Bifidobacterium pseudolongum JNFEN6低聚木糖利用效率評價及轉錄組學分析

章潔瑜，仝艷軍，楊瑞金

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

雙歧桿菌是一種桿狀、不產氣的革蘭氏陽性厭氧菌，它可以通過產生有機酸和抗菌肽抑制腸道病原體，是一類公認安全的益生菌[1]。雙歧桿菌可以利用各種在上消化道中不被降解的膳食纖維，其中大部分是植物來源的多糖和低聚糖[2]。低聚木糖（xylooligosaccharide，XOS）是由D-木糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的線性低聚糖，其聚合度為2～12[3]。XOS是益生元的一種，存在于蜂蜜、水果、蔬菜和麥麩中[4]，具有調節腸道菌群、調節血糖和改善脂質代謝等生理功能[5-7]。研究表明，益生元可以促進益生菌在人體中增殖、抑制有害菌生長，從而改善人體腸道微生態、提高人體免疫力[8-9]。

XOS可以使部分雙歧桿菌增殖，具有很強的雙歧特性，且不同的雙歧桿菌對XOS的利用也存在差異。M?kel?inen等[10]對雙歧桿菌和乳桿菌在XOS、木聚糖、低聚半乳糖等唯一碳源培養基上的生長特性進行測定，結果表明，Bifidobacterium animalissubsp.lactisHN019、B.animalissubsp.lactisBB12、B.animalissubsp.lactisBi-07等乳雙歧桿菌能夠利用不同聚合度的XOS，而B.breveBb-03、B.longumsubsp.longumKC-1、B.longumsubsp.infantisDSM20088等雙歧桿菌不能有效利用XOS。Palframan等[11]對不同雙歧桿菌碳水化合物偏好性進行探究，結果表明，B.bifidum能在XOS唯一碳源培養基中生長且生長趨勢優于在木糖唯一碳源培養基，這種生長優勢與體內發酵及特殊的寡糖轉運機制有關。在細胞生理學方面，通過XOS增殖的雙歧桿菌具有木糖苷酶活性并可以產生大量的短鏈脂肪酸。Hyun等[12]從B.breveK-110中分離出一種木糖苷酶，其Km和Vmax分別為1.45 mmol/L和10.75 μmol/（min·mg）。Usta-Gorgun等[13]發現，用含蘭花塊莖粉末的培養液對不同種類的雙歧桿菌進行發酵后，其發酵液中含有乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸。在轉錄組學方面，Song Angxin等[14]探究長雙歧桿菌在阿拉伯木聚糖唯一碳源培養基上的攝取機制，結果表明，長雙歧桿菌對阿拉伯木聚糖的攝取過程分為特定結構被細胞表面的結合蛋白識別及通過ABC（ATP binding cassette）轉運蛋白直接轉運至細胞中兩部分。Yang Jian等[15]研究B.adolescentis15703代謝XOS的機制，結果表明，XOS可以增強ABC轉運蛋白、半乳糖苷酶、木糖苷酶、葡萄糖苷酶、淀粉酶等參與碳水化合物轉運代謝的基因的表達。基于雙歧桿菌選擇性利用XOS的詳細機制仍存在研究空白，本研究通過轉錄組學分析，對篩得的一株高效利用XOS的假長雙歧桿菌進行研究，旨在為雙歧桿菌高效利用XOS的機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B.breveJNFE6、B.breveJNFE8、B.pseudolongumJNFE5、B.pseudolongumJNFE6、B.adolescentJNFE4、B.adolescentJNFE5、B.longumsubsp.longumJNFE2、B.longumsubsp.longumJNFE3、B.pseudocatenulatumJNFE15、B.bifidumJNFE3、B.longumsubsp.infantisJNFE3均為實驗室在前期研究中分離并保存的菌株。

MRS培養基 北京陸橋技術股份有限公司；XOS河南益常青生物科技有限公司；乙酸、丙酸（均為色譜級）上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯酚-β-D-木糖苷 生工生物工程（上海）股份有限公司；溶菌酶（20 kU/mg）、反轉錄試劑盒 翌圣生物科技（上海）有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

