CRISPR/Cas13系統用于病原體檢測的研究進展

趙亞楠 曹啟新 閆 彥 李曉聰 趙建平 肖偉利

（內蒙古自治區人民醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010010）

近年來，新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）、埃博拉病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒等各種病原體嚴重危脅著公共衛生安全，快速、有效的病原體檢測是預防疾病傳播的重要途徑。然而，目前常用的病原體檢測方法，如聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片、恒溫擴增和基因測序，操作復雜、設備昂貴，無法滿足基層醫療和貧困地區的需求。因此，急需開發一種靈敏度高、特異性強、快捷、簡便的新一代檢測技術。

成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/成簇規律間隔短回文重復序列相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）是細菌和古生菌中普遍存在的一段重復序列，能夠在向導RNA（single guide RNA，sgRNA）引導下將Cas蛋白與靶序列結合，并對其進行特異性切割，從而抵御外源物質的入侵[1]。近年來，CRISPR/Cas系統發展迅速，在基因調控、疾病治療、植物育種等領域有著廣闊的應用前景，其中CRISPR/Cas9系統能夠在DNA基礎上對靶序列進行高效、精準的編輯，已廣泛應用于基礎研究、臨床治療等領域[2-5]。但CRISPR/Cas9僅能對DNA進行調控，對RNA的特異性較低，且會出現脫靶效應，甚至可能會對細胞基因組造成損傷，因此在應用方面存在一定的安全隱患。而CRISPR/Cas13系統以Cas13酶特異靶向并剪切單鏈RNA，同時對周邊RNA進行“附帶切割”，基于其精準的靶向性和酶切割能力，已被開發為新一代診斷技術，具有靈敏度高、特異性強等優點，在病原微生物檢測方面具有廣闊的應用前景[6-8]。本文對基于CRISPR/Cas13系統的病原體檢測的研究進展進行綜述，為后續研究提供參考。

1 CRISPR /Cas13系統簡介

根據Cas蛋白組成和發揮作用方式的不同，可將CRISPR/Cas系統分為兩大類：一類系統可分為Ⅰ型和Ⅲ型系統，其核酸酶需要多種Cas蛋白酶集合形成復合物才能發揮作用；二類系統可分為Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統，其核酸酶只需要單一Cas蛋白即可發揮效用[9-10]。Ⅱ型（Cas9）和Ⅴ型（Cas12）主要對DNA具有靶向性，在基因編輯、腫瘤治療等方面被廣泛研究[4，11]。Cas13屬于二類Ⅵ型系統，含有2個高等真核生物和原核生物核苷酸結合域（higher eukaryote and prokaryote nucleotidebinding domain，HEPN）結構，是一種靶向剪切RNA的新型CRISPR系統酶。Cas13具有加工處理向導RNA（CRISPR RNA，crRNA）和crRNA引導下靶向剪切單鏈RNA的雙重核酸酶活性，能夠特異性識別并剪切RNA片段，同時還具備非特異性RNA核糖核苷酸酶（RNA ribonuclease，RNase） 活性，可對周邊的RNA片段進行無差別的“附帶剪切”。根據Cas蛋白功能的不同，Ⅵ型系統又可分為4種亞型，分別為Ⅵ-A、Ⅵ-B、Ⅵ-C、Ⅵ-D，其中Ⅵ-A即為Cas13a，含有Cas1和Cas2蛋白，高分辨率電鏡檢測結果顯示Cas13a具有“雙瓣葉”球狀蛋白結構，由1個crRNA識別葉和1個核酸酶葉組成[11]。Cas13a與靶序列結合，可引起構象變化，催化HEPN 1和HEPN 2結合部位位點活化，導致靶序列在結合區域的外部被切割（順式切割），同時非特異性切割周邊其他RNA（反式切割）[12]。Ⅵ-B即為Cas13b，不含Cas1和Cas2，根據Cas13b轉座子上攜帶的附屬蛋白基因型的不同，可分為Ⅵ-B1和Ⅵ-B2型[13]。Ⅵ-B1的附屬蛋白是Csx27，Ⅵ-B2的附屬蛋白是Csx28，Cas13b蛋白酶活性受Csx27/Csx28影響，Csx27表現為抑制，Csx28表現為增強[13]。Ⅵ-D即為Cas13d，由crRNA、CRISPR系統酶（Cas1、Cas2、Cas13d）和附屬蛋白WYL1組成，Cas13d的相對分子質量遠小于其他3種核酸酶，可以僅依靠Cas13d上最小序列，即二級結構靶向RNA，附屬蛋白WYL1可以正向誘導酶切活性，由于Cas13d具有較強的靶向切割能力和酶切活性，被廣泛應用于基礎研究中[14]。目前關于Cas13c的報道較少。

