不明原因散發性全面發育遲緩兒童遺傳因素預測表的制訂及臨床應用*

張峰，周笑涵，黃金容，羅瓊，龔強

（1.贛州市婦幼保健院 兒童神經康復科，江西 贛州 341000；2.長沙金域醫學檢驗實驗室有限公司，湖南 長沙 410006）

全面發育遲緩（global developmental delay, GDD）指年齡＜ 5 歲，存在≥ 2 個能區沒有達到預期發育標志，且無法接受系統性智力功能評估的兒童[1]。GDD 的病因診斷流程較為復雜，多數與遺傳因素有關。盡管多數研究指出，在沒有明確病因診斷線索時，拷貝數變異（copy number variation, CNV）檢測可以作為GDD 的一線病因學診斷方法[2-3]，但GDD 兒童臨床癥狀復雜多樣且有遺傳異質性，臨床醫師在分析其遺傳病因時多依靠臨床經驗，主觀性較強，目前尚無簡單易行的方法對其遺傳學病因的概率進行快速判斷，沒有統一的量化標準[4]。本研究旨在通過分析GDD 患兒的遺傳學臨床特征，制訂不明原因GDD 患兒遺傳因素風險預測表，以量化分值的方式幫助臨床醫師，尤其是非神經遺傳專科醫師，快速篩選出需要進一步進行遺傳學檢測的患兒，縮短病因學診斷流程，避免重復檢查或漏診。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2019 年6 月—2022 年6 月在贛州市婦幼保健院兒童神經康復科就診的散發性不明原因GDD患兒396 例。依據基因測序結果將檢測結果陽性的患兒歸為陽性組（130 例），檢測結果陰性的患兒歸為陰性組（266 例）。陽性組男性84 例，女性46 例；中位數月齡18（8，50）個月。陰性組男性191 例，女性75 例；中位數月齡22（9，49）個月。兩組患兒性別、月齡比較，差異均無統計學意義（P＜0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理審查委員會批準，患兒家屬簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ①符合GDD 診斷標準[1]；②依據《兒童智力障礙或全面發育遲緩病因診斷策略專家共識》[1]常規非遺傳學檢查仍無法明確病因學診斷的GDD 患兒；③依據《兒童智力障礙或全面發育遲緩病因診斷策略專家共識》[1]中診斷程序進行遺傳學檢測。

1.2.2 排除標準 ①依據上述專家共識，經家族史、體格檢查、臨床非遺傳學輔助檢查即可明確病因學診斷的患兒；②孕期及圍生期病史不明，或兒童遺傳背景不清晰的患兒；③患兒正在接受基因治療或其他因素導致遺傳物質改變的因素；④既往已經在產前診斷篩查或常規核型分析中明確診斷的患兒。

1.3 方法

1.3.1 不明原因GDD 患兒遺傳因素風險預測表的編制方法 查閱不明原因發育遲緩病因學研究相關文獻[5-7]，結合臨床專家意見初步將25 項GDD 患兒可能存在的臨床特征作為相關因素納入量表條目池[8]。依據經典測量理論（classical test theory,CTT）區分度分析法及逐步回歸法進行量表條目篩選[9]。將患兒的基因檢測結果作為因變量，再將收集的25 項臨床特征作為自變量，先對比各項條目在陽性組和陰性組間的差異，結合文獻分析及專家經驗，確定本量表的入選條目。將其中差異有統計學意義的條目納入Logistic 回歸模型，進一步分析各條目預測陽性基因結果的能力，據此對各項條目進行賦分，制作不明原因GDD 患兒遺傳因素風險預測表。遺傳因素風險預測表用于對所有入選患兒進行復測，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線分析本量表預測患兒基因診斷的能力，并計算最佳截斷值[10]，同時得出對應的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值，評估本量表應用于臨床GDD 診斷流程的實用價值。