AW200SG厭氧工作站 英國Electrotek公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；酶標儀 南京拜爾沃克公司；GC-2010PLUS氣相色譜儀 日本島津公司；H-7000FA透射電子顯微鏡 日本日立公司；LightCycler 480 II全自動熒光定量PCR系統美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 不同菌株利用XOS生長特性的測定

將不同菌株的菌懸液以3%的接種量接種于改良MRS培養基（2% XOS）中，并于37 ℃恒溫厭氧培養，在培養24 h時測定不同菌株的OD600nm和pH值。分別以普通MRS液體培養基和無碳源MRS培養基為陽性對照和陰性對照，分析不同菌株利用XOS的差異性[16]。

1.3.2B.pseudolongumJNFE6生長曲線的測定

將菌懸液以3%的接種量接種于改良MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫厭氧培養，每間隔4 h測定培養基的OD600nm和pH值。分別以普通MRS液體培養基和不添加葡萄糖的MRS培養基作為陽性對照和陰性對照，繪制生長曲線。

1.3.3 短鏈脂肪酸測定

取500 μL發酵液置于離心管中，加入40 μL體積分數10%H2SO4溶液振蕩30 s，提取發酵液中的短鏈脂肪酸。隨后加入1 mL乙醚，振蕩30 s，4 ℃、3 000×g離心5 min。向樣品中加入0.25 g無水Na2SO4，靜置15 min后取200 μL上清液用于氣相色譜分析[17]。

1.3.4 胞形態觀察

參考Booyens等[18]的方法，取1 mL菌液以3 000×g離心5 min。將離心得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）洗滌兩次，并緩慢加入4 ℃固定液進行保存。用蒸餾水漂洗樣品，并將其置于不同梯度體積分數（50%、70%、90%和100%）乙醇溶液中脫水，每個梯度處理15 min，最后用丙醇處理20 min，包埋劑處理后在70 ℃加熱過夜。將樣品切片后染色，用于透射電子顯微鏡觀察。

1.3.5β-木糖苷酶的活性測定

胞內粗酶提取物的制備：稱取1 g菌泥，加入110 μL磷酸鹽緩沖液和70 μL 50 mg/mL溶菌酶溶液，37 ℃水浴30 min，獲得粗酶提取物。

對硝基苯酚標準曲線繪制[19]：配制濃度為1 mmol/L的對硝基苯酚溶液，用水稀釋制備系列濃度梯度的標準溶液。在200 μL標準溶液中加入600 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止顯色，在405 nm波長處測定吸光度。以A405nm為縱坐標，對硝基苯酚濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

菌體胞內β-木糖苷酶活力測定：反應體系包含10 μL 20 mmol/L的對硝基苯酚-β-D-木糖苷、185 μL 100 mmol/L的鄰苯二甲酸氫鉀和5 μL粗酶提取物。將混合物在65 ℃中水浴5 min后加入600 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應。測定405 nm波長處的吸光度，計算對硝基苯酚產量。一個酶活力單位定義為在該反應條件下，1 min內催化產生1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

1.3.6 總RNA的提取與測序文庫構建

選取以葡萄糖為碳源的對照組和以XOS為碳源的實驗組進行轉錄組的數據測定。將B.pseudolongumJNFE6在37 ℃厭氧條件下培養21 h。在4 ℃、8 000×g離心10 min收集細胞。收集沉淀并使用AxygenTM總mRNA提取試劑盒提取總細菌mRNA。采用TruSeqTMStranded Total RNA Library Prep Kit試劑構建文庫。

1.3.7 轉錄組測序和功能注釋

使用Illumina HiSeq平臺進行測序。使用DESeq2軟件對raw counts進行統計分析，基于差異倍數（fold change，FC）≥2且P＜0.05的條件篩選比較組間差異表達基因[20]。將差異表達基因映射到基因本體論（Gene Ontology，GO）數據庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫以分析其功能和途徑。

