補料策略優化促進乳酸乳球菌HB03發酵合成Nisin

熊華儀，陳 曦，劉月鋒，陳 雄，李 沛，王 志,*

（1.湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵省部共建協同創新中心，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

乳酸乳球菌同型乳酸發酵過程中合成的乳酸鏈球菌素（Nisin）由34 個氨基酸組成[1]，其能有效抑制革蘭氏陽性菌（G＋）的生長，是一種安全、綠色的活性抗菌肽，被廣泛應用于食品發酵領域[2]。運用基因工程改造菌株有效提高了Nisin合成效率，Papagianni等[3]將黑曲霉A60的磷酸果糖激酶基因pfk13、編碼cAMP依賴型蛋白激酶pkaC和選擇性氧化酶aox1基因克隆至乳酸乳球菌ATCC11454，提高了其糖酵解活性并促進了菌株的氧化呼吸能力，Nisin效價達到14 000 IU/mL。Hao Panlong等[4]發現過表達天冬氨酸合成酶基因（asnH）可以使乳酸乳球菌F44在pH 3條件下的存活率提高7 倍，同時Nisin產量提高57%，達到5 346 IU/mL。然而基因工程菌應用于食品發酵存在一定的安全風險，運用發酵工程策略提高Nisin合成效率仍然具有一定的積極意義。

Nisin合成效率與氨基酸前體或多肽的供給有關[5]，并與乳酸乳球菌生長存在氮源競爭關系[6]。Nisin含有5 個脫水氨基酸殘基絲氨酸（serine，Ser）、蘇氨酸（threonine，Thr）和半胱氨酸（cysteine，Cys）合成的硫醚鍵[2]，因而Cys的合理供應是滿足高效Nisin發酵的基礎條件之一。另外，乳酸乳球菌厭氧發酵過程依然存在氧化脅迫效應[7]，Gaudu等[8]發現Cys作為還原劑能顯著增加乳酸乳球菌的存活率并減少氧化脅迫損傷而促進細胞生長[7]。而有關Cys對Nisin發酵合成和氧化應激的影響鮮見報道。

乳酸乳球菌的蛋白水解體系[9]包括壁膜蛋白酶PrtP、多肽轉運蛋白DtpP、胞內肽酶PepV[10]。該系統的表達受氮代謝全局調控子CodY負控制且主要受異亮氨酸的調節[11]。另外，Vido等[12]發現了不依賴于CodY的蛋白水解體系調控機制，乳酸乳球菌由發酵轉為呼吸代謝可強烈誘導蛋白水解體系中性內肽酶（PepO1）和氨肽酶C（PepC）的表達。

精氨酸（arginine，Arg）在乳酸乳球菌生長代謝過程中也發揮了重要作用，Arg經脫亞氨酶（arginine deiminase，ADI）途徑[13]分解，產生銨根和氨甲酰磷酸以及后續的分解產物CO2、銨根和ATP，這在細胞應對酸脅迫中發揮了重要作用[14]。乳酸乳球菌Arg代謝與嘧啶合成代謝也密切關聯[15-16]，調控蛋白ArgR阻遏arg操縱子表達，ΔargR菌株中Arg合成基因上調，同時尿嘧啶核苷酸（uridine monophosphate，UMP）從頭生物合成基因（pyrRPB、carA、pyrEC及pyrKDbF）表達也上調[15]。由于肽聚糖合成始于尿苷三磷酸（uridine triphosphate，UTP）和N-乙酰葡萄糖胺-1-P[9]，因而UTP的不足也可能導致細胞肽聚糖合成及生長受限[17]，甚至引起細胞在脅迫條件下自溶[18]，因此Arg在細胞能量供應、酸脅迫應激及UTP與肽聚糖合成方面發揮著重要作用，而有關Arg對乳酸乳球菌Nisin發酵合成效率的影響鮮見報道。

為了提高Nisin的合成效率，在10 L發酵罐水平研究碳氮源（糖、Cys、蛋白胨）的補料策略對Nisin合成的影響，分析Nisin合成關鍵時間節點前后轉錄組表達差異，并結合胞外氨基酸濃度變化規律，確定Arg為限制氨基酸，并優化補料策略，顯著提高Nisin發酵合成效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactisHB03），本實驗室保藏。

蛋白胨、酵母浸粉 安琪酵母股份有限公司；蔗糖（食用級）市售；K2HPO4·3H2O、NaCl、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3、H2SO4、HCl、蒽酮、檸檬酸銨（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；Nisin標準品（1 000 IU/mg）美國Sigma公司。

