紫色辣椒HN191與二荊條的比較代謝組分析

譚華強(qiáng)，鐵曼曼，李麗平，魯榮海，潘紹坤，唐有萬(wàn),*

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130；2.蘆山縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 雅安 625600）

辣椒是茄科辣椒屬的一年生或多年生草本植物，原產(chǎn)于中南美洲，大約在16世紀(jì)后期傳到中國(guó)，是一種重要的蔬菜作物[1]。近年來(lái)我國(guó)辣椒種植面積穩(wěn)定在210萬(wàn) 公頃以上，成為中國(guó)種植面積最大的蔬菜，總產(chǎn)量達(dá)6 400多萬(wàn)噸，產(chǎn)值2 500億 元，在脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興方面發(fā)揮重要的作用[2]。

顏色是辣椒果實(shí)的重要外觀和品質(zhì)特征。辣椒果實(shí)具有豐富的顏色，并且顏色會(huì)在果實(shí)的不同發(fā)育階段發(fā)生變化。在未成熟時(shí)期，辣椒果實(shí)的顏色主要有白色、綠色、紫色和黑色，隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸變?yōu)辄S色、橙色、紅色和棕色[3-4]。研究表明，辣椒果實(shí)的顏色主要取決于葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮及花青素的類(lèi)型和含量[5]。

代謝組學(xué)綜合定性和定量的方法檢測(cè)生物系統(tǒng)內(nèi)所有代謝物，包括某一生化途徑的底物或代謝產(chǎn)物，因此是分析細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的有力工具[6-7]。核磁共振、氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）是用于代謝組分析的常規(guī)技術(shù)[8]。LC-MS目前在代謝組學(xué)研究中備受青睞，因?yàn)樗闪艘合嗌V的色譜能力和質(zhì)譜儀器提供的高靈敏度、準(zhǔn)確性和豐富的結(jié)構(gòu)信息[9]。近年來(lái)，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于辣椒果實(shí)代謝物的研究中[10-15]。然而，目前對(duì)于紫色辣椒果實(shí)顏色相關(guān)的代謝組分析報(bào)道仍然很少。

隨著生活水平不斷提高，富含花青素的紫色蔬菜越來(lái)越受到關(guān)注。自然界中大部分辣椒的未熟果均為綠色或淺綠色，少數(shù)辣椒材料的未熟果中有花青素積累，呈現(xiàn)紫色。HN191是本課題組選育的朝天椒材料，未熟果呈紫色、老熟果呈紅色，于2020年通過(guò)四川省非主要農(nóng)作物品種認(rèn)定委員會(huì)認(rèn)定。二荊條辣椒是四川著名地方品種，其未熟果為綠色，老熟果為紅色。本研究采用基于LC-MS的非靶向代謝組學(xué)方法，研究HN191和二荊條在果實(shí)未熟期和老熟期代謝物種類(lèi)和含量的變化，為優(yōu)良辣椒品種的選育及開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以課題組選育的紫色辣椒新材料HN191，以及二荊條品種為研究對(duì)象。挑選飽滿的辣椒種子，浸種8 h，然后放置在濕紗布上進(jìn)行催芽。待種子露白后播種于育苗穴盤(pán)中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度26 ℃，16 h光照、8 h黑暗。苗期結(jié)束將幼苗移栽至成都市農(nóng)林科學(xué)院羊馬基地大棚，進(jìn)行常規(guī)田間管理。在開(kāi)花結(jié)果期從植株中上部取花后30 d（未熟果）和60 d（老熟果）的果實(shí)，用小剪刀將樣品剪切為100 mg的若干份，液氮速凍后，保存于－80 ℃超低溫冰箱中備用。

甲醇、乙腈（均為色譜純）默克化工技術(shù)（上海）有限公司；L-2-氯苯丙氨酸（純度≥98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜純）日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity I-Class PLUS液相色譜儀、Xevo G2-XS QTOF高分辨質(zhì)譜儀、Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）美國(guó)沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝物提取

取紫色辣椒材料HN191花后30、60 d的果實(shí)（簡(jiǎn)稱(chēng)為HN30、HN60），以及二荊條花后30、60 d的果實(shí)（簡(jiǎn)稱(chēng)為EJT30、EJT60），共4 組樣本，每組6 個(gè)果實(shí)（即6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)），合計(jì)24 個(gè)果實(shí)樣品進(jìn)行代謝組測(cè)定。取100 mg辣椒果實(shí)樣品，加入1 mL含內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸的提取液（甲醇、乙腈、水體積比2∶2∶1，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度20 mg/L），渦旋混勻30 s。加入鋼珠，45 Hz研磨儀處理10 min，超聲10 min（冰水浴）。－20 ℃靜置1 h，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取出500 μL上清液于另一干凈的EP管中，真空濃縮，加入160 μL提取液（乙腈、水體積比1∶1）復(fù)溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取120 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶，從每個(gè)樣品中各取10 μL混合成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 色譜條件