1.3.8 real-time PCR驗證

基于轉錄組學結果，對關鍵差異表達基因進行驗證。通過MEGA軟件比對NCBI數據庫中雙歧桿菌共有序列并采用oligo軟件設計引物。引物序列如表1所示。取不同發酵時間的RNA樣本，采用反轉錄試劑盒進行cDNA合成并用于real-time PCR驗證。采用2－ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR analysis of gene expression

1.4 數據處理與分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析和作圖。采用單因素方差分析比較組間差異，采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結果與分析

2.1 不同雙歧桿菌在XOS唯一碳源培養基上的生長特性

通過體外厭氧發酵探究XOS作為唯一碳源對7 種雙歧桿菌增殖的影響。以XOS為唯一碳源組作為實驗組，葡萄糖為唯一碳源組作為對照組。通過發酵24 h時pH值和OD600nm的變化評價菌株利用XOS的能力。如圖1所示，不同雙歧桿菌對XOS的利用能力不同。B.breve、B.adolescent、B.longumsubsp.longum幾乎不能直接利用XOS生長，這種菌株利用XOS能力的差異可能與糖苷酶有關[21]。實驗組中B.longumsubsp.infantisJNFE3在24 h時的OD600nm為0.517，對照組B.infantisJNFE3在24 h時的OD600nm為2.417，是實驗組的4.68 倍。實驗組中B.pseudolongumJNFE6在24 h時的OD600nm為0.44，對照組B.pseudolongumJNFE6在24 h時的OD600nm為0.59，是實驗組的1.1 倍，與實驗組差異較小。B.pseudolongumJNFE6在24 h時pH值最低，為4.93；B.pseudolongumJNFE5在24 h時pH值為5.45，均低于其他菌株。B.pseudocatenulatum和B.bifidum均能利用XOS，但其OD600nm均小于0.4。由此可知，假長雙歧菌株對于XOS的利用具有特異性，其中B.pseudolongumJNFE6對XOS有較好的利用能力。Hopkins等[22]研究表明，B.adolescentisNCFB 2230、B.bifidumDSM 20082、B.longumsubsp.longumNCFB 2259對XOS利用率很低，僅B.pseudolongumNCFB 2244有明顯生長現象，該結果與本實驗結果一致。

圖1 XOS碳源培養基中不同雙歧桿菌的OD600nm（A）和pH值變化（B）Fig.1 Changes in OD600nm (A) and pH (B) after 24 h culture of different Bifidobacteria strains using XOS as carbon source

2.2 B.pseudolongum JNFE6生長動力學及發酵液中短鏈脂肪酸分析

為進一步探索B.pseudolongumJNFE6菌株利用XOS的能力，分析該菌株的生長動力學。如圖2A所示，B.pseudolongumJNFE6在葡萄糖培養基和XOS培養基中的生長過程相似，菌體均在發酵培養44 h時達到生長穩定期，其OD600nm分別為0.59和0.46，且發酵體系的pH值分別為4.61和4.7。實驗組和對照組的OD600nm相差較大，而pH值卻較為接近。XOS進入細胞后，pH值的改變與菌株代謝XOS產生小分子酸相關，間接說明B.pseudolongumJNFE6對XOS的代謝能力很強[23]。

圖2 B.pseudolongum JNFE6生長曲線（A）及其在不同底物中產生的總短鏈脂肪酸含量（B）Fig.2 Growth curve of B.pseudolongum JNFE6 (A) and amounts of total short-chain fatty acids produced by B.pseudolongum JNFE6 utilizing different substrates (B)

如圖2B所示，在以XOS為碳源時，其發酵液中短鏈脂肪酸的總含量明顯高于以葡萄糖為碳源時；在XOS培養基中發酵培養24 h時，發酵液中的短鏈脂肪酸總質量濃度為1 531.87 μg/mL，是葡萄糖碳源培養基的1.29 倍。并且在以XOS和葡萄糖為碳源發酵時，乙酸在短鏈脂肪酸中含量最高，24 h時其質量濃度分別為1 351.12 μg/mL和867.24 μg/mL。同時，以XOS為碳源時可產生大量的丙酸，24 h時其質量濃度為85.26 μg/mL，是以葡萄糖為碳源時的1.93 倍。乙酸含量的升高與雙歧桿菌獨特的代謝途徑有關[24]，該代謝能夠產生乙酸而不產生氣體，以此提高碳的轉化率[25]。

