嚙齒類動物實驗性經前煩躁癥模型研究進展

許佳玲,劉 坤,邢 影,胡明會,張 浩,李自發,耿希文*,魏 盛*

(1.山東中醫藥大學中醫藥創新研究院,濟南 250355;2.山東中醫藥大學中醫學院,濟南 250355;3.山東中醫藥大學實驗中心,濟南 250355)

Hantsoo 等[1]在2015 年的一項研究經前煩躁癥(premenstrual dysphoric disorder, PMDD)與工作表現聯系的結果表明,PMDD 患者普遍伴隨較差的工作-生活平衡、較低水平的心理承受能力和較低工作效率等情況。而隨著病情加重,患者會表現出工作能力差、有效工作時間下降等,病情嚴重的甚至會無法工作。此外,PMDD 患者還多伴隨大量飲酒、睡眠質量差以及情緒焦慮、抑郁等癥狀,這表明了PMDD 對女性的工作與生活造成了重大影響。目前PMDD 發病機制的研究主要集中在如孕酮(progestrone, P)[2-5]及其代謝產物四氫孕酮(allopregnanolone,ALLO)[6-8]調控的激素分泌以及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)[9-12]等受體表達量改變方面,但目前其病理機制尚未明確。動物模型是研究PMDD 病機的重要載體,因此構建能夠準確模擬臨床病理癥狀的動物模型十分關鍵。為此本文將對目前PMDD 的病理機制研究及嚙齒動物的造模方法等內容進行梳理,總結現有動物模型對于PMDD 的研究的貢獻及局限性,以期為相關研究人員提供較為全面的建模參考及更精準的動物模型選擇方案,為推進PMDD 的病理機制研究及治療方案研發提供更多可能性。

1 PMDD 疾病定義和診斷標準

PMDD 被第五版國際精神障礙診斷與統計手冊(the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder,Fifth edition ed.DSM-5)認定為抑郁癥的五種類型之一[12],是一種涉及多種身體及情緒癥狀的嚴重經前綜合征亞型。據文獻報道,80%的女性在育齡期間會出現輕微的經前期綜合征癥狀,其中出現中度到重度癥狀的比例高達1/4,最嚴重的癥狀即PMDD,患者占比為3%~8%[13-14]。PMDD 患者會周期性出現多種軀體及精神癥狀,這不僅危及患者的身體健康,還會嚴重影響其日常生活和人際關系。

DSM-5 的診斷標準中認定:必須連續兩個月經周期出現11 個相關癥狀中的5 個癥狀才能被診斷為PMDD(相關癥狀見表1),并且4 個嚴重癥狀(抑郁、焦慮/緊張、易怒/憤怒、情緒不穩定)必須出現一種[14-15]。PMDD 的這些癥狀并不會因為患有其他精神疾病而加重,因為PMDD 的一些癥狀(如4個嚴重癥狀)具有月經周期性,只在黃體期出現,并在月經結束后的1 周內會消失。這種月經周期性也是診斷PMDD 的必要條件[13]。

表1 PMDD 的診斷標準Table 1 Diagnostic criteria of PMDD

2 PMDD 的發病機制

PMDD 的病因復雜,眾多內部和外部因素如:激素變化、遺傳、營養不良、飲食偏好、環境改變、早期的社會生活環境、神經遞質和免疫系統的改變等[15-16]都能導致癥狀出現。其中研究最多的是下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamus-pituitary ovarian,HPO)軸和下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamuspituitary adrenal,HPA)軸相關的激素分泌,其他的研究對象還包括 GABA 能系統、 5 - 羥色胺(serotonin, 5-HT)系統及基因多態性等,都被認為與PMDD 的病理機制相關。

2.1 PMDD 與激素分泌

目前研究人員對PMDD 研究最為廣泛的是與其癥狀一同周期性出現及消失的卵巢激素波動。孕酮被報道為PMDD“嚴重程度每日報告(daily record severity problems, DRSP)”的預測因子,二者可能有較強的相關性[17]。另有研究表明情緒改善(低程度的攻擊性、易怒和疲勞)與高孕酮水平正相關[18]。孕酮的快速下降會誘發PMDD 易感患者出現癥狀,而其緩慢下降則可以避免癥狀出現[2-4]。

