東方百合兩個SERKs基因的克隆及表達分析

鄭梓唯，榮朵艷，廖曉珊，張邦躍

（1.湖南工業大學 生命科學與化學學院，湖南 株洲 412007；2.百合種質資源創新與深加工湖南省工程研究中心，湖南 株洲 412007；3.株洲市農業科學研究所，湖南 株洲 412007）

1 研究背景

體細胞胚發生類受體激酶（somatic embryo genesis receptor-like kinases，SERKs） 屬 于 富含亮氨酸重復序列受體激酶（leucine-rich repeat sequence receptor-like kinases，LRR-RLKs）家族成員[1]，其蛋白結構包含一個由5 個富含亮氨酸重復序列（LRR）組成的細胞外結構域、一個跨膜結構域和一個細胞內激酶結構域[2]。SERK 基因最初是從胡蘿卜細胞培養物中分離出來的，并在單細胞胚胎形成中起重要作用[3]。后來，陸續在其他的植物中篩選到SERK 基因家族，例如，擬南芥[4]、水稻[5]、玉米[6]、大麥[7]、小麥[8]、蘋果[9]等，表明SERK蛋白廣泛地分布在植物中，并在植物的生長、發育及防御反應中等方面發揮重要的作用。

目前，SERK 功能的研究主要是利用模式植物擬南芥來開展的。擬南芥中有5 個SERKs 家族成員，從AtSERK1～AtSERK5，其中在Col-0 背景下AtSERK1～AtSERK4 具有激酶活性并參與了多種生命活動，而AtSERK5 在Ler背景下才具有激酶活性[10]。研究表明，SERK 作為共受體（Coreceptor），與不同的受體蛋白一起感受細胞外不同的配體分子，形成“配體-受體-共受體”的模式，進而激活相應的細胞信號轉導、調控生命活動[11]。分泌肽TPD1（tapetum determinant 1） 與膜受體EMS1（excess microsporocytes 1）胞外結構域結合后，EMS1 招募AtSERK1 或AtSERK2 形成異源二聚體，并調控絨氈層細胞發育[12]，進而調控雄配子體的形成，而擬南芥atserk1、atserk2 雙突變表現為雄性不育[13]。AtSERK3， 也稱為BAK1（BRI1-associated receptor kinase 1），能夠在植物激素BR（brassinosteroid，油菜素類固醇）與膜受體BRI1（brassinosteroid insensitive 1）結合后快速地被招募形成“BR-BRI1-SERK3”復合物，進而調控BR介導的植物生長發育[14]。 除了AtSERK3 外，AtSERK1 和AtSERK4 也在BR信號中發揮功能冗余的作用，擬南芥atserk1、atserk3、atserk4 三突變體對BR處理完全不敏感[15]。AtSERK3 與AtSERK4 一起，還介導了植物的免疫反應[16]。AtSERK3 和AtSERK4 能夠分別與膜受體FLS2（flagellin-sensing 2）、EFR（elongation factor-Tu receptor）或PEPR1/2（PEP1 receptor 1/2）形成異源二聚體，并分別感受病原性蛋白flg22（一個22 個氨基酸殘基多肽）、elf18（一個18 個氨基酸殘基多肽）及植物內源多肽Pep1（peptide 1）信號分子，進而起始植物的免疫反應[17]。擬南芥atserk3、atserk4 雙突變體持續激活水楊酸依賴的防御途徑，導致活性氧的持續生成及幼苗致死[18]。擬南芥AtSERK1～AtSERK4冗余地與受體HAE（HAESA）或HLS2（HAE-like 2）結合，并共同介導分泌多肽IDA（inflorescence deficient in abscission）調控的花器官脫落，atserk1、atserk2、atserk3 或atserk1、atserk3、atserk4 三 突變體表現出花器官不脫落的表型[19]。此外，擬南芥SERKs 還參與了調控其他生長發育進程，比如氣孔模式（stomatal patterning）形成[20-21]、根的生長[22]、脅迫響應[11]等。

在其他植物中，也證實了SERKs 在介導植物生長發育及免疫反應過程中的功能保守性。水稻（Oryza sativa）OsSERK2 能夠與免疫受體XA21、XA3 和OsFLS2 互作，參與對水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）抗性的建立[23-25]。而OsSERK1 和OsSERK2 都能與受體OsBRI1 互作，并介導BR信號響應[24-25]。本生煙草（Nicotianabenthamiana）NbSERK3A 和NbSERK3B 與NbFLS2 互作，并感受病原體分子INF1，進而激活細胞抵御馬鈴薯晚疫病毒（Phytophthorainfestans）的侵染[26-27]。此外，番茄、棉花、土豆等植物SERKs 參與免疫響應、配子體發育、BR響應的功能也被發現[28-29]。