2 CRISPR /Cas13系統在病原體檢測中的研究進展

2.1 在病毒檢測中的研究進展

EAST-SELETSKY等[15]在CRISPR/Cas13a系統中加入結合有熒光基團和淬滅基團的RNA熒光報告分子，在其被切割前淬滅基團發揮作用，使RNA熒光報告分子不發射熒光；當Cas13a被靶序列激活時，“附帶切割”RNA熒光報告分子，致使RNA鏈斷裂，熒光基團被激活，并釋放熒光信號，通過收集熒光信號即可進行特定核酸檢測，但該方法的靈敏度較低，只達到pmol/L級，尚不能滿足臨床檢測需求。2017年，GOOTENBERG等[16]在先前研究的基礎上，結合重組聚合酶（recombinase polymerase amplification，RPA）擴增技術和T7核糖核酸聚合酶轉錄技術，發明了特異性高靈敏度酶報告解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）技術，并成功檢測出寨卡病毒和登革熱病毒的特定毒株。2018年，GOOTENBERG等[17]又根據CRISPR酶學的特點進一步優化了SHERLOCK技術，第2代SHERLOCK技術與CRISPR相關蛋白Csm6結合，將靈敏度從pmol級提升至amol級；針對不同的Cas蛋白所結合的crRNA具有特異性，可以進行不同病原體的Cas13多通路檢測；結合側向層析試紙條技術，可在短時間內呈現結果，采用凍干技術可制備成易于攜帶的即時檢測（point-of-care testing，POCT）試劑。MYHRVOLD等[18]研發出HUDSON技術，用于病毒核酸的保護和釋放，該技術的原理為：利用加熱和化學還原方法，可同時裂解病毒顆粒，并滅活體液中的高水平核糖核酸酶，免去核酸提取的步驟。將HUDSON和SHERLOCK結合，可直接檢測體液中的病毒DNA/RNA，無需特殊設備，1～2 h即可出結果，大大提高了POCT的效能。有研究結果顯示，基于SHERLOCK技術可檢出EB病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、禽流感病毒、非洲豬瘟病毒等[19-23]，靈敏度高，特異性強，與其他病原體無交叉反應。郭悅等[24]將CRISPR/Cas13檢測與重組酶介導的擴增技術（recombinase aided amplification，RAA）結合，39 ℃條件下40～52 min可檢出8種輸入性傳染病病原體，靈敏度可以達到1～10拷貝/μL，臨床樣本中的病原體被全部檢出。目前，實時熒光定量PCR技術是檢測SARSCoV-2的金標準，廣泛應用大規模篩查，檢測限低至1拷貝/μL，但最新病毒動力學模型表明，相對于靈敏度而言，高頻率檢測和快速診斷才是減少病毒傳播的關鍵[25]。FOZOUNI等[26]將CRISPR/Cas13a與手機顯微鏡結合，進行SARSCoV-2檢測，無需預擴增即可直接檢測鼻拭子中的RNA，通過手機攝像頭讀取熒光信號，靈敏度達到100拷貝/μL，且能在5 min內提供準確結果。在大規模篩查中，基于CRISPR/Cas13a系統的SARS-CoV-2檢測在時效、成本、便攜上有著巨大的優勢。

2.2 在細菌檢測中的研究進展

傳統病原菌檢測技術通常包括微生物分離培養與鑒定、免疫學檢測和基于核酸檢測的分子生物學診斷技術，分離培養與鑒定周期長，無法滿足臨床快速檢測病原菌的需求，而免疫學和分子生物學診斷技術對儀器、人員要求較高，操作較復雜，所需成本高，無法滿足基層醫院的需要。2017年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）發布了適用于發展中國家病原體檢測方法的標準，要求具有經濟、高靈敏度、高特異性、操作簡單、快速穩定和易儲運的特點[27]。因此，迫切需要開發一種靈敏、特異、快速、便捷的新型病原菌檢測平臺。JIANG等[28]將PCR與CRISPR/Cas13結合，用于檢測沙門菌，顯示出優異的敏感性，2 h內可以檢出至少10個沙門菌基因組DNA（1 amol/L或10 CFU/mL），特異性良好，與其他常見的食源性細菌沒有交叉反應。該方法能夠靈敏且準確地檢測沙門菌，為食品中食源性病原體的檢測提供了一種新的策略，突破了傳統方法耗時且高度依賴巨大人力和物力資源的局限。JIANG等[28]還利用CRISPR/Cas13系統檢測B族鏈球菌（group BStreptococcus，GBS），與基于培養和PCR的檢測方法相比，這種新型GBS檢測方法顯示出優異的診斷性能，敏感性和特異性被大大提高，有望成為GBS快速篩查的新型POCT方法。AI等[29]利用SHERLOCK技術成功檢測出結核分枝桿菌，與GeneXpert法具有相同的敏感性。黃明耀等[30]利用CRISPR/Cas13a技術在2 h內快速檢測布魯菌，敏感性和特異性均為100%，檢測下限接近10 fg/μL，成功解決了臨床布魯菌檢測周期長、患者無法得到及時救治的難題。蘇璇等[31]利用CRISPR/Cas13a輔助RAA技術檢測食品中的金黃色葡萄球菌，其靈敏度為101CFU/mL，遠高于實時熒光定量PCR（102CFU/mL），且檢測時間僅需30 min，大大提高了對食源性疾病暴發的應急檢測能力，為金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病早期診斷提供了有力的支持。

