G試驗(yàn)影響因素分析

方文東 王友亮 陳水平

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)307臨床學(xué)院檢驗(yàn)科，北京 100071；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京 100071；3. 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100071）

侵襲性真菌病（invasive fungal disease，IFD）是免疫抑制和危重患者發(fā)病和死亡的主要原因[1]，早診斷、早治療對(duì)于降低患者死亡率和改善患者預(yù)后至關(guān)重要。然而，IFD患者的臨床癥狀、體征和影像學(xué)檢查結(jié)果特異性不高，臨床診斷IFD較困難。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)和直接鏡檢等方法也不適用于早期診斷IFD[2]。近年來，G試驗(yàn)，即1，3-beta-D-葡聚糖（1，3-beta-Dglucan，BDG）檢測(cè)，被廣泛應(yīng)用于臨床，但G試驗(yàn)影響因素較多，較易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，尤其是假陽(yáng)性結(jié)果，給臨床診斷和治療IFD帶來了很大困擾。本文對(duì)G試驗(yàn)的影響因素進(jìn)行綜述，擬闡述G試驗(yàn)在臨床應(yīng)用中應(yīng)注意的一些重點(diǎn)問題，以提高G試驗(yàn)的診斷效能。

1 G試驗(yàn)的臨床應(yīng)用

BDG廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中，由葡萄糖單體通過β-1-3糖苷鍵連接而成。當(dāng)真菌侵入體內(nèi)，或在某些器官定植時(shí)，BDG可被釋放至血液、肺泡灌洗液、腦脊液中。G試驗(yàn)的靶標(biāo)為BDG，檢測(cè)方法主要有化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、濁度法和比色法。由于G試驗(yàn)具有較高的診斷敏感性、特異性和陰性預(yù)測(cè)值，歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組、美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組于2008年首次將G試驗(yàn)納入微生物學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。需要注意的是，G試驗(yàn)雖然可用于檢測(cè)真菌，但不能識(shí)別真菌的種屬。

目前，G試驗(yàn)主要用于血清、肺泡灌洗液和腦脊液等樣本中真菌的檢測(cè)，其中血清是最早被使用的臨床樣本，具有較高的診斷敏感性和特異性，且連續(xù)2次陽(yáng)性可以顯著增加其特異性[4]。肺泡灌洗液樣本更多被用于肺部原發(fā)性和繼發(fā)性真菌感染的檢測(cè)，尤其是念珠菌肺炎和肺孢子菌肺炎，G試驗(yàn)診斷肺孢子菌肺炎的敏感性高達(dá)100%[5]。腦脊液樣本可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌腦膜炎的診斷，其敏感性和特異性分別為89%和85%[6]。

2 G試驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果的影響因素

一項(xiàng)涉及2 979例患者的薈萃分析結(jié)果顯示，G試驗(yàn)的診斷敏感性為76.8%，特異性為85.3%，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積為0.89，顯示出較好的診斷準(zhǔn)確性和臨床應(yīng)用價(jià)值[7]。然而，G試驗(yàn)的假陽(yáng)性問題常常困擾著臨床。導(dǎo)致G試驗(yàn)假陽(yáng)性的原因可分為醫(yī)源性污染、細(xì)菌感染、腸道黏膜受損和其他。

2.1 醫(yī)源性污染

環(huán)境和醫(yī)療相關(guān)的BDG污染可導(dǎo)致G試驗(yàn)的假陽(yáng)性，包括靜脈給藥、使用外科材料和纖維素透析膜；當(dāng)污染條件消失時(shí)，BDG水平會(huì)迅速下降，表現(xiàn)為一過性特征[8]。

2.1.1 抗菌藥物

靜脈輸注抗菌藥物可導(dǎo)致G試驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性。有研究對(duì)30種抗菌藥物和5種抗真菌藥物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中20種抗菌藥物和5種抗真菌藥物中有不同含量的BDG[9]。值得注意的是，部分抗菌藥物中的BDG經(jīng)靜脈輸注入血液后，會(huì)被血液稀釋，導(dǎo)致G試驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)可使G試驗(yàn)呈現(xiàn)假陽(yáng)性的抗菌藥物有阿莫西林-克拉維酸[11]和頭孢吡肟[12]，而哌拉西林-他唑巴坦和氨芐西林-舒巴坦不會(huì)使血清BDG水平升高[13]；藥物中的BDG含量和患者實(shí)際攝入劑量等因素可能與G試驗(yàn)的假陽(yáng)性有關(guān)[10]。

2.1.2 真菌來源制劑

某些真菌來源的多糖類制劑（香菇多糖、裂褶菌多糖、黃芪多糖、雙黃連生脈注射液和西索呋喃等）的主要成分是BDG。人體試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)患者服用香菇多糖和裂褶菌多糖后，其血漿中可檢測(cè)到高濃度的BDG，尤其是香菇多糖，最后1次給藥3年后仍然可以檢測(cè)到BDG[14]。Nortase是一種真菌來源的消化酶，是治療胰腺功能不全的首選藥物，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)不同批次的Nortase均含有高濃度的BDG，中位濃度高達(dá)1 034.8 ρg/mL[15]。因此，在進(jìn)行G試驗(yàn)前，應(yīng)全面了解患者病史和用藥史。