百合是世界上最受歡迎的花卉之一，其花香濃郁、花朵較大、花色多樣[30]。百合的成熟花藥中會釋放出大量的油性花粉粒，這會污染花瓣和衣物，降低其商品價值，因此在銷售前需要采用人工去雄方法去掉未成熟雄蕊。在規模化生產中，百合容易受到真菌、細菌及病毒等的侵染，嚴重影響產量及品質，降低其經濟價值。因此，開展百合花粉發育及抗病分子機制的研究，以便通過分子育種生產無花粉和抗病性強的百合，在生產上具有重要意義[29]。SERKs 已經被證實參與了植物包括雄配子發育、免疫響應等在內的多種生命活動，目前在百合中并沒有相關的報道。本研究從東方百合“西伯利亞”中克隆到了2 個SERK 同源基因，分別命名為LoSERK1 和LoSERK2。利用生物信息學方法對LoSERKs 進行了分析，同時采用實時定量PCR 技術對SERKs 在不同組織中的表達進行了分析，實驗結果可為進一步了解百合中SERKs 的功能奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗材料為東方百合“西伯利亞”種，盆栽于湖南工業大學百合工程研究中心。植物多糖多酚總RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；PCR 產物磁珠回收試劑盒、無縫連接試劑盒和M-MuLV 逆轉錄酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司。實時熒光定量PCR 購買自上海羅氏生物公司。

2.2 總RNA 提取

利用RNA 試劑盒提取“西伯利亞”總RNA，然后進行電泳檢測（1%瓊脂糖），以總RNA 為模板，利用Oligo dT18 引物和M-MuLV 逆轉錄酶合成第一鏈cDNA，于-20 ℃下保存備用。

2.3 LoSERKs 的基因克隆

根據百合轉錄組測序結果，課題組發現了2 個SERK 同源基因序列，這2 個基因包含有完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），長度分別是1 875 bp 和1 887 bp，分別命名為LoSERK1 和LoSERK2。利用Primer Premier 5.0 設計這2 個基因的特異引物LoSERK1-LP/LoSERK1-RP 和LoSERK2-LP/LoSERK2-RP（見表1），用于擴增LoSERK1 和LoSERK2 基因cDNA 序列。以cDNA 第一鏈為模板，利用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶擴增LoSERK1和LoSERK2 基因cDNA 序列。PCR 反應體系為25 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，GXL buffer 5.0 μL，GXL DNA Polymerase 0.5 μL，Template 0.3 μL， 正向引物0.7 μL，反向引物0.7 μL，ddH2O 補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃下擴增預變性2 min；98 ℃下擴增10 s，60 ℃下擴增15 s，68 ℃下擴增2 min，進行32 個循環；68 ℃延伸5 min，12 ℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，挑取條帶大小正確的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測通，以確定轉錄組數據中LoSERK1 和LoSERK2 基因cDNA 序列的正確性。

2.4 生物信息學分析

利用DNAMAN 9.0 對LoSERK1 和LoSERK2 基因的ORF 及其編碼氨基酸序列進行分析；利用NCBI數 據 庫 的BLASTp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對LoSERK1 和LoSERK2 的同源氨基酸序列進行搜索；利用BioEdit 7.0 對不同物種SERKs 氨基酸序列進行多重比對，并利用MEGA 11.0 的鄰接法（neighbor joining）構建系統發育進化樹；并用在線軟件NetPhos 3.1（https://services.healthtech.dtu.dk）預測磷酸化位點，使用紐普生物（https://www.novopro.cn/tools/）對其進行跨膜結構和信號肽的預測；使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進行三級結構預測。

2.5 LoSERKs 的定量分析

提取百合的不同組織，即在西伯利亞百合形成花苞時取其未開的花瓣及未成熟的花藥，迅速液氮速凍，保存至-80 ℃冰箱中。而后等到花瓣完全展開后1 d 取其開放的花瓣和成熟的花藥并采取葉片，材料液氮速凍后，保存至-80 ℃冰箱中。后文出現兩個不同時間節點不同組織則為此兩個時間段材料的總RNA，使用逆轉錄酶試劑盒進行百合First-Strand cDNA 的合成，根據LoSERKs 基因的序列，使用Primer Premier 6.0 軟件設計qRT-PCR 引物，以百合β-Actin基因為內參，引物序列見表2。