斜面種子培養基：15 g/L胰蛋白胨，15 g/L酵母浸粉，15 g/L牛肉膏，10 g/L葡萄糖，10 g/L CH3COONa，2 g/L Na2HPO4，2 g/L檸檬酸銨，10 g/L CaCO3，20 g/L瓊脂，pH 6.8。

搖瓶培養基：70 g/L蛋白胨，16 g/L蔗糖，10 g/L酵母浸粉，2 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L MnSO4·H2O，5 g/L檸檬酸銨，6 g/L CaCO3。

10 L發酵罐培養基：70 g/L蛋白胨，16 g/L蔗糖，10 g/L酵母浸粉，2 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L MnSO4·H2O，5 g/L檸檬酸銨。

1.2 儀器與設備

SPX-150D恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HNV-211B搖床 天津市歐諾儀器儀表有限公司；YXQ-75SII立式蒸汽滅菌鍋 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國Agilent公司；S-10生物傳感器儀 西爾曼科技有限公司；C J-2 D 凈化操作臺 天津泰斯特儀器有限公司；10 L機械攪拌通風發酵罐 上海保興生物設備有限公司；V-1300分光光度計 上海美析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將－80 ℃冰箱保存的乳酸乳球菌HB03甘油管接種于斜面種子培養基的平板，于30 ℃培養箱24 h后轉接茄子瓶，30 ℃培養24 h，無菌操作加入60 mL無菌水，并用無菌竹簽將菌苔挑起混合于無菌水中，得到種子液，備用。

1.3.2 搖瓶培養及10 L發酵罐實驗

搖瓶培養：裝液量為50 mL/250 mL發酵培養基，調節初始pH 6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min，每瓶按OD600nm=0.1接種。放置于30 ℃恒溫搖床間歇振蕩培養12 h（每小時工作30 s，轉速200 r/min，隨后調整轉速為0 r/min）。

10 L罐分批發酵：10 L發酵罐中裝量7 L發酵培養基，調整初始pH 6.8～7.0，121～123 ℃滅菌25 min；接種60 mL種子液，30 ℃、100 r/min不通氣培養20～24 h。

1.3.3 分析檢測

1.3.3.1 生物量（以細胞數計）測定

稀釋涂布平板法[19]。

1.3.3.2 總糖測定

參考硫酸-蒽酮法[20]。

1.3.3.3 乳酸測定

生物傳感儀[21]測定。

按式（1）計算：

1.3.3.5 Nisin效價測定

采用高效液相色譜法[22]測定。樣品處理：發酵液用鹽酸稀釋至pH 2.0～2.7[23]，12 000 r/min離心20 min，經0.45 μm濾膜過濾后備用。Nisin標準方程繪制：將0.25 g Nisin標準品稱取至50 mL容量瓶，使用0.01 mol/L鹽酸溶液（pH 2.0）定容，得到標準液（5 000 IU/mL），經0.45 μm濾膜過濾備用。色譜條件：流動相：水-乙腈（81∶19，V/V）混溶后加入0.05%三氟乙酸；流速1 mL/min；檢測波長200 nm；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。

1.3.3.6 H2O2濃度的測定

采用索萊寶公司試劑盒，按說明書方法檢測H2O2濃度。

1.3.3.7 游離氨基酸的測定

參考文獻[24]的方法進行測定。

1.3.4 轉錄組數據分析

取發酵15、18 h的發酵液20 mL于50 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，無菌操作留取菌體沉淀并－80 ℃保存。轉錄組測序由美吉生物科技有限公司完成。轉錄表達定量分析每百萬讀取次數中某個轉錄本占比（transcripts per million，TPM）值按照式（2）計算[25]：

式中：R、L為需計算基因的read counts和基因長度/kb；Ri、Li（i=1，2，…，n）為樣品中第i個基因的read counts和基因長度/kb。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 搖瓶水平Cys添加促進Nisin合成