2.3 在真菌檢測中的研究進展

近年來，隨著免疫抑制劑、侵入性診療的廣泛應用，真菌感染率逐年上升，已成為醫院感染的主要病原體之一。傳統真菌分離培養方法檢測周期長，患者預后不良風險較高，因此快速、準確的檢測技術對臨床真菌感染診斷有著重要的意義。LI等[8]利用SHERLOCK檢測平臺建立了煙曲霉菌的鑒定方法，結果顯示，CRISPR/Cas13a技術能快速鑒定出煙曲霉菌，其敏感性和特異性與熒光定量PCR一致。宏基因組測序敏感性較高，但該技術對操作者的要求較高，并且需要使用GenBank數據庫進行核酸序列比對，使該方法局限于實驗室診斷而不能在臨床中廣泛使用，尤其是在缺乏實驗室診斷條件的地區。因此，基于CRISPR/Cas13a系統的檢測技術可用于初步篩查，為臨床快速確定曲霉菌感染提供依據。這為未來開發基于CRISPR/Cas13a系統的新型真菌感染檢測方法奠定了基礎。

2.4 在寄生蟲檢測中的研究進展

寄生蟲實驗室檢測主要以病原學檢查、免疫學檢測和分子生物學檢測為主。對于病原學檢查而言，影響因素較多，寄生蟲感染階段、寄生部位和樣本采集的方法、操作、部位不同均容易導致漏診，而且對檢測人員要求較高，需要有豐富的知識和經驗。相較于傳統的病原學檢查，免疫學檢測和分子生物學檢測有更高的敏感性和特異性，且操作相對簡便、易行，結果客觀、準確，重復性好，結合病原學檢查結果，可以極大地提高寄生蟲的檢測效率[32]。隨著CRISPR/Cas13系統在病毒、細菌等病原體檢測中的廣泛應用，目前該系統也逐步應用于寄生蟲檢測。余復昌[33]建立了基于RPA反應和CRISPR/Cas13a系統的檢測微小隱孢子蟲的“一管法”快速檢測方法，具有高效、特異、穩定的特性，在資源相對匱乏的偏遠地區具有廣闊的應用前景。LEE等[34]采用SHERLOCK檢測平臺對惡性瘧原蟲（即鐮刀瘧原蟲）進行檢測，可同時鑒別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲；該方法優化了核酸提取過程，能夠在60 min內檢測出每毫升血液中的2個瘧原蟲，符合WHO建議的檢測靈敏度。

3 總結與展望

CRISPR/Cas13系統目前已被開發為一種新型的分子診斷工具，為病原體的檢測打開了新思路。該系統具有高靈敏度、高特異性、快速、便捷、成本低的特點，可以實現快速POCT，在病原體檢測領域有著廣闊的應用前景。與基于PCR的傳統分子診斷技術相比，基于CRISPR/Cas13系統的核酸檢測技術具有高靈敏度和單堿基錯配特異性高的特點，如SHERLOCK技術可以將靈敏度提高到amol/L級別，無需精密的儀器設備、昂貴的試劑和專業人員；SHERLOCK試紙條可以大批量生產，室溫儲存，保質期長，可在基層醫療機構和偏遠地區實現病原體的快速篩查；借助生物傳感器實現可視化信號讀取，大大降低了檢測成本，能夠實現快速定量檢測和多重檢測。ACKERMAN等[35]開發了一種用于可擴展的多路復用病原體檢測平臺，即核酸多重評估的組合陣列反應（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids，CARMEN），將CARMEN和Cas13檢測（CARMEN-Cas13）結合，可在單個陣列上對4 500多個靶crRNA對進行測試，能夠區分SARSCoV-2等169種可感染人類的病毒，并可對甲型流感病毒株進行全面的亞型分析，完成數十種人類免疫缺陷病毒耐藥突變株鑒定。

然而，目前基于CRISPR/Cas13系統的病原體的診斷技術仍面臨許多挑戰。為了提高檢測靈敏度，許多基于CRISPR/Cas13系統的核酸檢測技術均加入了RPA擴增技術，該技術容易引起非特異性擴增，造成假陽性或假陰性的結果，可能需要通過NGS等較為成熟的技術驗證結果的準確性。多種引物的加入會使CRISPR/Cas13生物傳感器體系的建立和檢測過程復雜化，限制檢測速度，為實現POCT增加難度。優選Cas13蛋白、設計crRNA引物是建立高效CRISPR/Cas13生物傳感器的基礎和難點，仍需進一步研究。大多數基于 CRISPR/Cas13系統的檢測平臺只能實現對單一病原體的定性檢測，難以實現定量檢測與高通量檢測。因此，未來還需要對基于CRISPR/Cas13系統的病原體檢測技術進一步優化，構建快速定量檢測和高通量檢測平臺是未來研究的重點。