認為是腸道“失衡”的標志[20],其誘發IBS-D 的機制可能與誘導腸道的炎癥激活,繼而引起腸黏膜屏障損傷和內臟高敏[21]。另外,布勞特氏菌屬是腸道產乙酸的主要菌屬[22],而乙酸是誘導IBS-D 模型的常用物質之一。我們發現布勞特氏菌屬(Blautia)在IBS-D 大鼠模型中明顯升高,而丁酸鈉可降低其相對豐度,提示丁酸鈉改善IBS-D 腹瀉及內臟高敏可能與降低布勞特氏菌屬相對豐度有關。

菌群的失調必然會導致其代謝產物的改變。SCFAs 是腸道菌群的重要代謝產物之一,在IBS-D的發病機制中占據著重要地位。本研究檢測了三組大鼠糞便中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸六種SCFAs 的含量。本研究中丁酸鈉干預后IBS-D 大鼠腸道乙酸含量并未下降,或者其實丁酸鈉有下調乙酸作用,但前期造模時采用了乙酸灌腸,外源性補充的乙酸掩蓋了丁酸鈉的效應作用,因此無法明確丁酸鈉對乙酸的作用,這也是本實驗的不足之處。因此,后續實驗需要評判乙酸在IBSD 的作用時,可考慮束縛應激聯合番瀉葉或大黃灌胃等方法。

丁酸在胃腸道中起到多種益處,丁酸陰離子很容易作為主要的能量來源被腸上皮細胞吸收,其本身還參與了腸道免疫調節和抗炎過程,是結腸細胞增殖和凋亡、胃腸運動的重要調節劑[23]。既往研究表明,丁酸可能通過多種途徑維持腸上皮屏障完整的功能而改善IBS-D 腹瀉:(1)抑制組蛋白去乙?；负屯庵艽倌I上腺皮質激素釋放因子受體的表達[24];(2)參與合成前列腺素E1 促進MUC2 基因的表達, 使MUC2 分泌增加[25];(3)抑制結腸上皮細胞促炎通路的激活,下調炎性因子如 NF-κB、TNF-α、IFN-γ、TLR2 等的表達[26]。給予IBS 患者移植健康人群的糞菌液可顯著提高其糞便丁酸、戊酸表達水平,且應答者丁酸水平與IBS-SSS 評分、疲勞評定量表評分呈負相關[23]。動物實驗顯示丁酸鈉可下調IRAK1 改善腸易激綜合征內臟高敏感[28]。本研究中IBS-D 大鼠糞便丁酸、戊酸含量明顯下降,予以腹腔注射丁酸鈉后,丁酸、戊酸含量明顯升高,結果與上述研究保持一致。針對戊酸而言,僅在IBD 患者中發現戊酸含量降低[29],還需要大量研究來證實其在IBS-D 中的作用,本實驗也為今后進一步深入研究提供依據。

丁酸在腸道中主要由梭菌屬、柔嫩梭菌屬、羅斯式菌屬、真菌屬及丁酸弧菌屬產生,而這些產丁酸細菌的代謝能力還與其他腸道微生物的存在有關,尤其是乳酸菌和雙歧桿菌[30]。研究表明,口服乳酸桿菌能夠增加腸道內產丁酸細菌羅斯式菌屬的豐度,并顯著增加丁酸含量[31]。另外,霍式真桿菌不能利用復雜的低聚糖和多糖,但低聚果糖的存在可以增加雙歧桿菌的豐度,雙歧桿菌產生的乳酸可以被霍式真桿菌利用轉化為丁酸鹽[32]。本實驗中發現丁酸鈉有增加IBS-D 腸道乳酸菌和雙歧桿菌的趨勢,給我們今后的研究有一定提示作用,即丁酸鈉可能通過乳酸菌和雙歧桿菌間接發揮增加調控產丁酸菌的作用,從而改善IBS-D 癥狀,但可能由于樣本量相對較少,結果無顯著性,后續實驗需進一步驗證。與此同時,相關性分析顯示丁酸及戊酸的表達水平與芽孢桿菌屬(Elusimicrobium)、考拉桿菌 屬 (Phascolarctobacterium)、 聚 集 桿 菌 屬(Aggregatibacter)及薩特氏菌屬(Sutterella)密切相關,這為今后進一步研究腸道菌群與SCFAs 的關系奠定了重要基礎。

綜上所述,IBS-D 大鼠存在腸道菌群-短鏈脂肪酸代謝軸失調,丁酸鈉可通過改善該軸失調達到緩解IBS-D 腹瀉和內臟高敏的作用,但由于本實驗主要通過菌群及代謝角度闡釋丁酸鈉與IBS-D 的關系,未進行相關分子生物學檢測及機制研究,后續實驗據此進一步完善。