使用Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL/min，流動(dòng)相A為水溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸），B為乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸），進(jìn)樣體積為2 μL。梯度洗脫條件同張文友等[16]的方法。

1.3.3 質(zhì)譜條件

使用正離子模式結(jié)合負(fù)離子模式，優(yōu)化后的參數(shù)：毛細(xì)管電壓2 500 V（正離子模式）或－2 000 V（負(fù)離子模式），錐孔電壓30 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，反吹氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，m/z采集范圍50～1 200。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用MassLynx V4.2采集原始數(shù)據(jù)，通過(guò)Progenesis QI軟件進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊、歸一化、譜圖解析等步驟，代謝物的鑒定來(lái)源于在線METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)及百邁客自建庫(kù)。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析區(qū)分各組間代謝的總體差異。以O(shè)PLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）＞1，差異顯著性P值（P＜0.05）以及含量差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）（|FC|＞2）為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物，進(jìn)行層次聚類(lèi)分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析[17-18]。整個(gè)流程在百邁客云平臺(tái)（https://www.biocloud.net/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC分析

QC分析是評(píng)價(jià)基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量與可靠性的重要環(huán)節(jié)[19]。本研究的QC樣本由每個(gè)樣品各取10 μL混合組成，通過(guò)檢測(cè)得到正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜總離子流（total ion current，TIC）重疊圖（圖1）。可見(jiàn)QC樣本總離子流重疊性好，峰分離度高，表明儀器穩(wěn)定性較好，得出的數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。

圖1 QC樣本的總離子流重疊圖Fig.1 Overlapping TIC chromatograms of QC samples

2.2 PCA結(jié)果

對(duì)24 個(gè)樣本進(jìn)行代謝組定性和定量分析，在正、負(fù)離子模式下共檢測(cè)到了20 733 個(gè)峰，其中注釋到3 439 個(gè)代謝物。PCA是一種無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別的多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，通過(guò)將原有復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行重新線性組合，形成一組新的綜合變量，使其盡可能多地反映原有變量的信息，從而達(dá)到降維目的[20]。對(duì)EJT30、EJT60以及HN30、HN60四個(gè)分組共24 個(gè)樣品檢測(cè)出的所有代謝物進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖2所示。PC1的貢獻(xiàn)率為36.97%，PC2的貢獻(xiàn)率為14.71%，2 種PC貢獻(xiàn)率之和為51.68%，表明2 個(gè)PC基本能夠反映辣椒果實(shí)樣品的主要特征信息。QC樣本緊密聚集在中心位置，進(jìn)一步表明檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性較好，所獲數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。4 組辣椒果實(shí)樣品被明顯分為4 個(gè)區(qū)域，沒(méi)有重疊，表明2 個(gè)品種未熟果和老熟果之間的代謝物差異顯著。同時(shí)每組組內(nèi)樣品均聚集在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明組內(nèi)樣品的重復(fù)性較好。

圖2 HN191和二荊條30、60 d果實(shí)代謝組的PC得分圖Fig.2 PCA score plot of metabolomes from Erjingtiao and HN191 at 30 and 60 days after anthesis

2.3 OPLS-DA結(jié)果

PCA法雖能夠有效提取主要信息，但是對(duì)于相關(guān)性較小的變量不敏感。為了突出組間差異，便于后續(xù)尋找差異成分，采用OPLS-DA法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[17]。HN30 vs EJT30、HN60 vs EJT60、HN60 vs HN30三個(gè)分組全部樣品都位于置信區(qū)間內(nèi)，并且兩兩之間區(qū)分明顯，表明彼此之間具有顯著差異（圖3）。參數(shù)和都大于0.98，置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示擬合回歸線斜率為正，且從左到右大部分紅色點(diǎn)均低于藍(lán)色點(diǎn)，說(shuō)明評(píng)估模型沒(méi)有發(fā)生過(guò)擬合。以上結(jié)果表明OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠，可根據(jù)VIP值分析篩選差異代謝物。

圖3 3 個(gè)辣椒果實(shí)比對(duì)組的OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗(yàn)圖（B）Fig.3 OPLS-DA score (A) and permutation test plots (B) of comparison groups of three peppers