表2 qRT-PCR 分析的引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR analysis

將cDNA 母液稀釋10 倍作為qRT-PCR 反應體系中的模板，采用qRT-PCR 的技術檢測兩個LoSERKs 基因在百合不同組織中的表達量。反應體系為SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。該反應程序為：95 ℃下10 min；95 ℃下10 s，60 ℃下15 s，72 ℃下20 s，40 個循環后繪制熔解曲線，95 ℃下10 s，65 ℃下60 s，72 ℃下20 s。每個基因做3 次生物學重復以及技術性重復，添加以無菌水為模板的空白對照，按照2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

3 結果與分析

3.1 LoSERKs 基因克隆及序列分析結果

基于東方百合西伯利亞的轉錄組測序數據，從中篩選出2 個體細胞胚發生類受體激酶SERK 的同源基因。以百合葉片的cDNA 的第一條鏈為模板，分別用特異引物對LoSERK1-LP/LoSERK1-RP和LoSERK2-LP/LoSERK2-RP 進行PCR 擴增。獲得LoSERK1 和LoSERK2 基因的cDNA 序列，PCR 擴增產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示目標擴增條帶LoSERK1 約為2 200 bp，LoSERK2 約為2 400 bp，這與預期結果相符（見圖1，其中M 為DL5000 DNA Maker）。

圖1 LoSERKs 的cDNA 序列PCR 電泳擴增Fig.1 PCR electrophoresis amplification of cDNA sequences of LoSERKs

測序結果顯示，LoSERK1 和LoSERK2 基因cDNA 序列與轉錄組測序結果一致，包含完整ORF序列，其中LoSERK1 基因ORF 全長為1 875 bp 與編碼624 個氨基酸殘基（見圖2，其中，圓圈為磷酸化位點預測），LoSERK2 基因ORF 全長為1 887 bp，編碼628 個氨基酸殘基（見圖3，其中，圓圈為磷酸化位點預測）。

圖2 LoSERK1 核苷酸與編碼的氨基酸殘基序列Fig.2 LoSERK1 nucleotide and encoded amino acid residues sequence

圖3 LoSERK2 核苷酸與編碼的氨基酸殘基序列Fig.3 LoSERK2 nucleotide and encoded amino acid residues sequence

3.2 LoSERKs 信號肽、跨膜結構及三級結構預測

使用DNAMAM9.0 軟件分析，LoSERK1 蛋白質的相對分子質量為68 591.0，平均等電點（PI）為5.35，GC 含量為48.27%；LoSERK2 蛋白質相對分子質量為68 933.2，平均等電點（PI）為5.50，GC 含量為47.38%。通過在線軟件由圖4a 和圖6 知LoSERK1 有信號肽的概率為：99.32%，信號肽類型為SP(Sec/SPI)；切割位點：24～25，概率為87.67%信號肽序列；MAVAERAWFLILVLLLRPIARVSA。由圖4c 可知，LoSERK1 含有一個跨膜區，位點在242～262。 由圖4b 可知，LoSERK2 有信號肽的概率為99.82%，信號肽類型為SP(Sec/SPI)；切割位點：27～28 的概率為90.90%。信號肽序列為MAVVEQSSALWFLLLIMLLDPLAKVSA， 由圖4d 可知，LoSERK2 含有一個跨膜區，其位點從239～261。LoSERK1 有53 個磷酸化位點（圖2），LoSERK2 有55 個磷酸化位點（圖3）。LoSERK1和LoSERK2 三級結構預測如圖5所示，兩者以玉米SERK 為模板，使用SWISS-MODEL 進行預測。發現其同源相似性高達90%。也同時與氨基酸同源序列比對結果相似。表明SERK 較為穩定，不易突變，保守性高。

圖4 LoSERKs 信號肽及跨膜結構預測結果Fig.4 LoSERKs signal peptide and transmembrane structure prediction

圖5 LoSERKs 三級結構預測Fig.5 LoSERKs tertiary structure prediction

3.3 同源性比對分析及系統進化樹構建結果

為了研究百合SERK 的氨基酸序列在進化過程中的保守性及多樣性，將LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列與其他植物的SERKs 氨基酸序列進行比對，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）、 鳳梨（Ananascomosus）、 油棕（Elaeis guineensis）、 茶樹（Camelliasinensis）、 沉水樟（Cinnamomummicranthum）、可可樹（Theobroma cacao）。 結果顯示，LoSERK1 和LoSERK2 的氨基酸序列相似度達到90.22%，兩者與其他種類的SERKs 氨基酸序列的相似性也比較高，與鳳梨、油棕等單子葉植物的SERKs 氨基酸序列相似程度為92.74～93.21%。與雙子葉植物茶樹等的相似度也高達90%（圖6）。