2.3 細胞形態及木糖苷酶活性分析

通過透射電子顯微鏡對不同碳源培養條件下菌體形態進行觀察，如圖3所示，在XOS碳源培養基和葡萄糖碳源培養基上生長的菌株細胞膜、細胞壁均保持完整。細胞為橢圓狀，邊緣光滑完整，無運動性，表明XOS對于B.pseudolongumJNFE6不會造成損害。

圖3 B.pseudolongum JNFEN6在葡萄糖碳源（A）和XOS碳源（B）培養基生長后的形態Fig.3 Morphology of B.pseudolongum JNFEN6 cultured on glucose (A) or XOS (B) as carbon source

β-木糖苷酶是XOS降解的關鍵酶之一，XOS進入細胞后被β-木糖苷酶水解為木糖[26]。B.pseudolongumJNFE6在XOS培養基中的β-木糖苷酶活力在24～36 h逐漸升高，然后隨發酵時間延長而降低（圖4），在36 h時β-木糖苷酶活力最高，為0.97 U/mL，是對照組的4.85 倍。葡萄糖培養基中的β-木糖苷酶活力較低。因此，XOS的存在可能對β-木糖苷酶活力的提高有誘導效應。

圖4 B.pseudolongum JNFE6中β-木糖苷酶活力在葡萄糖碳源和XOS碳源培養基生長期間的變化Fig.4 Changes in β-xylosidase activity during the growth of B.pseudolongum JNFE6 on glucose or XOS as carbon source

2.4 Illumina HiSeq mRNA測序及質量評估

將Illumina HiSeq測序得到的原始圖像轉化為序列數據。經過數據過濾后，結果如表2所示。原始堿基錯誤率均小于0.1%，Q20和Q30均高于90%，表明該文庫堿基質量良好，可用于后續分析。

表2 轉錄組測序數據質控Table 2 Quality control of transcriptome sequencing data

飽和度曲線表示絕大多數表達基因的覆蓋量，基因覆蓋率分析評估所得序列的基因分布程度。如圖5所示，飽和度總體質量較高，測序能覆蓋絕大多數的表達基因。由圖6可知，測序所得序列在基因上均勻分布，無偏向性。

圖5 XOS組（A～C）及葡萄糖組（D～F）的測序飽和度曲線Fig.5 Sequencing saturation curves of XOS (A-C) and glucose groups (D-F)

圖6 測序覆蓋度Fig.6 Sequencing coverage analysis

2.5 差異表達基因分析

菌體在對數生長中期產生的多糖及次級代謝物較少，因此選擇培養時間為21 h的總RNA構建cDNA文庫。如圖7所示，對照組有1 832 個表達基因，實驗組有1 840 個表達基因。兩組表達基因共有數為1 831，表現出99.57%的相似性。使用DESeq2進行基因表達差異分析。如圖7所示，共有297 個差異表達基因，其中有136 個上調基因，占總差異表達基因的45.79%；161 個下調基因，占總差異表達基因的54.21%。

圖7 差異表達基因樣本間Venn圖（A）及火山圖（B）Fig.7 Venn diagram (A) and volcano map (B) of differentially expressed genes between samples

2.6 轉錄組反應全局分析

通過GO注釋分析對差異表達基因進行功能注釋。如圖8所示，差異表達基因分別屬于生物過程、細胞成分、分子功能3 個部分。在生物過程中，主要包括碳水化物代謝、翻譯、跨膜運輸、糖酵解過程，其占比分別為0.033、0.026、0.020、0.013。在細胞成分中，主要包括膜組成、細胞質膜、細胞質、核糖體，其占比分別為0.157、0.057、0.046、0.020。在分子功能中，主要包括ATP結合、DNA結合、水解酶活性、金屬離子結合等功能，其占比分別為0.067、0.043、0.036、0.023。其中，基因占比前3的功能分別是細胞膜組成（15.7%）、ATP結合（6.7%）和細胞質膜（5.7%）。其中，細胞膜組成中上調倍數最多的5 個基因包含2 個ABC轉運蛋白滲透酶相關基因（msmG、msmF）、2 個結構蛋白相關基因（comEA、comEC）和1 個系統內膜組分家族蛋白相關基因（lplB）。下調倍數最多的5 個基因分別編碼ABC轉運滲透酶蛋白（gguB）、ATP結合蛋白（ecfTA）、膜反應蛋白（yeaQ）、DUF1295結構域蛋白（ymgE）和FtsX滲透酶蛋白（lolE）。

