黃瓜瓜類蚜傳黃化病毒的檢測與分析

張廣榮 孫述俊 文朝慧 何蘇琴

摘要：黃瓜是我國重要的蔬菜種類之一，目前已報道約36種病毒可侵染黃瓜，其中瓜類蚜傳黃化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）平均檢出率為0.65%。2021年9月在甘肅省白銀地區發生病毒病的黃瓜田，發現葉片呈現黃化、明脈癥狀黃瓜病株。為明確其病原，采集病株后，采用分子生物學方法對病樣進行了檢測。RT-PCR及病毒CP基因序列測定分析結果表明，該病樣受到瓜類蚜傳黃化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV）的感染。這是繼2017年在甘肅酒泉市瓜州縣的甜瓜上檢測到CABYV后，在甘肅白銀市靖遠縣的黃瓜上再次檢測到該病毒。

關鍵詞：黃瓜；瓜類蚜傳黃化病毒；病毒病；白銀市

中圖分類號：S436.42? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）11-1074-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.11.018

Report of Cucurbit Aphid-borne Yellows Virus Infecting Cucumbers

in Baiyin， Gansu Province

ZHANG Guangrong 1， SUN Shujun 1， WEN Zhaohui 2， HE Suqin 3

（1. Baiyin Station of Plant Protection and Quarantine， Baiyin Gansu 730900， China; 2. Technical Centre of Lanzhou

Customs District， Lanzhou Gansu 730010， China; 3. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Cucumis sativus is one of the important vegetable species in China. To date， nearly 36 viruses have been reported to be able to infect cucumber. Among them， the average detection rate of cucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV） is 0.65%. In September 2021， a cucumber plot with viral disease occurred in the Baiyin， Gansu Province， and there was symptoms of yellowing and vein clearing on the leaves from cucumber-diseased plant. The disease strains were collected and tested using molecular biology methods to verify the pathogen. RT-PCR and viral CP gene sequencing analysis showed that the disease sample was infected by the CABYV. CABYV on melons was discovered firstly in Guazhou County， Jiuquan in 2017， which was noticed secondly on cucumbers in Baiyin of Gansu Province in September 2021.

Key words： Cucumis sativus; Cucurbit aphid-borne yellows virus; Virus disease; Baiyin

收稿日期：2023 - 05 - 09；修訂日期：2023 - 06 - 06

基金項目：蘭州海關科研項目（LK-2022-004）。

作者簡介：張廣榮（1965 —），男，甘肅鎮原人，高級農藝師，主要從事日光溫室蔬菜病蟲害防治工作。Email： zgr0815@163.com。

黃瓜（Cucumis sativus）是我國重要的蔬菜種類之一，年均播種面積達122.97萬hm2，總產量約? 6 623.08萬t，播種面積及產量均居世界第1位［1 ］。黃瓜在生產過程中遭受多種病害侵擾，已報道約36種病毒可侵染黃瓜［2 ］，在我國，劉勇等［3 ］采用斑點酶聯免疫吸附法（Dot-ELISA）、RT-PCR及PCR擴增、小RNA測序分析等血清學和分子生物學方法，對全國范圍內采集的3 283份黃瓜病毒病樣本進行檢測，共檢測到19種病毒，其中檢出率最高的4種病毒為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV），平均檢出率依次為28.97%、21.38%、14.35%和10.20%，而瓜類蚜傳黃化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus， CABYV）平均檢出率為0.65%。

CABYV是一種單鏈正義RNA病毒，屬黃癥病毒科（Luteoviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），在田間主要通過棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）和馬鈴薯長管蚜（Macrosiphum euphorbiae）以持久非增殖型方式傳播［4 ］，該病毒還可通過嫁接傳播，目前尚未有經汁液機械接種或種子傳播的報道［5 ］。CABYV最早于1992年在法國首次報道［4 ］，目前我國北京、上海、浙江、江蘇、河南、遼寧、陜西、甘肅、內蒙古、云南、新疆等省（市、區）均有發生［3， 6 - 8 ］。2017年在甘肅瓜州地區的甜瓜上檢測到該病毒［8 ］。