Nisin是由34 個氨基酸組成的多肽，含有5 個硫醚橋（由Cys、Thr、Ser生成）[2]。因而，Cys是Nisin的重要前體氨基酸。另外，其作為含硫氨基酸還具有抵御氧化脅迫的作用[8]。因此，搖瓶水平考察了對數中期（16 h左右）添加不同濃度Cys對菌株HB03合成Nisin的影響，如圖1所示。16 h添加0.15～0.6 mmol/L的Cys在24 h的Nisin效價較對照（未添加Cys）分別提升7.9%～20%。顯然，Cys的添加促進了Nisin的生成。Cys添加量為0.6 mmol/L時Nisin效價為6 457 IU/mL。但隨著Cys的添加量增多Nisin效價呈下降趨勢，當添加量為0.75 mmol/L和0.9 mmol/L時，Nisin效價分別為6 140 IU/mL和5 862 IU/mL，也較對照提高14.8%和9%。綜上Cys添加量0.6 mmol/L為最優，提高效價幅度達到20%。

圖1 搖瓶中Cys濃度對Nisin合成的影響Fig.1 Effect of Cys concentration on nsin production in shake flask culture

2.2 10 L發酵罐水平Cys添加促進Nisin合成

雖然發酵過程是靜置（搖瓶）和未通空氣的攪拌狀態（10 L罐），但是發酵體系存在空氣接觸過程，乳酸乳球菌通過乳酸氧化酶LOX途徑[26-27]、NADH氧化途徑[28]等把氧氣消耗，但同時產生了H2O2，而乳酸乳球菌是接觸酶陰性菌株，因而細胞生長過程伴隨著氧化脅迫發生[29-30]。由于Nisin合成與生長偶聯[7]，為了降低氧化脅迫效應以及維持細胞生長效率，在罐上將Cys的添加策略調整為對數期及其穩定期（11、13.5、18、23.5 h每次添加0.15 mmol/L，總計0.6 mmol/L）。10 L罐水平Cys添加策略（終濃度0.6 mmol/L，策略1#）對乳酸乳球菌HB03生長代謝的影響如圖2所示。

圖2 Cys補料策略1#對Nisin合成的影響Fig.2 Effect of Cys supplementation strategy 1# on nisin synthesis

細胞生長至18 h達到峰值（1.43×1010CFU/mL），而后自溶至21 h的1.16×1010CFU/mL并維持穩定。總糖由15.8 g/L緩慢消耗至14.62 g/L（9 h）后迅速消耗至1.75 g/L（21 h）。Nisin合成于15 h達到峰值（6 993 IU/mL）后迅速分解。同時，細胞對數早期（9 h）H2O2為0.87 mmol/L，這與文獻[30-31]氧化脅迫伴隨著細胞生長過程的報道一致。前9 h細胞生長啟動較慢（糖耗也較低）可能也與細胞調整代謝以適應氧化脅迫過程有關。在細胞對數生長早期（11 h）添加Cys（0.15 mmol/L）使H2O2迅速降至0.18 mmol/L，在15 h降至0 mmol/L并維持至發酵結束。說明Cys少量多次添加方式對消除H2O2有效。

Cys消除H2O2使細胞生長加速，18 h細胞數為1.43×1010CFU/mL，平均生長速率為7.9×108CFU/（mL·h），是前9 h生長速率（3×108CFU/（mL·h））的2.6 倍。Nisin合成偶聯細胞生長至15 h達到峰值（6 993 IU/mL），15～18 h細胞繼續生長，但Nisin處于被降解的狀態，也印證了Nisin合成與細胞生長對氮源存在競爭關系的報道[10]。此時，Nisin可能作為一種胞外多肽的儲備分子，其被降解可能也是細胞維持活性的一種生存策略。由于15 h后H2O2濃度為0 mmol/L，因而Nisin的降解可能與其他未知因素有關，并調整Cys補加策略為：11 h和13.5 h分別加入0.15 mmol/L Cys。

2.3 Nisin對數后期降解前后轉錄組水平基因表達差異分析

1#策略發酵15～18 h期間，Nisin以221.6 IU/（mL·h）的速率迅速降解，但細胞數卻提高了30%，達到了1.43×1010CFU/mL。即15～18 h是Nisin合成和細胞生長競爭的關鍵節點，因此，在轉錄組水平研究了15～18 h相關基因轉錄差異，包括肽酶相關基因、UMP從頭合成途徑基因、肽聚糖合成相關基因等，其顯著差異基因如圖3所示。