1.3.2 基因測序方法 采集患者及其父母外周血各3 mL 置于抗凝管。使用血液基因組柱式中量提取試劑盒（中國康為世紀生物科技股份有限公司）提取基因組DNA，用Qubit 2.0 型熒光計、0.8%瓊脂糖凝膠電泳對DNA 樣本進行質檢。使用xGen?Exome Research Panel v1.0 捕獲探針（美國IDT 公司，）與基因組DNA 文庫序列進行液體雜交，將目標區域DNA 片段進行富集，構建全外顯子文庫。二代測序在NovaSeq 6000 測序儀（美國Illumina 公司）上進行高通量測序，目標序列測序覆蓋度≥ 99%。CNV-seq 分析使用患者2 mL 外周血標本，經基因組片段化、末端補平修復、3'-端腺苷化和加多聚A 接頭后，經4～6 輪連接介導聚合酶鏈反應擴增，建立全基因組文庫。高通量測序在NovaSeq 6000 測序儀上完成，使用BWA 軟件包，將測序序列與Ensemble參考基因組GRCh37/hg19 進行比對。變異致病性使用美國醫學遺傳學臨床實踐指南分級[11]，最后由臨床醫師確認報告結果。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，比較用秩和檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用Fisher 確切概率法；影響因素的分析用多因素逐步Logistic 回歸模型；繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒臨床特征分析及量表條目篩選

陽性組與陰性組患兒父親高齡生育、MRI 提示結構畸形、癲癇、毛發異常、頭圍異常、顱骨外觀異常、皮膚異常、眼外觀異常或畸形、鼻梁外觀異?；蚧巍⒍位蚨划惓?、下頜畸形、牙齒異常、出生低張力、非智力因素合并癥比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。兩組患兒母親高齡生育、父母不良生活史、不明原因流產史、輔助生殖、早產、孕期及圍生期異常史、孤獨癥譜系障礙、口腔或腭弓畸形、生殖器外觀異常、肢體畸形、器官畸形比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。經文獻檢索提示肢體畸形、器官畸形高度提示遺傳性病因[12]，結合專家經驗，仍將其保留。最終將父母不良生活史、不明原因流產史、輔助生殖、早產、孕期及圍生期異常史、孤獨癥譜系障礙6 項條目從量表中剔除。將剩余的19 個項目確定為最終量表條目。見表1。

2.2 量表條目整理

以基因檢測結果為因變量（陽性組= 1，陰性組=2），以假設檢驗中差異有統計學意義（以P＜0.20）的指標即父親高齡生育、父母不良生活史、不明原因流產史、MRI 提示腦結構畸形、毛發異常、頭圍異常（頭圍無異常= 0，頭圍偏小= 1，頭圍偏大= 2）、顱骨外觀異常、皮膚異常、眼外觀異常或畸形、鼻梁外觀異常或畸形、耳廓畸形或耳位異常、下頜畸形、口腔或腭弓畸形、生殖器外觀異常、出生低張力、非智力因素合并癥、器官畸形為自變量（除頭圍外各自變量無異常賦值為0，有異常賦值為1），進行多因素逐步Logistics 回歸分析（引入水準是0.05，剔除水準是0.10），結果顯示：鼻梁外觀異?；蚧蝃=5.272（95% CI：1.007，27.607）]、耳廓畸形或耳位異常[=6.987（95% CI：1.555，31.383] 及非智力因素合并癥[=3.826（95% CI：1.884，7.771] 均為GDD 患兒遺傳學檢測陽性預測因素（P＜0.05）。見表2。

表2 不明原因GDD患兒遺傳風險預測因素的多因素逐步Logistic回歸分析參數

依據以上統計學分析，結合相關文獻及專家經驗，筆者將最終保留的條目合并整理為5 大類條目（雙親因素、異常面容、器官畸形、非智力因素合并癥、異常頭顱MRI 改變）作為最終量表條目。依據GDD 基因測序指南[13]，將陽性家族史、既往產前診斷遺傳學篩查陽性、具有典型的面容及臨床癥狀作為獨立危險因素。依據Logistics 回歸分析，將鼻梁及鼻翼畸形（包括鼻梁扁平）、耳廓畸形或耳位異常、非智力因素合并癥3 項差異有統計學意義的項目賦值2 分，鑒于鼻梁畸形與耳廓畸形的高權重值，將單獨列出，各賦值2 分。文獻報道，不明原因GDD兒童神經發育障礙或腦結構畸形MRI 改變高度提示遺傳性病因，因此賦值2 分[14-15]。除鼻梁與耳廓畸形的其他外觀異常，每項賦值1 分，最高2 分。不明原因GDD 患兒遺傳因素風險預測表的最終版本見表3。