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure）分析發現LoSERKs 有兩個超家族成員，分別為PLN00113 superfamily、PKc_like superfamily（ 見圖6）。其中PLN00113 superfamily 是富含亮氨酸重復序列區域（LRR），PKc_like superfamily 為激酶結構域。同時基于與擬南芥AtSERK1～AtSERK5 和水稻OsSERK1、OsSERK2 進行系統進化樹構建，由圖7可知，LoSERK1 與LoSERK2 分別與水稻的OsSERK1和OsSERK2 相似性較高。

圖7 基于擬南芥、水稻及百合SERKs 系統發育樹的構建Fig.7 Construction of SERKs phylogenetic tree based on Arabidopsis thaliana,Oryza sativa and Lilium

3.4 LoSERKs 實時定量PCR 分析

為了研究百合SERKs 在花器官中的表達模式，以百合葉片中LoSERK1、LoSERK2 基因表達量為1.00，系統比較兩個LoSERKs 基因在葉子、未開放的花瓣、已開放的花瓣、未成熟的花藥、已成熟的花藥中的相對表達量。結果發現，兩個LoSERKs 基因在不同器官中的表達量存在差異，LoSERK1 基因（圖8a，其中，L 為葉片；UF 為未開放的花瓣；OF 為開放的花瓣；IA 為未成熟的花藥；MA 為已成熟的花藥）在未成熟的花藥中的相對表達量最高，為葉片中的14.39 倍；其在已開放的花瓣中表達含量也高達10.76，未開放的花瓣和已成熟的花藥中相對表達量，分別為4.43 和4.98。LoSERK2 基因（圖8b）在已開放的花瓣中的相對表達量（4.10）顯著高于葉（1.00）、未成熟的花藥（0.79）、已成熟的花藥（0.44）、未開放的花瓣（0.40）；而LoSERK2 基因在未成熟的花藥與已開的花藥中的相對表達量差異只有0.35；該基因在未開的花瓣中的相對表達量最低為0.40。

圖8 不同組織中LoSERKs 的相對表達量Fig.8 Relative expression levels of LoSERKs in different tissues

4 討論

SERK 是植物特有的膜受體激酶，其以共受體的形式和其他膜受體激酶一起形成異源二聚體，共同感受外源或內源分子信號，進而激活酶聯受體介導的信號轉導途徑，例如MAPK信號通路。由于與SERK互作的受體激酶及信號分子具有的多樣性，這決定了SERK 激酶參與多元化的生物學功能，如激素信號轉導、免疫反應[17]、雄配子體發育[13]、花器官脫落等多方面的生理功能[19]。SERK 在植物中廣泛存在，且其介導的信號調控模式在不同植物間具有相對保守性。例如，介導激素BR（BR-BRI1-SERKs）[14]和病原菌誘導的免疫響應（flg22-FLS-SERKs）信號模式被證實存在于擬南芥、水稻和番茄中[11]，而調控花器官脫落的“IDA1-HAE/HSL2-SERKs”信號模式保守地存在于擬南芥和煙草中[19-20]。通過對模式植物中SERK 相關功能的研究，為其他植物中開展SERK功能研究提供了重要參考。

本文基于百合轉錄組測序數據，克隆了2 個東方百合SERK 同源基因LoSERK1 和LoSERK2，分別編碼624 和628 個氨基酸，兩者氨基酸序列相似性非常高，達90.22%。LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列與其他植物氨基酸序列相似性很高，例如與AtSERK1、AtSERK2、OsSERK1、OsSERK2 的序列相似性均高于90.28%。同時LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列長度與其他植物中SERKs 氨基酸長度很接近，例如擬南芥AtSERK1（625）、AtSERK2（628）、OsSERK1（624）、OsSERK2（628）。通過生物信息學分析，發現蛋白具有信號肽，且預測到跨膜結構域，推測這兩個蛋白為細胞質膜定位蛋白[21]。在其三級結構中，LoSERK1 和LoSERK2 均以玉米ZmSERK1為模板進行三級結構預測，其相似程度都為90%以上。此外，LoSERK1 和LoSERK2 的氨基酸序列中都具有5 個典型的LRR結構域和胞內的激酶結構域，這表明了SERK 在生物進化過程中的保守性。系統進化樹研究也表明，LoSERK1 和LoSERK2 與雙子葉擬南芥AtSERK1 和AtSERK2 分為一支，與水稻中的OsSERK1 和OsSERK2 相似，這表明單子葉植物中可能并不存在與雙子葉擬南芥AtSERK3 和AtSERK4 親緣性很近的SERK。單子葉植物中的SERK 數量可能要少于雙子葉植物，例如水稻、玉米和百合中發現2個SERKs，而擬南芥有5 個[31]、苜蓿有6 個[32]、蘋果有12 個[3]、大豆有25 個[12]。SERK 受體與其他不同的受體（如BRI1、EMS1、FLS、HAE）一起感受不同的細胞外信號分子，進而引起受體胞內激酶結構域的磷酸化及轉磷酸化，通過改變受體的激酶活性，從而激活細胞內的信號轉導[9]。在進行百合LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列分析時，也發現了這兩個蛋白質的激酶結構域分別有28 個和29 個潛在磷酸化位點，這些磷酸化位點可能與胞質激酶活性有關[22]。