2021年9月在甘肅省白銀市靖遠縣北灣鎮新坪村的溫室大棚中，發現了表現葉片黃化和明脈等病毒病癥狀的黃瓜植株。為明確其病原，采用PCR方法對病樣進行了檢測，以期為黃瓜病害的防治提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?病害癥狀及病情調查

依據田間癥狀進行病害癥狀描述，調查黃瓜棚內表現典型病毒病癥狀的瓜苗病株率，采用Z字形5點取樣，每點調查2壟（30株/壟）。

病株率=（病株數/調查植株總數）×100%

1.2? ?樣品采集

于2021年9月上旬（黃瓜苗期），自靖遠縣北灣鎮新坪村大棚黃瓜田（種植黃瓜品種為德爾688，由天津德瑞特種業有限公司提供）采集葉片黃化、明脈的典型病株1份，置于潔凈塑料袋中，-80 ℃冰箱保存備用。采樣過程中發現棚內有煙粉虱和蚜蟲發生。

1.3? ?引物

參照文獻Deng 等［9 ］、Juarez等［10 ］的方法分別合成粉虱傳雙生病毒（whitefly-transmitted geminivirus， WTG）的通用引物和瓜類蚜傳黃化病毒（CABYV）的特異性引物（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4? ?DNA提取和PCR檢測

黃瓜葉片總DNA采用［寶生物工程（大連）有限公司］的植物基因組提取試劑盒提取，根據說明書進行操作，同時提取健康黃瓜葉片總DNA，作為健康對照。

PCR反應體系為：2.5 μL 10×PCR反應緩沖液（含Mg2+）、2.0? μL dNTP（2.5 μmol/L）、1.0 μL引物PA（10 μmol/L）、1.0 μL 引物PB（10 μmol/L）、0.5 μL Taq酶、2.0 μL植物總DNA，ddH2O補足體積至25.0 μL。擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。

1.5? ?RNA提取和RT-PCR檢測

黃瓜葉片總RNA提取采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，根據制造商［寶生物工程（大連）有限公司］的說明書進行操作，同時提取健康黃瓜葉片總RNA，作為健康對照。

RT-PCR反應體系為：12.5 μL 2×一步法RT-PCR反應緩沖液、1.0 μL酶、1.0 μL引物CE-9（10 μmol/L）、1.0? μL引物CE-10（10 μmol/L）、3 μL植物總RNA、6.5 μL ddH2O。擴增程序為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃1 min，35個循環；72 ℃ 8 min。

將PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并在紫外燈下切取含目的片段的凝膠。

利用愛思進Axygen DNA凝膠回收試劑盒純化回收DNA片段，將純化回收的PCR產物連接到pMD18-T載體，然后將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，并將轉化后的菌液涂布于LB培養基上生長，挑選陽性克隆，送金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.6? ?序列分析

將測序得到的核苷酸序列在NCBI上進行BLAST比對，并下載相關序列（表2）。將文獻報道的部分CP序列作為分類標準［11 ］，甜瓜蚜傳黃化病毒（Melon aphid-borne yellows virus， MABYV）的CP序列作為外群，采用MEGA X軟件中的鄰接法（Neighbour Joining， NJ）構建CP基因核苷酸系統發育樹，進行1 000次Bootstrap檢驗計算系統樹中節點的置信度。將測序得到的核酸序列編碼的外殼蛋白（coat protein， CP）序列在NCBI上進行BLAST比對，采用MEGA X軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood， ML）構建CP基因氨基酸系統發育樹，進行1 000次Bootstrap檢驗計算系統樹中節點的置信度。

2? ?結果與分析

2.1? ?黃瓜樣品癥狀

采樣大棚的黃瓜田發病株率為0.3%，罹病黃瓜植株的葉片表現明顯的黃化、明脈癥狀（圖1）。

2.2? ?PCR檢測

利用WTG通用引物（PA和PB）對田間采集的病樣進行檢測，在發病黃瓜樣品及健康對照中均未擴增到目標條帶（數據未顯示）。表明該黃瓜樣品中不存在WTG感染。

2.3? ?RT-PCR檢測

以CABYV特異性引物進行的RT-PCR擴增結果顯示，在黃瓜病樣中擴增出約600 bp的特異性條帶，健康樣品和空白對照未擴增到目標條帶（圖2），表明該黃瓜病樣中存在CABYV的感染。病樣PCR產物純化后進行序列測定，序列比對分析結果表明，該序列（GenBank登錄號：OQ913376）與已報道的福建南瓜上分離物CABYV-FJCP基因的核苷酸序列（GenBank登錄號：GQ221223）的同源性為98.33%、氨基酸序列的同源性為98.48%，證明所測定的序列為CABYV的CP基因部分序 列［11 ］。