表3 不明原因GDD患兒遺傳因素風險預測表

2.3 不明原因GDD患兒遺傳因素風險預測表最佳截斷值

對396 例PDD 患兒信息使用本量表進行復測，以基因檢測結果為因變量（陰性組= 2，陽性組= 1），以患兒量表分數為自變量，繪制ROC 曲線，分析本量表預測患兒基因診斷的效能，并計算最佳截斷值，結果顯示曲線下面積（area under curve, AUC）為0.707（95% CI：0.649，0.765）。見圖1。

圖1 遺傳因素風險預測表預測PDD患兒的ROC曲線

計算約登指數后得出最佳截斷值為2.5 分，但由于量表實際賦值均為整數，可認為最佳截斷值為3 分，其所對應的敏感性為60.8%（95% CI：0.518，0.691），特異性為75.6%（95% CI：0.699，0.805）。其他最佳截斷值對應的各項統計值見表4。

表4 不同最佳截斷值及量表分數對應的統計值

3 討論

GDD 為暫時性診斷，在年齡＞ 5 歲時，如達到智力低下診斷標準應該修正診斷。一些輕度發育遲緩的兒童通過適當的支持性措施，5 歲前可能進步至正常功能范圍而不再符合智力障礙的診斷標準[16]。對GDD 兒童進行準確的病因學診斷是臨床進行有效康復治療的前提，能最大限度地減輕患兒功能障礙程度，改善預后[6,17]。由于GDD 兒童病因的多樣性，診斷流程較為復雜，臨床醫師在診斷過程中常常在時間成本和經濟成本的選擇中難以抉擇[6]。文獻報道，GDD 兒童遺傳因素病因占30%～50%[18]。在決定是否需要進行遺傳學檢測時，家長通常希望醫師能針對孩子檢測結果陽性率給出準確的估值。本研究通過簡單的量表評分就能直觀地提供量化數據，同時整合了遺傳病因GDD 患兒的臨床特征，以方便臨床醫師辨識，并明確各項特征的權重，為臨床醫師對患兒是否需要進行遺傳學檢測提供決策參考，從而縮短GDD 兒童的診斷時間，也能幫助家長理解患兒病情，提高診療依從性。

當患兒得分為1 分時，此時陽性預測值為0.330，即患兒只有33%的概率基因檢測結果為陽性；當患兒得分為3 分時，患兒為真陽性的可能性為54.8%；而當患兒得分為9 分和＞ 14 分時，患兒為真陽性的概率分別達到75%和100%。

有研究報道，通過CMA 和WES 對GDD 兒童進行病因學診斷的陽性率為60.7%，ID 合并運動障礙的陽性診斷率可達100%[19]，目前多個GDD 診療指南的病因診斷流程均推薦CMA 作為一線檢測手段[1，15，20]，如仍無法明確診斷再選擇二代測序的相關檢測方法。但各項指南均推薦在臨床特征具有特異指向性的情況下，如陽性家族史、既往產前診斷遺傳學篩查陽性、具有典型的面容及臨床癥狀，應針對其進行特異性遺傳學檢測。因本量表的制訂主要是為了解決無臨床線索GDD 患兒的遺傳學風險預測，故此將以上因素視為獨立危險因素，推薦直接對其進行相對應的遺傳學檢測，而并未進行風險測序評分。