2.4 差異代謝物鑒定

基于OPLS-DA模型，以VIP＞1、|FC|＞2以及P＜0.05為閾值篩選差異代謝物。結(jié)果在HN30 vs EJT30組（EJT30為對(duì)照）中鑒定出1 065 個(gè)差異代謝物，其中551 個(gè)上調(diào)，514 個(gè)下調(diào)。在HN60 vs EJT60組（EJT60為對(duì)照）鑒定出1 010 個(gè)差異代謝物，其中641 個(gè)上調(diào)，369 個(gè)下調(diào)。在HN60 vs HN30組（HN30為對(duì)照）鑒定出1 487 個(gè)差異代謝物，其中650 個(gè)上調(diào)，837 個(gè)下調(diào)。這些差異代謝物主要包括其他次級(jí)代謝物合成、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、萜類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物代謝、脂類(lèi)代謝、碳水化合物代謝、核苷酸代謝七大類(lèi)（圖4A）。

圖4 3 個(gè)辣椒果實(shí)比對(duì)組的差異代謝產(chǎn)物數(shù)量統(tǒng)計(jì)和分類(lèi)（A）以及Venn圖（B）Fig.4 Statistics and classification plot (A),and Venn diagram (B) of differential metabolites in comparison groups of three peppers

2.5 差異代謝物聚類(lèi)分析

為了更直觀地展示代謝物在不同樣品之間的變化情況，對(duì)HN30 vs EJT30、HN60 vs EJT60、HN60 vs HN30三個(gè)比對(duì)組的差異代謝物含量進(jìn)行層次聚類(lèi)分析（圖5）。顏色表示含量，綠色表示含量下調(diào)，紅色表示含量上調(diào)。橫向是代謝物的聚類(lèi)，聚類(lèi)枝越短代表相似性越高，聚在一簇的代謝物具有相似功能或共同參與同一代謝途徑。縱向是樣品的聚類(lèi)，每個(gè)品種在30 d或60 d大小的果實(shí)樣品均聚為一類(lèi)，且差異代謝物含量非常接近，表明組內(nèi)樣品重復(fù)性較好。而差異代謝物在3 個(gè)比對(duì)組兩兩之間的含量差別較大，說(shuō)明彼此之間存在較大差異。該結(jié)果與PCA結(jié)果（圖2）基本一致。

圖5 3 個(gè)辣椒果實(shí)比對(duì)組的差異代謝物聚類(lèi)分析Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites in comparison groups of three peppers

2.6 差異代謝物富集分析

KEGG富集作為一種功能分析方法，能從海量數(shù)據(jù)中挖掘顯著富集的代謝通路，從而詮釋其生物學(xué)意義[20]。利用clusterProfiler選用超幾何檢驗(yàn)的方法對(duì)差異代謝物KEGG的注釋結(jié)果進(jìn)行富集分析，并繪制柱形圖[21]。圖6展示了3 個(gè)比對(duì)組中P值最小的前20 個(gè)富集通路。在HN30 vs EJT30組，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋456 個(gè)差異代謝物，包含差異代謝物最多的前5 條KEGG通路分別是吲哚生物堿生物合成（ko00901）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器（ko02010）、黃酮與黃酮醇生物合成（ko00944）、各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成（ko00999）、苯丙烷生物合成（ko00940）。在HN60 vs EJT60組，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋450 個(gè)差異代謝物，包含差異代謝物最多的前5 條KEGG通路分別是類(lèi)黃酮生物合成（ko00941）、黃酮和黃酮醇生物合成（ko00944）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器（ko02010）、異黃酮生物合成（ko00943）、氨基糖和核苷酸糖代謝（ko00520）。在HN60 vs HN30組，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋630 個(gè)差異代謝物，包含差異代謝物最多的前5 條KEGG通路分別是異喹啉生物堿生物合成（ko00950）、卟啉代謝（ko00860）、各種植物次生代謝物的生物合成（ko00999）、黃酮和黃酮醇生物合成（ko00944）、花青素生物合成（ko00942）。

圖6 3 個(gè)辣椒果實(shí)比對(duì)組差異代謝物的KEGG通路富集圖Fig.6 KEGG pathway enrichment map of differential metabolites in comparison groups of three peppers

2.7 類(lèi)黃酮相關(guān)差異代謝物

從KEGG富集結(jié)果可以看出，3 個(gè)辣椒果實(shí)比對(duì)組的差異代謝物均富集到類(lèi)黃酮相關(guān)的通路。類(lèi)黃酮是一種重要的次生代謝物，廣泛參與植物的生理過(guò)程以及花、果實(shí)和種子顏色的形成[22]。因此，挑選出3 個(gè)比對(duì)組類(lèi)黃酮相關(guān)通路的差異代謝物繪制其含量熱圖（圖7）。