2.4? ?CABYV的系統進化分析

在基于CP基因序列構建的系統發育樹中，本研究獲得的CABYV分離物（GenBank登錄號：OQ913376）和瓜類蚜傳黃化病毒（如KR231953.1、KR231943.1、KR231944.1、KR231952.1等）均聚為同一分支，即亞洲分支（圖3、圖4），與福建分離物（GenBank登錄號：GQ221223）、新疆分離物（GenBank登錄號：EU636992）及韓國分離物（GenBank登錄號：KR231952）的親緣關系較近，聚在亞洲分支，而與歐洲（地中海分支）及中國臺灣（臺灣分支）分離物的親緣關系較遠。

3? ?討論與結論

Kwak等［11 ］測定了2013 — 2014年從韓國出現黃化癥狀的植株上收集的22個CABYV分離物的完整基因組序列，并與之前報道的CABYV基因組序列進行比較。其研究結果顯示，根據完整核苷酸序列的系統發育分析，CABYV可分為4個分支，即亞洲分支、地中海分支、臺灣分支和CABYV-R分支。通過分析CP基因序列的相似性，本研究獲得的白銀CABYV分離物與亞洲分支聚集在一起。

除了葫蘆科作物（Cucurbitaceae），萵苣（Lactuca sativa）、蠶豆（Vicia faba）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、西番蓮（Passiflora spp.）以及部分葫蘆科、錦葵科（Malvaceae）、莧科（Amaranthaceae）、十字花科（Brassicaceae）、藜科（Chenopodiaceae）、唇形科（Lamiaceae）的野生植物也是CABYV的自然寄 主［16 - 20 ］，在病毒傳播中起到病毒庫的重要作用。CABYV主要引起葫蘆科植物，如黃瓜、甜瓜、西瓜、西葫蘆、南瓜和苦瓜等葉片黃化和增厚，在果實上癥狀不明顯，但感染后會導致花和綠葉面積減少，致使果實產量降低。在黃瓜中，產量損失可高達50%［21 ］。

本研究是繼吳洋等［8 ］2017年在甘肅酒泉市瓜州縣甜瓜上檢測到CABYV后，在甘肅白銀市靖遠縣黃瓜上再次檢測到該病毒，鑒于其具有蚜傳特征，同時也可以隨著種苗調運等途徑遠距離擴散危害，生產上應密切關注，加強種苗監測，早發現，早防控，減少對產業健康發展造成的危害。通過控制蚜蟲，清除雜草等可減少或推遲CABYV病毒的傳播和擴散；有針對性地篩選和利用抗性品種，也是病害防控的有效措施。

參考文獻：

［1］ 張圣平，苗? ?晗，薄凱亮，等． “十三五”我國黃瓜遺傳育種研究進展［J］．? 中國蔬菜，2021（4）：16-26．

［2］ LAMY-BESNIER Q， BRANCOTTE B， M？魪NAGER H， et al. Viral Host Range database， an online tool for recording， analyzing and disseminating virus-host interactions ［J］.? Bioinformatics， 2021， 37（17）： 2798-2801.

［3］ 劉? ?勇，李? ?凡，李月月，等．? 侵染我國主要蔬菜作物的病毒種類、分布與發生趨勢［J］．? 中國農業科學，2019，52（2）：239-261．

［4］ LECOQ H， BOURDIN D， WIPF-SCHEIBEL C， et al.? A new yellowing disease of cucurbits caused by a luteovirus， cucurbit aphid-borne yellows virus［J］.? Plant Pathology， 1992， 41（6）： 749-761.