圖8 GO注釋分析Fig.8 GO annotation analysis

通過KEGG顯著性富集進一步探究差異表達基因參與的途徑。與葡萄糖利用途徑相比，差異表達基因主要富集在ABC轉運系統、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、糖酵解、甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝及戊糖磷酸途徑等過程，分別富集到16、9、7、12、5 個差異表達基因（圖9）。ABC轉運系統中，13 個基因表達存在顯著性差異：msmE（編碼胞外溶質結合蛋白），lplB（編碼轉運系統依賴結合蛋白），lplA（編碼ABC轉運蛋白底物結合蛋白），efrB（編碼ATP結合蛋白），znuA（編碼金屬結合蛋白），msmG、msmF、lplC、ssuC、lplB（編碼ABC轉運滲透酶蛋白）顯著上調；同時，3 個編碼ABC轉運相關蛋白的基因在XOS干預后顯著下調。

圖9 KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment analysis

2.7 XOS轉運和代謝相關差異表達基因

轉錄組中涉及XOS轉運主要差異表達基因如表3所示。雙歧桿菌主要通過ABC轉運系統、PEP-PTS轉運系統、MFS轉運系統攝取碳水化合物。ABC轉運系統主要包括糖特異性溶質結合蛋白、滲透酶和ATP酶[27]。B.pseudolongumJNFEN6經過XOS培養后，多個ABC轉運滲透酶基因上調。其中，msmG、msmF、lplC、ssuC顯著表達，FC值分別為26.884、16.746、4.302和3.596。同時，底物結合蛋白基因msmE、lplA（FC值分別為37.685和2.92）和ATP結合蛋白基因lnrL、efrB、msmX（FC值分別為2.834、2.086、1.771）均有不同程度的上調趨勢。Webb等[28]報道，多糖代謝轉運蛋白MsmEFGK屬于ABC超家族，其中msmK編碼ATP酶，msmE編碼溶質結合蛋白，msmF和msmG為膜蛋白。因此，多糖代謝轉運蛋白MsmEFGK可能參與了XOS的轉運過程。在其他轉運系統中，編碼MFS轉運體的相關基因araJ、lacY、mef、ydjE（FC值分別為2.1、1.365、1.268、1.22）表達上調而PTS代謝系統相關基因bglF下調，FC值為0.917。戚家明等[29]報道，P.acidilacticiBCC-1和B.lactisB1-04僅通過ABC轉運系統轉運XOS，而在W.confusaXU1菌株中MFS轉運蛋白參與XOS運輸，且MFS轉運蛋白利用質子動力驅動轉運過程。因此，B.pseudolongumJNFEN6可能主要通過ABC轉運系統和MFS轉運系統攝取XOS。

表3 XOS轉運及代謝相關基因Table 3 XOS transport and metabolism-related genes

XOS是由木糖基通過β-1,4糖苷鍵連接組成的低聚物。糖苷水解酶（EC 3.2.1.x）是一組廣泛的酶，可以水解兩種或多種碳水化合物之間的糖苷鍵[30]。轉錄組中涉及碳水化合物代謝主要差異表達基因如表3所示。與對照組相比，實驗組中編碼GH43糖苷水解酶家族的基因（xynB）顯著上調，其FC值為26.729。同時，XOS代謝相關水解酶xylA、xylB、abnA基因表達顯著上調，其FC值分別為48.168、20.318和2.719。通過KEGG數據庫查詢，XOS在GH43家族水解酶（xynB）的作用下水解為木糖，隨后在木糖異構酶（xylA）和木酮糖激酶（xylB）作用下轉化為5-磷酸-木酮糖。Zhao Lei等[31]對Pediococcus acidilacticiBCC-1進行轉錄組學分析發現，XOS利用相關酶包括木聚糖酶、木糖苷酶、木糖異構酶和木酮糖激酶。因此，水解酶在XOS代謝過程中具有比較重要的作用。