2.1.3 濾器的使用

血液制品在制備過程中會(huì)使用纖維素濾器和檸檬酸，而纖維素濾器和檸檬酸在生產(chǎn)過程中會(huì)被真菌BDG污染。所以，人白蛋白、免疫球蛋白、新鮮冰凍血漿等血液制品也可導(dǎo)致BDG水平假性升高[16]。BOUGNOUX等[17]檢測(cè)了32份免疫球蛋白樣本（28份靜脈用免疫球蛋白、4份皮下用免疫球蛋白），BDG的檢出率為100%，濃度均>523 ρg/mL；在18例接受免疫球蛋白替代治療的患者中，輸注前70%的血清樣本為陽(yáng)性，且濃度較低（89～243 pg/mL），而輸注后100%的血清樣本為陽(yáng)性，且濃度均>523 pg/mL。因此，在使用上述血液制品時(shí)，不建議采用G試驗(yàn)診斷真菌感染。一般來說，免疫球蛋白治療停止超過3周，可排除其引起的G試驗(yàn)假陽(yáng)性[18]。

使用纖維素膜的透析患者，其血液中的BDG水平會(huì)顯著升高；而使用三乙酸纖維素膜和聚甲丙烯酸甲酯膜透析，對(duì)BDG水平則沒有影響[19]。聚砜透析膜在體外可有效過濾BDG。1項(xiàng)納入32例血液透析/血液透析濾過患者、持續(xù)性非臥床腹膜透析患者和非腎臟替代治療的慢性腎病患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，僅2例BDG陽(yáng)性；12例血液透析/血液透析濾過患者的72份血清樣本中，僅1份為假陽(yáng)性[20]。污染單克隆抗體的BDG也源于清除細(xì)胞碎片的纖維素膜濾器，但使用其他類型的濾器后，幾乎檢測(cè)不到BDG[21]。

2.1.4 外科材料

醫(yī)用敷料、手術(shù)中使用的紗布和海綿等材料中常含有BDG，患者使用后會(huì)出現(xiàn)一過性的陽(yáng)性結(jié)果。有研究檢測(cè)了6種不同醫(yī)用紗布（JP型吸水紗布、棉制非織造外科紗布、纖維非織造外科紗布、X射線可探測(cè)的預(yù)洗紗布、X射線可探測(cè)的免洗紗布、X射線可探測(cè)的Ⅶ型紗布）中的BDG水平，發(fā)現(xiàn)纖維非織造外科紗布中的BDG水平很低，而其他類型紗布均含有較高水平的BDG[22]。臨床實(shí)踐也發(fā)現(xiàn)，接受腹腔鏡或開腹手術(shù)的患者，在手術(shù)過程中和手術(shù)結(jié)束當(dāng)天，血清BDG水平均會(huì)升高，可能與手術(shù)中使用的外科材料有關(guān)[23]。對(duì)于燒傷患者，當(dāng)紗布覆蓋面積≥20%時(shí)，G試驗(yàn)的假陽(yáng)性比例可高達(dá)77%；當(dāng)紗布覆蓋面積<20%時(shí)，假陽(yáng)性比例只有20%[24]。提示G試驗(yàn)的假陽(yáng)性率可能與紗布的使用量有關(guān)。

2.2 細(xì)菌感染

某些細(xì)菌在繁殖過程中可產(chǎn)生BDG或BDG類似物，如糞產(chǎn)堿桿菌和肺炎鏈球菌[25]；以前認(rèn)為銅綠假單胞菌可產(chǎn)生BDG類似物[26]，但KOYA等[27]發(fā)現(xiàn)其也可產(chǎn)生BDG。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，12.8%（6/47）的銅綠假單胞菌感染所致菌血癥患者會(huì)出現(xiàn)BDG陽(yáng)性反應(yīng)。ALBERT等[28]發(fā)現(xiàn)，菌血癥與G試驗(yàn)的假陽(yáng)性率高度相關(guān)，且革蘭陰性菌相關(guān)菌血癥導(dǎo)致的G試驗(yàn)假陽(yáng)性率（59%）高于革蘭陽(yáng)性菌（18%）；按菌種進(jìn)行分層分析，大腸埃希菌和銅綠假單胞菌導(dǎo)致的G試驗(yàn)假陽(yáng)性率分別為61%和57%，金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的G試驗(yàn)假陽(yáng)性率為38%。另外，諾卡菌感染也可導(dǎo)致G試驗(yàn)假陽(yáng)性[29]。