孕酮及其代謝產物ALLO 會隨著月經周期發生自然的波動,其濃度從卵泡期到黃體期不斷增加,而在黃體中晚期,血清中ALLO 與孕酮的比例較低。有研究報道稱有抑郁癥病史的PMDD 患者這個比例與正常女性不同[6-7]。這個可能說明,先前的條件應激可能會以某種特定酶為靶點,影響PMDD 患者體內孕酮轉化為其代謝物。同樣的,另一項研究也認同這個觀點:在月經周期中阻斷孕酮轉化成ALLO,即黃體期ALLO 減少,將會引起焦慮、易怒和悲傷情緒癥狀[8]。因此研究者認為月經周期中ALLO 下降可能是5α 還原酶的表達量的變化導致,從而誘發PMDD 癥狀。

此外,通過對比PMDD 患者與健康女性的基礎狀態,研究人員發現PMDD 患者體內ALLO 和孕酮相較呈高水平,且該患者對皮質醇的敏感性低,并在應激狀態下PMDD 患者體內ALLO 水平沒有波動[19-20],這表明她們體內HPA 軸負反饋功能失調[19]。另一項研究也表明,PMDD 患者經歷長時間應激會出現HPA 軸反應減弱現象[21-22]。而在PMDD 患者中經歷過身體、情感或性虐待的比例顯著高于對照組女性[23-24],這些女性表現嚴重精神癥狀的同時也同樣存在應激狀態下HPA 軸反應遲鈍的現象。這些研究結果都表明,患者早年應激導致HPA 軸的損傷可能與PMDD 出現相關。

2.2 PMDD 與GABAA 受體表達

GABAA受體是一個由兩個α、兩個β 和一個γ或δ 亞基組成,中心為Cl-滲透通道的五聚體復合物[9,25-26]。GABAA受體上有兩個不同的ALLO 和其他神經活性類固醇的識別位點[23],所以GABAA受體對壓力和激素環境很敏感[25-26]。大腦中α/β/δ三種亞型組合而成的 GABAA受體對ALLO 及神經類固醇具有高度敏感[26]。有報道稱,人為誘導動情周期的動物模型,運用孕酮撤退模擬黃體期孕酮快速下降會導致海馬(hippocampus, Hip)[10]和杏仁核(amygdala, Amy)腦區[11-12]中GABA 門控總電流的減少和GABAA受體α4 亞基增加[10]。

因GABAA受體對壓力環境敏感,所以長期處于應激狀態會使GABAA受體特定亞基的表達發生變化。例如,在強迫游泳(forced swimming test,FST)、慢性輕度壓力、長期社會壓力或社交隔離情況下,雄性小鼠前額葉皮質(prefrontal cortex,PFC)和Hip 中,α4、α5、δ 亞基的表達量明顯上升,而α1、α2、γ2 的表達則顯著降低[27]。這些亞基表達量的改變會導致GABAA受體對神經活性類固醇的敏感性發生變化。所以經歷長期壓力可能導致GABAA受體亞基組成的改變從而參與了PMDD 患者焦慮和抑郁表型的產生。另外來自動物模型的一致證據表明,脫氧皮質酮(deoxycorticosterone)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone)、孕酮的3α-、5α-和5β-的還原代謝物是GABA 受體的正向調節因子[28]。這些化合物在應激時通過激活Hip、Amy 和PFC 及其他腦區中的GABAA受體從而抑制HPA 軸的激活[29-30]。

2.3 PMDD 其他發病機制研究

標記的PMDD 遺傳候選基因包括5-HT 轉運體(serotonin transporter, 5HTTLPR)和腦源性神經因子(brain-derived nerve factor,BDNF)66 位基因序列上纈氨酸突變為蛋氨酸(valine66 Methionine,Val66 Met)的多態性基因[31]。選擇性5-HT 再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)的快速給藥可以減少Wistar 雌鼠動情周期依賴性埋珠行為和攻擊行為[32],這表明5-HT 系統或許參與這些行為之中。