圖3 15 h與18 h相關基因表達差異Fig.3 Differential expression of related genes at 15 and 18 h

pepO、pepT、pepA、pepF、pepC、pepV等胞內肽酶表達相關基因分別上調12%～24%，說明發酵15～18 h肽酶表達上升，強化了蛋白、多肽（含Nisin）的分解以用于生長。同時，18 h細胞UMP從頭合成途徑合成基因（pyrF、carA、carB、pyrR等）顯著上調至2～4 倍，而18 h后細胞大量自溶，這可能與UMP合成（或合成前體）不足有關。而肽聚糖合成相關基因（murA、murB、murG等）以及與肽聚糖聚合的LysM蛋白相關基因（HZ322_08250、HZ322_02250）表達也均上調10%～27%。這與文獻[15,32]報道一致。說明UMP合成前體氨甲酰磷酸可能處于限制狀態，使得UMP、UTP供應不足，進而影響肽聚糖前體二磷酸尿苷葡萄糖的合成。細胞通過大幅上調UMP合成途徑與肽聚糖合成相關基因以期滿足細胞需求。

氨甲酰磷酸在Arg ADI途徑中產生[13]，說明18 h不僅氨甲酰磷酸可能缺乏，同時Arg也處于限制狀態。因而，細胞為尋求Arg的及時補充，肽酶相關表達也上調12%～24%。這與含硫氨基酸或Arg的缺乏導致肽酶表達增強[9]的報道一致，細胞需要大量分解多肽以響應含硫氨基酸的缺乏，以及通過ADI途徑降解Arg緩解UMP合成壓力和應對酸脅迫壓力。Nisin作為一種胞外的多肽“儲備分子”，在細胞存在生存壓力而加強肽酶表達時必然會被大量的降解。因此15～18 h細胞仍能持續生長，但Nisin效價下降。

2.4 基于轉錄組分析的Nisin補料策略優化

Nisin合成與細胞生長對氮源存在競爭關系[10]說明氮源的供應不足，因而，發酵過程中補加氮源（蛋白胨等）能緩解細胞對氮源的需求，也可作為前體直接用于Nisin合成；而Arg具有氮源和能源分子的雙功能，也是需要考慮的因素。另外，蔗糖作為發酵過程唯一的碳源，適宜的流加也是必要的。補加碳氮源時間以及氨基酸對Nisin合成影響的設計如表1所示。

表1 10 L發酵罐上補料策略設計Table 1 Design of feeding strategy in a 10 L bioreactor

在補加Cys（11、13.5 h分別加入0.15 mmol/L Cys）的前提下，考慮到細胞自溶和Nisin降解同時發生，以及策略1# 9～18 h的平均糖耗速率為1.42 g/（L·h），確定策略2#為15 h補入蛋白胨（15 g/L）（1.5 g/（L·h）），其對乳酸乳球菌HB03代謝以及Nisin合成的影響如圖4所示。

圖4 策略2#對細胞生長代謝的影響Fig.4 Effect of strategy 2# on cell growth and nisin production in a 10 L bioreactor

Nisin 迅速合成至21 h 效價達到峰值，為8 042 IU/mL，較1#策略提高15%，后迅速分解。其_vq為383 IU/（mL·h）。10 h開始補糖以及15 h補加的蛋白胨使生物量在18～24 h穩定，總糖由15.8 g/L降至10.33 g/L（10 h），10～24 h殘糖穩定維持在8～11 g/L之間。

以上結果說明，碳氮源的持續補加為乳酸乳球菌HB03生長以及Nisin合成起著積極作用，15 h補入蛋白胨使Nisin持續合成，但21 h Nisin合成達到峰值后依然以較快的速率降解。考慮到蛋白胨體系中可能存在氨基酸比例不平衡的問題，因此對策略2#細胞生長和Nisin主合成期（10～24 h）胞外氨基酸進行了測定，如表2所示。

表2 策略2#中胞外14 種氨基酸隨時間的變化Table 2 Changes in concentrations of 14 extracellular amino acids in strategy 2#

Arg發酵過程均未檢出，說明Arg是一種嚴重缺少的限制氨基酸。Arg參與ADI途徑產能、緩解胞內pH值下降引起的酸脅迫、滿足細胞生長、參與嘧啶合成[33]。因而，Arg的嚴重不足導致嘧啶途徑表達的大量上調，與轉錄組基因差異結果一致，需要適量補充。