2.3 腸道黏膜受損和其他

腸道具有十分強(qiáng)大的屏障功能，如果腸道黏膜受損，腸道內(nèi)的細(xì)菌/真菌或產(chǎn)生的BDG會(huì)被釋放至血液中，血清BDG是腸道通透性增強(qiáng)的重要標(biāo)志物[30]。由此可見，腸道黏膜受損易導(dǎo)致G試驗(yàn)的假陽(yáng)性。有研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡腎炎小鼠模型的腸道嚴(yán)重受損，這可能是86%的狼瘡腎炎患者BDG呈陽(yáng)性的原因[31]。腸道受損越嚴(yán)重，血清BDG水平越高，G試驗(yàn)假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)也越大。因此，當(dāng)患者被診斷為腸道炎癥性疾病時(shí)，應(yīng)考慮G試驗(yàn)的假陽(yáng)性問題，并結(jié)合細(xì)菌/真菌培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)、測(cè)序等其他方法進(jìn)行診斷。

其他可導(dǎo)致G試驗(yàn)假陽(yáng)性的因素還有食用海帶[32]和酸奶[33]等富含BDG的食物或保健品、溶血樣本[34]，以及多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、過敏等高免疫球蛋白血癥。

3 G試驗(yàn)假陰性結(jié)果的影響因素

雖然G試驗(yàn)的陰性預(yù)測(cè)值普遍高于其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，但應(yīng)注意的是，G試驗(yàn)也存在假陰性的可能，而假陰性結(jié)果會(huì)延誤患者的治療，甚至導(dǎo)致病情惡化。

3.1 樣本的儲(chǔ)存條件

BDG在室溫條件下易降解，建議臨床樣本采集后2 h內(nèi)送檢，否則易導(dǎo)致檢測(cè)值下降，甚至出現(xiàn)假陰性。

3.2 某些抗真菌藥物的使用

阿尼芬凈、卡泊芬凈和米卡芬凈等棘白菌素類藥物可抑制BDG合成酶的活性，進(jìn)而抑制BDG的合成[35]。當(dāng)使用這些抗真菌藥物治療時(shí)，易導(dǎo)致G試驗(yàn)假陰性。因此，建議在進(jìn)行抗真菌治療前或抗真菌治療6 d后進(jìn)行G試驗(yàn)。

3.3 突破性念珠菌血癥

突破性真菌血癥指系統(tǒng)性抗真菌藥物預(yù)防或連續(xù)治療7 d以上出現(xiàn)的真菌血癥。雖然G試驗(yàn)可用于念珠菌感染的診斷，但診斷突破性念珠菌血癥的敏感性僅為56%，遠(yuǎn)低于診斷非突破性念珠菌血癥的敏感性（81%），且突破性念珠菌血癥期的中位BDG值遠(yuǎn)低于非突破性念珠菌血癥期[36]。因此，對(duì)于念珠菌血癥患者，不建議通過G試驗(yàn)監(jiān)測(cè)治療效果。

3.4 膽紅素和三酰甘油

膽紅素和三酰甘油對(duì)G試驗(yàn)有抑制作用，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)膽紅素高于72 mg/dL或三酰甘油高于466 mg/dL時(shí)，BDG可下降超過20%[37]。臨床上膽紅素的水平普遍低于72 mg/dL，因此，膽紅素在臨床實(shí)踐中不會(huì)對(duì)G試驗(yàn)產(chǎn)生顯著的抑制作用，但其對(duì)G試驗(yàn)結(jié)果的影響也應(yīng)引起重視，特別是當(dāng)BDG值高于其閾值20%以內(nèi)時(shí)。高濃度三酰甘油（>466 mg/dL）在臨床上比較常見，對(duì)于高脂樣本，臨床應(yīng)考慮G試驗(yàn)假陽(yáng)性的影響[34]。

4 總結(jié)和展望

G試驗(yàn)具有耗時(shí)短和敏感性、陰性預(yù)測(cè)值高等特點(diǎn)，可以在真菌感染的早期檢測(cè)出真菌，這是真菌培養(yǎng)、直接鏡檢等傳統(tǒng)方法難以實(shí)現(xiàn)的。隨著G試驗(yàn)在臨床的廣泛應(yīng)用，其假陽(yáng)性和假陰性問題也引起臨床的密切關(guān)注。建議臨床和科研人員關(guān)注以下幾方面：1）目前的G試驗(yàn)數(shù)據(jù)多來源于回顧性研究，可開展相應(yīng)的前瞻性研究，獲得可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)；2）對(duì)不同類型疾病人群或不同應(yīng)用場(chǎng)景，應(yīng)制定合適的閾值，以提高G試驗(yàn)的診斷效能；3）制定統(tǒng)一的含鱟材料G試驗(yàn)試劑的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；4）制定G試驗(yàn)診斷真菌感染的專家共識(shí)；5）開發(fā)不使用鱟材料的高通量G試驗(yàn)檢測(cè)試劑。此外，包括G試驗(yàn)在內(nèi)的真菌抗原檢測(cè)應(yīng)該朝著早期、高效診斷IFD的方向發(fā)展，細(xì)分不同來源樣本的不同檢測(cè)限。同時(shí)，臨床實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)生均應(yīng)熟知影響G試驗(yàn)的因素，這對(duì)提高G試驗(yàn)診斷效率至關(guān)重要。