百合觀賞性強，但其生產中也面臨一些問題，例如，百合花粉量大且容易污染花瓣及衣物、百合花瓣過早脫落、百合種植過程中容易染病等，這些都會影響其產業發展。在擬南芥中AtTPD1 能夠被定位在絨氈層前體細胞和絨氈層細胞質膜上的受體激酶AtEMS1 的胞外區所感知，并快速招募AtSERK1 或AtSERK2，進而引起受體間相互磷酸化，將信號傳遞到下游，最終決定花藥絨氈層的命運及雄配子體的發育[32]，擬南芥atserk1、atserk2 雙突變會導致雄配子敗育[13]。棉花中GhSERK1 也被發現能控制花粉發育，RNAi 干擾GhSERK1 基因的表達會導致雄性不育的表型[11]。對不同時期百合花藥的表達分析表明，LoSERK1 在未成熟和成熟花藥中的相對表達量均高于葉片中，其中未成熟花藥（14倍）和成熟花藥（5倍），而LoSERK2 在花藥中的相對表達量略低于葉片中，這暗示LoSERK1 在雄配子體形成過程中的重要性可能更大。之前研究表明，AtHAE及其同源基因AtHSL2 在花器官分離時期的離層區細胞中表達[21-22]，AtSERK1～AtSERK4 基因也在花器官離層區細胞中有表達[24]，分泌型小肽AtIDA能被受體激酶AtHAE和AtHSL2 的胞外區感知[27]，AtHAE/AtHSL2 和共受體AtSERKs形成異源二聚體，通過磷酸化作用激活下游MKK4/MKK5-MPK3/MPK6，進而通過調控細胞壁重塑酶基因的表達來調控花器官脫落[24,27]。擬南芥AtSERK1～AtSERK4 冗余地參與花器官脫落調控，其中AtSERK1 發揮最重要的功能，atserk1、atserk2、atserk3 或atserk1、atserk3、atserk4 三重突變體都會導致花器官不脫落[17]。兩個百合LoSERKs 均在已經完全開放的花瓣中表達量顯著高于未開放花瓣和葉片，由此推測，LoSERK1 和LoSERK2 可能會與花器官脫落有關，但還需要進一步證實。根據系統進化樹的分析結果，百合與水稻的SERKs 親緣性更近，預示著LoSERKs 有在免疫反應及激素BR響應的功能。未來，利用基因編輯或者RNA 沉默的方法將這兩個百合SERKs 基因進行干擾、敲除或突變，可能會獲得無花粉的百合，或者抗病性改變、花器官不脫落、植株生長改變等新表型的百合材料。

5 結語

本文基于轉錄組測序結果，對百合體細胞胚發生類受體激酶同源基因LoSERK1 和LoSERK2 進行了克隆，并通過生物信息學預測其功能，實時定量分析其在花器官中的表達情況。結果表明，百合LoSERK1和LoSERK2 分別編碼624 和628 個氨基酸，且兩個百合SERKs 在進化過程中具有高度的保守性，主要體現為蛋白質胞外LRR重復單元和胞內激酶結構域的保守性。百合與水稻的SERKs 之間親緣關系很近，暗示百合SERKs 可能參與激素BR和免疫響應。百合LoSERK1 基因在花藥成熟過程的表達量很高，預示LoSERK1 基因在雄配子形成中發揮功能。LoSERK1 和LoSERK2 基因在成熟花瓣中的表達量都很高，推測兩個LoSERKs 基因可能參與了花器官的脫落。本研究可為進一步開展百合SERKs 功能研究及育種應用創造條件。