而BDNF Val66 Met 的PMDD 患者對比攜帶蛋氨酸(methionine,Met)等位基因的對照組,攜帶Val66 Met 基因患者在月經黃體期表現出額扣帶回皮質較低程度的激活[31]。有報道表明一種與PMDD 特異性相關的神經過敏癥的患者血清中BDNF 含量下降[32],這說明PMDD 可能與BDNF Met 等位基因突變相關。

3 動物模型

以轉化醫學為重點,從動物研究返回到人類臨床研究必須加強基礎研究和臨床研究之間的聯系,研究者必須綜合考慮動物模型的效度標準,而效度標準包含內部和外部效度。簡單來說,內部效度包括實驗的可重復性、觀察者的可靠性、實驗的隨機性以及設計中的質控。而外部效度則涉及到樣本研究的適用性,以確保建立類似病理學動物模型[33]。主要外部效度標準包括:同源效度、病理效度、機制效度、表面效度和預測效度等[34-35],因此,在建立實際動物模型時,應綜合考慮眾多因素,盡可能達到多項效度標準從而制備可靠的實驗動物模型。

造模效度標準是判定動物模型是否達到實驗研究標準的指征。如因動情周期性激素波動,動情間期晚(late diestrus,D2/LD)期孕酮的快速下降會導致模型動物出現如焦慮、攻擊和抑郁樣行為。同時,藥物干預使得模型動物體內兩種激素(P/E2)的水平都達到相應內分泌標準,能有效預防或改善病理行為特征,這說明造模方法達到了表面效度。氟西汀作為抗抑郁藥在臨床試驗中有效地改善了PMDD 癥狀,也有效改善動物模型的內分泌及行為特征,達成了預測效度標準。而基于孕酮或ALLO含量變化在PMDD 疾病中的內分泌病機,在LD 時期或因孕酮停用顯示一定程度病理表型的動物模型,顯示達成病理效度。另外,有研究表明使用居住入侵者測試(resident-intruder test,RIT)等方法造就的易怒/攻擊性(焦慮樣行為指標之一)和抑郁樣表型的動物模型出現GABAA受體亞基組成的改變[9],這在某種程度上可能達到了機制效度。

3.1 造模動物的動情周期

從PMDD 患者的臨床癥狀可以得出動物模型的核心表型,如月經周期的黃體期呈現焦慮、抑郁以及攻擊性/易怒增加,或在一段時間的激素抑制后,可以在動物模型中觀察到表1 中的癥狀。由于PMDD 復雜的發病機制以及其表型在特定生理周期出現及消失,為了驗證PMDD 動物模型的表面效度,構建動物模型時明確動情周期尤其重要。

月經周期的計算以本次月經的第一天開始到在下一次月經來潮前1 d 計算,人類女性平均月經周期為29.3 d[36]。除妊娠期外,女性的月經周期從月經初潮開始會持續到更年期絕經結束[14]。女性月經周期分為兩個階段:(1)卵泡期:從月經結束日開始至排卵日結束。該時期特點是孕酮水平低且持續不變,E2水平在接近輕度卵泡期持續增加,在排卵日水平達到最高。(2)黃體期:從排卵后1 d 開始,在月經來潮前1 d 結束。在這個階段,E2最初下降,但幾天后,它略有增加,在月經前再次下降[14]。相比之下,孕酮在黃體初期開始上升,在黃體期中期達到峰值,并在后期快速下降。正是此時PMDD癥狀出現。