araA和araD基因的FC值分別為2.347和4.311，它們促進了D-木酮糖-5-磷酸的生成。同時，D-木酮糖-5-磷酸被進一步代謝為乳酸和乙酸。Pontonio等[32]研究L.rossiaeDSM 15814利用XOS、木聚糖、D-木糖等的能力發現，L.rossiaeDSM 15814中存在與XOS代謝相關的ara基因簇。其中，araA編碼L-阿拉伯糖異構酶，araD編碼磷酸核酮糖差向異構酶。這兩個基因共同參與L-阿拉伯糖轉化為D-木酮糖-5-磷酸的代謝途徑，與本研究結果趨勢一致。

雙歧桿菌采用“雙歧分流”的方式進行代謝。在該種代謝途徑中，XOS被轉化為己糖發酵途徑的中間體，并最終轉化為短鏈脂肪酸和其他有機化合物[33]。轉錄組中涉及短鏈脂肪酸生成的主要差異表達基因如表3所示。許多腸道細菌可以通過乙酰輔酶A由丙酮酸生成乙酸，同時也可以通過乳酸由丙酮酸生成乙酸[34]。轉錄組數據顯示，乙酸轉移酶（pta）和乙酸激酶（ackA）參與乙酰輔酶A和乙酸的轉化并顯著下調，而參與乳酸和乙酸轉化的乳酸脫氫酶（ldh）顯著上調。乳酸脫氫酶的較高表達說明B.pseudolongumJNFE6可能更加傾向于通過乳酸產生乙酸。細菌主要通過琥珀酸途徑產生丙酸。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc）在XOS干預后下調，FC值為0.817。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶受磷酸烯醇丙酮酸羧激酶控制。琥珀酸鹽是丙酸鹽的前體，在磷酸烯醇式丙酮酸激酶被抑制的條件下積累。因此，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶相關基因的下調有利于丙酸的生成[35]。在丁酸轉化過程中，3-羥基丁酰輔酶A脫水酶（HACD）上調，FC值為1.344。丁酸由丁酰輔酶A轉化而來，3-羥基丁酰輔酶A脫水酶促進了3-羥基丁酰輔酶A轉化為巴豆酰輔酶A，從而進一步生成丁酰輔酶A，有利于丁酸的生成。

2.8 real-time PCR驗證

在B.pseudolongumJNFE6發酵培養24、36、48 h后，對FC值分別為48.168和26.729的xylA和xynB基因進行real-time PCR驗證。結果表明，擴增曲線僅有一個尖峰，反應產物單一。

如圖10所示，xylA基因在不同發酵時間的相對表達量分別為8.15、18.6和13.2。xynB基因在不同發酵時間的相對表達量分別為7.8、13.1和10.8。基因表達顯著上調，與轉錄組結果一致。因此，轉錄組差異基因表達量具有可靠性。

圖10 real-time PCR驗證Fig.10 Real-time PCR verification

3 結論

首先，基于生長動力學、木糖苷酶活力、短鏈脂肪酸、透射電子顯微鏡等從多維度探究B.pseudolongumJNFE6高效利用XOS的機制。其次，基于轉錄組學對XOS干預后B.pseudolongumJNFE6差異表達基因進行分析，有136 個上調基因和161 個下調基因。這些基因主要集中在XOS的轉運和代謝過程中。XOS轉運過程中，ABC轉運系統和MFS轉運系統相關基因顯著上調；XOS代謝過程中，水解酶相關基因和乙酸、丙酸、丁酸代謝相關基因表達顯著變化。最后，通過real-time PCR驗證了轉錄組學數據的可靠性。