［5］ KEINATH A P， WINTERMANTEL W M， ZITTER.? Compendium of cucurbit diseases and pests［M/OL］//second edition. LECOQ H， DESBIEZ C. Cucurbit aphid-borne yellows virus. St Paul， Minnesota， USA： The American Phytopathological Society. 2017.

［6］ XIANG H Y， SHANG Q X， HAN C G， et al.? First report on the occurrence of Cucurbit aphid-borne yellows virus on nine cucurbitaceous species in China［J］.? Plant Pathology， 2010，57（2）： 390.

［7］ KNIERIM D， DENG T C， TSAI W S， et al.? Molecular identification of three distinct Polerovirus species and a recombinant Cucurbit aphid-borne yellows virus strain infecting cucurbit crops in Taiwan［J］.? Plant Pathology， 2010，?59（5）： 991-1002.

［8］ 吳? ?洋，劉莉銘，彭? ?斌，等．? 新疆、甘肅和河南部分地區甜瓜瓜類蚜傳黃化病毒分子變異初步分析［J］．? 園藝學報，2017，44（4）：777-783．

［9］ DENG D， MCGRATH P F， ROBINSON D J， et al.? Detection and differentiation of whitefly-transmitted geminiviruses in plants and vector insects by the polymerase chain reaction with degenerate primers［J］.? Annals of Applied Biology， 1994， 125： 327-336.

［10］ JUAREZ M， TRUNIGER V， ARANDA M A. First report of Cucurbit aphid-borne yellows virus in Spain［J］.? Plant Disease， 2004， 88（8）： 907.

［11］ KWAK H R， LEE H J， KIM E A， et al. Complete genome sequences and evolutionary analysis of Cucurbit aphid-borne yellows virus isolates from melon in Korea［J］.? The Plant Pathology Journal， 2018， 34（6）： 532-543.

［12］ CHOI S K， YOON J Y， CHOI G S.? Biological and molecular characterization of a Korean isolate of Cucurbit aphid-borne yellows virus infecting Cucumis species in Korea［J］.? Journal of Plant Pathology， 2015， 31（4）： 371-378.

［13］ XIANG H Y， SHANG Q X， HAN C G， et al. Complete sequence analysis reveals two distinct poleroviruses infecting cucurbits in China［J］.? Archives of Virology， 2008， 153： 1155-1160.

［14］ KASSEM M A， JU？魣REZ M， G？魷MEZ P， et al.? Genetic diversity and potential vectors and reservoirs of Cucurbit aphid-borne yellows virus in southeastern Spain［J］. Phytopathology， 2013， 103： 1188-1197.

［15］ KNIERIM D， TSAI W S， DENG T C， et al.? Full-length genome sequences of four polerovirus isolates infecting cucurbits in Taiwan determined from total RNA extracted from field samples［J］.? Plant Pathology， 2013， 62： 633-641.

［16］ MNARI-HATTAB M， GAUTHIER N， ZOUBA A. Biological and molecular characterization of the Cucurbit aphid-borne yellows virus affecting cucurbits in Tunisia ［J］.? Plant Disease， 2009， 93（10）： 1065-1072.

［17］ BUZKAN N， ARPACI B B， APALAK A. First report of Cucurbit aphid-borne yellows virus in Vicia faba［J］.? New Disease Reports， 2017， 35（1）： 13.

［18］ KUMARI S G， MOUKAHEL A R， HAMED A A， et al. First report of Cucurbit aphid-borne yellows virus affecting chickpea（Cicer arietinum L.） in Sudan［J］.? Plant Disease， 2018， 102（10）： 2048.

［19］ VIDAL A H， SANCHES M M， ALVES-FREITAS D M T， et al. First world report of Cucurbit aphid-borne yellows virus infecting passionfruit［J］.? Plant Disease， 2018，?102（12）： 2665.

［20］ VAFAEI S H， MAHMOODI M. Presence of recombinant strain of Cucurbit aphid-borne yellows virus in Iran［J］.? Iranian Journal of Biotechnology， 2017， 15（4）： 289-295.

［21］ MENZEL W， MAERITZ U， SEIGNER L. First report of Cucurbit aphid-borne yellows virus infecting cucurbits in Germany［J］.? New Disease Reports， 2020， 41（1）： 1.