嚙齒類動物的卵巢周期(也稱為動情周期)是生殖和內分泌系統的一系列組織學和生理周期性變化的循環時長,根據其激素波動水平判定,一般約為4~5 d[14]。以大鼠為例,其動情周期可大致分為1~2 d 的接受期(receptive phase,R 期)和約3 d的非接受期(nonreceptive phase,NR 期)。R 期包括動情前期(proestrus,P 期)和動情期(estrus,E 期);NR 期包括動情間期早期(metestrus,D1/M 期)和LD 期。嚙齒動物的R 期和NR 期分別對應人類女性月經周期的卵泡期和黃體期(經前期)。

3.2 造模方法

過去關于PMDD 的神經生物學研究都證實了其病理復雜性。在基礎研究中,既可以通過給予動物一些應激條件以重現PMDD 主要癥狀,進而對嚙齒類動物進行類似抑郁、易怒、攻擊性和焦慮癥狀的行為特征分析,也可以通過激素操縱的方式獲得穩定動情周期的實驗動物進而研究其特定的受體表達量及功能的變化。因此目前PMDD 動物模型的動情周期分為自然動情周期與人工誘導的動情周期。以下根據實驗動物具備的動情周期類型分別進行造模方法介紹。

3.2.1 自然動情周期實驗動物的造模方法

(1)情緒刺激(emotional stimulation,ES)

ES 造模主要依賴于情緒干擾,通常包含多種外部因素。蘇云祥[37]將大鼠連續5 d 置于可調噪聲和脈沖電刺激的籠內進行造模,每日進行陰道涂片檢測大鼠的動情周期,并進行行為學及生物學檢測,結果發現模型大鼠在LD 時期出現PMDD 癥狀,且下丘腦(hypothalamus,HT)和PFC 中去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)含量增加,Hip、HT 中多巴胺含量增加,Hip、HT 和外周血血清中5-HT 含量降低。這說明這種造模方法是通過引起模型動物激素變化而誘導出PMDD 癥狀,符合上述機制效度和表面效度標準,表明該造模方法可造就PMDD 病理模型亞型。

(2)慢性束縛應激(chronic restraint stress,CRS)

CRS 是一種常見的誘導抑郁模型的應激方法,它具有可操作性及可重復性,并能完整地模擬快感缺失狀態。侯金良[38]通過觀察大鼠陰道涂片細胞形態監測大鼠動情周期,并連續4 個NR 期對大鼠CRS 處理進行PMDD 造模后續使用氟西汀膠囊進行治療,并在用藥前后進行曠場、高架十字迷宮和FST 等行為學測試及NE、5-HT 等生物學檢指標測,這種造模方法使大鼠在LD 時期出現PMDD 類似癥狀,行為學及生物學結果一致證實CRS 造模法達到表面效度、機制效度以及預測效度。

(3)大理石球埋藏(marble burying,MB)

Schneider 等[39]依據大鼠對明亮物體規避驚懼的生理特點,對雌性大鼠進行適應性飼養,結束后每只大鼠單籠進行造模,首先向其所在的鼠籠投放9(3×3)個直徑為2.3 cm 的明亮大理石球,再給予紅光及噪聲應激10 min,誘導其產生埋藏行為后給予不同類別的抗抑郁藥(氟西汀、地西帕明、諾米芬辛)及地西泮和孕酮治療。結果顯示該造模方法可以在動物中模擬PMDD 樣癥狀,并且藥物治療可以減少發情周期依賴的大理石掩埋行為。這表明MB造模法可以達成表面效度、病理效度及預測效度。該造模方法配合電刺激衍生的電擊探針埋藏測試(shock-probe burying test)[40]同樣是一項廣泛用于焦慮樣精神疾病的造模方法。

(4)強迫游泳(FST)

FST 會導致老鼠感到“行為絕望”,從而誘發類似抑郁的情緒。強迫游泳測試后對比NR 期和R 期的差值進行PMDD 模型的選取。通過比較動情周期中NR 期(類似于黃體期)和R 期(類似于卵泡期)的靜止時間和靜止次數,并選擇NR 期明顯高于R 期的大鼠(類似于經前期的抑郁狀態和經后期的抑郁樣情緒的改善)作為PMDD 模型[41]。目前已有多項研究表明對自然動情周期的大鼠進行3 次FST,可以誘導大鼠出現PMDD 樣癥狀[42-44],并且生物學檢測結果顯示,造模大鼠出現ALLO[42]、GABA受體亞基[42]及特定腦區蛋白[43-44]等表達量改變。我們之前的研究結果也發現FST 會導致大鼠在動情周期的NR 期抑郁樣行為加劇,而該癥狀會在R期緩解[45]。這一系列表面效度、病理效度及機制效度都說明FST 是一項有效的PMDD 造模方法。