本研究在進行各項臨床特征統計時，多因素逐步Logistic 回歸分析提示只有鼻梁及鼻翼畸形（包括鼻梁扁平）、耳廓畸形或耳位異常、非智力因素合并癥3 項有統計學意義，雖然鼻梁畸形與耳廓畸形同屬器官畸形，鑒于其高權重值，將其單獨列出。母親高齡生育在初始統計學分析時差異無統計學意義，但回顧樣本數據發現，高齡母親與高齡父親的伴隨關系呈高度一致性，與文獻報道一致[21]。因此，本研究將父母高齡均作為危險因素納入統計范疇。不明原因流產史雖然有統計學意義，但只發生在陰性組，屬于陰性指標，因此并未納入預測指標。父母不良生活史、輔助生殖、早產、孕期及圍生期異常史的影響因素眾多，難以用單一遺傳因素進行解釋。依據現有研究證據，孤獨癥譜系障礙的病因系多基因病的可能性大，且與環境因素有關。加之以上因素在兩組間比較差異均無統計學意義，因此將以上因素排除，不作為遺傳風險因素的預測指標。最終，本研究選定了5 項指標作為GDD 遺傳風險預測的最終量表條目，分別是雙親因素、異常面容、器官畸形、非智力因素合并癥及異常頭顱MRI 改變。

目前涉及GDD 的已知遺傳綜合征有300 多種，盡管遺傳學測序技術有了明顯的提升，但仍有多種疾病涉及多基因及其他環境因素而無法明確具體病因[22]。de VRIES 等[23]試圖通過量表篩查的方法來幫助臨床醫師識別脆性X 綜合征，該量表將家族史、皮膚、耳朵、面容、關節、睪丸及人格癥狀7 項指標進行評分，得分越高脆性X 綜合征的可能性越大。該篩查量表的使用使得脆性X 的識別更為簡單，準確率也更高[23]。本研究涉及的量表涵蓋了該量表的內容，依據其評分標準進行遺傳學風險預測評分，除外家族史獨立危險因素，具備所有脆性X 綜合征特征的患者得分在8 分，提示具有95%的遺傳學病因風險，兩者均具有預測其遺傳學病因風險的價值，結論一致。de VRIES 等[24]在后期又制作了一份亞端粒重排患者檢視表，該量表將智能落后家族史、宮內發育遲緩、生后發育遲緩、頭圍、矮身材、面部畸形及其他臟器畸形作為評分指標，評分最佳截斷值為6 分；該量表同樣可以提高疾病的臨床識別率及準確率。在除外獨立危險因素族史的情況下，依據該量表評分指標進行不明原因全面發育落后遺傳風險量表評分，亞端粒重排患者得分為10 分，提示具有97.7%的遺傳學病因風險，兩者結論一致。但與本研究量表相似，de VRIES 等[23-24]設計的2 個量表也存在隨分值增加特異性升高，但敏感性下降的問題。

作為一項風險提示作用的量表，本量表仍然存在許多不足[25]。由于本研究涉及的樣本是在排查非遺傳性病因后仍無法明確病因的GDD 兒童樣本。因此，本研究提供的遺傳因素風險預測量表并不能作為獨立遺傳學檢測參考依據，無法替代醫師的臨床判斷。盡管國內學者認為遺傳性因素占多數，但對于遺傳學風險均基于臨床經驗總結，尚無量化指標[26-27]。在臨床上仍然無法通過快速量表化篩查出病因學結論[28]，本研究對GDD 兒童病因學篩查提供了一種新思路，具有一定創新性。

盡管本研究提供的量表AUC 為0.707，但在進行最佳截斷值計算時，無論取哪一個分值作為預測閾值，均不能同時取得較為滿意的敏感性和特異性。本研究通過約登指數計算得出GDD 遺傳風險檢查表的最佳截斷值為≥ 3 分，其敏感性為60.8%，特異性為75.6%，這將會漏診約39.2%的真陽性患兒，并誤診24.4%的真陰性患兒。而將閾值設為≥ 1 分時，雖然敏感性達97.7%，幾乎不會漏診，但同時量表也會將絕大多數（96.6%）真陰性的患兒預測為假陽性，使量表基本失去了篩選的作用，故仍有待進一步完善及修正。