另外，胱氨酸發酵全過程質量分數穩定維持0.015%～0.025%，氧化條件下Cys會轉化為胱氨酸，考慮添加的Cys可能不足，所以在策略2#的基礎上17、19.5 h分別加入0.15 mmol/L Cys。12～15 h為614 IU/（mL·h），15～18 h為356 IU/（mL·h），從Nisin合成速率看12～15 h速率更快，所以將蛋白胨（15 g/L）補充時間提前至12 h，形成策略3#（11、13.5、17、19.5 h分別加入0.15 mmol/L Cys，10 h補蔗糖（1.5 g/（L·h））以及12 h補充蛋白胨（15 g/L）。其對乳酸乳球菌HB03代謝以及Nisin合成的影響如圖5所示。

圖5 策略3#對細胞生長代謝的影響Fig.5 Effect of strategy 3# on cell growth and nisin production in a 10 L bioreactor

細胞在10 h已經進入對數期，持續生長至15 h穩定后，于21 h生物量達到峰值，為1.20×1010CFU/mL，為1#策略的84%，后自溶。殘糖由0 h的15.8 g/L迅速下降至10 h的11.32 g/L，10～24 h緩慢利用至9.18 g/L。Nisin合成在18 h達到峰值，為8 311 IU/mL，較1#策略提高18.8%，后迅速降解。其為461.7 IU/（mL·h），較2#策略提高20%。3#策略與2#策略相比，Nisin峰值效價差別較小，但達到Nisin效價峰值的時間點有所偏移，提前加入蛋白胨提前了Nisin的合成峰值時間。顯然，加大含硫氨基酸的濃度以及提前蛋白胨的添加時間對于細胞來說雖然效價無明顯提升，卻提高了Nisin合成的速率。然而Nisin效價達到最高后仍然迅速分解，18～24 h Nisin以589.3 IU/（mL·h）的速率迅速降解。

細胞通過ADI途徑獲得能量、升高胞內pH值。ADI中間產物-氨甲酰磷酸可以作為前體進入嘧啶代謝，進而可能緩解細胞肽聚糖合成不足導致的細胞自溶以及肽酶大量表達等影響。因此需要確定Arg對Nisin合成的影響，如圖6所示。

圖6 搖瓶中Arg質量濃度對Nisin合成的影響Fig.6 Effect of different concentrations of Arg on nisin production in shake flask culture

搖瓶水平21 h添加1.5、1.8、2.5、3 g/L的Arg，在24 h較對照（未添加Arg）Nisin效價分別提升16%、23%、35%、29%。顯然，添加Arg顯著促進了Nisin的生成，以2.5 g/L最佳。在策略3#的基礎上12～21 h加入Arg 0.25 g/（L·h），形成策略4#。其對乳酸乳球菌HB03代謝以及Nisin合成的影響如圖7所示。

圖7 策略4#對細胞生長代謝的影響Fig.7 Effect of strategy 4# on cell growth and nisin production in a 10 L bioreactor

細胞在10 h已經進入對數期，持續生長至15 h達到1.32×1010CFU/mL，后15～24 h維持穩定，其中生物量峰值為1.50×1010CFU/mL（20 h），較策略3#提高25%。殘糖由0 h 15.8 g/L迅速下降至10 h 10.48 g/L，補糖后10～24 h保持在9～10 g/L之間。Nisin合成在17 h達到峰值，為8 963 IU/mL，較策略3#提高8%，17～21 h的Nisin以342.5 IU/（mL·h）速率降解，為策略3#的58%。而21 h后Arg不再流加，21～24 h Nisin降解速率恢復至686 IU/（mL·h），較17～21 h提高100%。說明Arg可大幅度延緩Nisin的降解速率，后續可增大添加量以持續促進Nisin合成和細胞生長。

3 結論

乳酸乳球菌HB03發酵合成Nisin過程存在氧化脅迫（9 h的H2O2為0.87 mmol/L），10 L罐發酵過程分4 次添加Cys（11、13.5、18、23.5 h分別加入0.15 mmol/L）降低了H2O2濃度，加速了細胞的生長，促進了Nisin合成，達到6 993 IU/mL。通過分析胞外氨基酸消長規律和肽水解酶系、UMP從頭合成、肽聚糖合成代謝在轉錄組水平的表達差異，確定了對數中后期Nisin合成限制因素為碳氮源及Arg供應不足，并通過氨基酸單因素和碳氮源補加優化，確定了10 L發酵罐水平優化的補料策略。在此條件下Nisin效價達到8 963 IU/mL，比只補加Cys發酵效價（6 993 IU/mL）提高了28.2%，也比優化前效價（5 349 IU/mL，資料未顯示）提高了67%。