(5)居住入侵(RIT)

為了尋找一種PMDD 的自然動物模型,研究者常選擇給予實驗動物一些社交應激,后分析其在不同動情周期階段中的攻擊性行為篩選出模型動物。RIT 是一種重要的社交應激類型,這種造模方法是將大鼠單籠飼養進行社交隔離,這樣大鼠會對居住地產生一種天然的領地占有感,當有外來大鼠進入籠子時,它會出現本能的攻擊行為[46],大鼠這種由本能攻擊性誘發的憤怒情緒可以模擬人類焦慮、抑郁、攻擊性等精神障礙癥狀,其優勢在于可以減少因人為干預造成的大鼠傷害[47]。并且研究發現使用該方法造就的PMDD 大鼠在NR 期出現PMDD樣癥狀,并且與對照組相比其血清中孕酮、ALLO 及GABA 含量下降[48]。這說明這種造模方法具備表面效度及病理效度。

3.2.2 人工誘導動情周期實驗動物的造模方法

人工誘導PMDD 模型的手段主要是對實驗動物進行卵巢摘除后,人為定期給予激素注射使其模擬PMDD 患者月經周期性激素變化,從而誘發動物在LD 時期出現PMDD 樣癥狀。人為激素誘導可以精準地操控動物的動情周期,從而實現快速有效地動情周期監控進行病理研究。

(1) 孕酮撤退(progesterone withdrawal,PW)模型

PMDD 癥狀開始于黃體后期,并在月經結束不久后消失,大鼠體內孕酮含量會在黃體萎縮后下降,該過程稱為PW。PW 會導致子宮內膜收縮,黃體細胞凋亡和解體,導致子宮內膜出血、脫落以及月經的發生。由于PMDD 癥狀在圍經期出現及結束,最初有人提出性腺激素(P 和E2)參與其病理生理過程[17],血清中孕酮水平在黃體末期快速下降[2-4],而研究證明情緒癥狀與這種快速的PW 相關,利用促性腺激素抑制排卵及孕酮波動可以防止一些PMDD 負面情緒的發生[49]。研究人員發現給予大鼠長期人工注射孕酮突然停止注射后,也會表現出典型的焦慮樣行為[10]。同樣的結果在Wang[50]的研究結果也被發現:他們對大鼠連續4~5 d 孕酮注射,并在最后一次孕酮注射24 h 后進行防御性埋珠行為測試,結果大鼠表現出焦慮樣行為增加。這樣的結果在植入孕酮緩釋栓劑移除后也被觀察到。相反,孕酮的緩慢減少并沒有誘發類似的焦慮樣行為[51]。隨后,不同的研究人員通過埋珠測試[52]及其他如明暗穿梭箱[51,53]和高架十字迷宮[52,54]、曠場實驗[53]等焦慮行為測試都報道了PW的致焦慮作用。此外,研究人員還使用PW 模型進行FST、社交偏好測試和糖水偏好測試來研究抑郁樣行為[55-56]。結果一致表明這種激素操縱能誘發相似的焦慮、抑郁樣行為,這表明PW 造模可以達成病理效度、機制效度及表面效度。

(2) 四氫孕酮(3α,5α-tetrahydroprogesterone,THP)撤退模型

消炎痛(吲哚美辛)是一種3α-羥基類固醇氧化還原酶阻滯劑,具有防止孕酮轉化為ALLO 的作用。Li 等[57]發現服用消炎痛可以預防孕酮撤退引起的焦慮特性。同樣的,由于GABAA受體δ 亞基對THP 的調控具有高度敏感性,Smith 等[58]設計了一個敲除GABAA受體δ 亞基的小鼠模型,建立了THP 的小鼠模型,經高架十字迷宮測試發現THP 對野生型雌性小鼠有致焦慮作用,且小鼠海馬體 1(CA1)區中GABAA受體α4 亞基的表達增加,但δ亞基敲除鼠并未產生焦慮樣表型。這說明ALLO 可通過調節GABAA受體產生焦慮樣行為表型。這種表面效度和機制效度表明,THP 撤退可能是PMDD動物造模的方法之一。

不同造模方法對擁有自然及人工誘導穩定動情周期的動物造模誘導效度不同,模型側重也不盡相同,不同模型具有不同的優劣勢(具體見表2)。但這也為PMDD 疾病研究提供了更多的可能性,特別是中醫“辨證論治”治則中針對PMDD 的不同病證進行對癥治療提供了思路。

4 總結與展望

PMDD 作為一種嚴重的圍經期情緒障礙疾病,對于女性患者的生活、工作及人際交往等多方面造成了巨大的影響。目前對于該疾病的深層病理機制并不完全清楚,借助動物模型可以更好地幫助我們臨床轉化以研究其病理機制。雖然目前尚未開發出一種能完整模擬人類PMDD 女性患者表型、達到完整造模效度的動物模型,但已有許多研究證實動物模型有助于研究PMDD 在內的精神疾病。所以研究者研究中有必要綜合考慮其復雜病因及不同亞型從而選用最合適的造模方法,同時根據基礎及臨床研究結果,進行不斷完善從而建立更能模擬人類女性PMDD 病癥的動物模型。我們之前的研究內容中關于PMDD 的造模方法在RIT[59]和FST[45]范式做了改良與優化,能更好地模擬嚙齒類動物動情周期依賴性的疾病特征,這可能為PMDD研究動物造模提供一些參考。

PMDD 的病因涉及眾多內部和外部因素,并且目前研究表明其神經生物學機制錯綜復雜。梳理相關文獻證據,我們認為女性PMDD 發病的直接原因是生理時期性甾體激素及其代謝產物波動,繼而影響相應受體的敏感性及表達量發生改變,導致中樞神經系統內該類受體的作用遞質如 GABA 、5-HT等神經遞質的異常,引發多腦區以及相關神經環路的功能紊亂最終導致相應精神行為癥狀。在我們之前的研究中也證實了在PMDD 大鼠模型中GABAA受體的α4 亞基表達量明顯增多[45]。因此,后續關于PMDD 機制探索工作中,可以更多關注特定生理時期因性甾體激素、代謝產物發生波動變化引發的受體及神經遞質的功能改變,以及分析HPA軸激素的改變是如何誘導GABAA受體亞基組成、GABA 能和谷氨酸能系統及5-HT 能系統功能發生改變,另外深入探究分子信號通路或特定腦區神經元活性改變也能為闡釋 PMDD 深層病理機制以及開發新的治療方法提供更廣的思路。

此外,GABAA受體對于ALLO 等神經類固醇的高敏感性以及其特殊的藥理性質,說明了GABAA受體與PMDD 病理機制可能密切相關,未來使用特定GABA 亞基(如α4、δ 亞基等)轉基因敲除鼠進行造模及實驗研究或許對病理機制闡明有重要幫助。另外,獼猴等非人靈長類動物與人類同屬靈長類動物,其基因與人類有高度相似,有較為一致的遺傳學特性,并且其身體結構與人類相似,面部皮膚裸露,易于觀察其面部表情變化。這些特征在PMDD表型中觀察情緒反應及疼痛部位方面占巨大優勢,或許未來應PMDD 疾病深入研究的需求,靈長類動物模型會是新的研究發展對象。未來繼續拓展動物病理模型及優化造模方法對于病理研究是必要的,相信未來我們能夠找到研究PMDD 更好的方案,為PMDD 的針對性治療和藥物的開發帶來希望。