圖7 3 個(gè)辣椒果實(shí)比對(duì)組在類(lèi)黃酮相關(guān)代謝通路的差異代謝物含量熱圖Fig.7 Heatmap of differential metabolites related to flavonoid biosynthesis pathway from comparison groups of three peppers

在類(lèi)黃酮生物合成通路中，總共有28 個(gè)差異代謝物，其中二氫楊梅素、綠原酸、根皮苷、芹菜酚、柚皮素等21 種代謝物在HN191的30、60 d果實(shí)中的含量均高于二荊條。

在異黃酮生物合成通路中，總共有21 個(gè)差異代謝物。與二荊條30 d果實(shí)相比，HN30中的5-羥基擬人參皂苷元、丙二酰染料木素、甘果素等16 種代謝物含量明顯較高，其余5 種代謝物含量較低。與二荊條60 d果實(shí)相比，HN60中的大豆黃酮苷、芒柄花素苷、大豆黃素苷等16 種代謝物含量明顯較高，其余5 種代謝物含量較低。

在花青素生物合成通路中，總共有25 個(gè)差異代謝物。與二荊條30 d果實(shí)相比，HN30果實(shí)中的飛燕草素、矢車(chē)菊素3-O-β-D-桑布糖苷、天竺葵素3-葡萄糖苷5-咖啡酰葡萄糖苷等11 種代謝物含量明顯較高，其余14 種代謝物含量較低。與二荊條60 d果實(shí)相比，HN60中的天竺葵素3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素3-O-蕓香糖苷5-O-β-D-葡萄糖苷、飛燕草素5-O-β-D-葡萄糖苷3-O-β-D-桑布糖苷等13 種代謝物含量明顯較高，其余12 種代謝物含量較低。

在黃酮與黃酮醇生物合成通路中，總共有35 個(gè)差異代謝物。與二荊條30 d果實(shí)相比，HN30中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷、蕓香苷等16 種代謝物含量明顯較高，其余19 種代謝物含量較低。與二荊條60 d果實(shí)相比，HN60中的槲皮素3-O-葡萄糖苷、木犀草素7-O-葡糖苷酸、紫云英苷等19 種代謝物含量明顯較高，其余16 種代謝物含量較低。

與HN30相比，在HN60中上述4 個(gè)通路中分別有10、19、11 個(gè)和9 個(gè)代謝物含量出現(xiàn)上調(diào)，其余代謝物則出現(xiàn)下調(diào)。

3 討論

3.1 2 個(gè)品種果實(shí)在不同發(fā)育期的差異

HN191和二荊條在果形、果色（主要是未熟果顏色）、單果質(zhì)量等方面存在明顯差異。HN191是朝天椒，單果質(zhì)量約4 g。二荊條是線椒，單果質(zhì)量約10 g。本研究分析HN191和二荊條在花后30、60 d果實(shí)的代謝組。PCA結(jié)果顯示，2 個(gè)品種得到明顯區(qū)分，沒(méi)有重疊。差異代謝物含量的熱圖也顯示2 個(gè)品種果實(shí)之間的代謝物含量差異明顯。不同辣椒品種，特別是不同果型品種之間，果實(shí)代謝物差異較大，比如牛角形和圓珠形辣椒[13]。不同果色的品種之間，代謝物差異也較大，比如黃燈籠辣椒和紅燈籠辣椒、紅色雞澤辣椒和橙紅色韓國(guó)辣椒[14-15]。這些報(bào)道與本研究結(jié)果一致。

在同一辣椒品種果實(shí)不同發(fā)育階段，也存在較大的代謝組差異。辣椒果實(shí)在發(fā)育和成熟過(guò)程中會(huì)在顏色、香氣、營(yíng)養(yǎng)成分和軟化方面發(fā)生重大變化。這些變化的發(fā)生是由于各種生化和生理過(guò)程的改變，包括基因表達(dá)、酶活性改變和代謝物合成[23-24]。HN30和HN60的PCA結(jié)果顯示，不同發(fā)育期的果實(shí)被明顯區(qū)分。代謝物含量熱圖也顯示HN30和HN60代謝物的含量差異明顯。在一些報(bào)道中也得到相似的結(jié)果[10-11,13]，表明辣椒果實(shí)在成熟過(guò)程中代謝物發(fā)生劇烈變化。

3.2 類(lèi)黃酮差異代謝物

根據(jù)VIP＞1、|FC|＞2以及P＜0.05為閾值，在HN30 vs EJT30、HN60 vs EJT60、HN60 vs HN30三個(gè)比對(duì)組分別鑒定出1 065、1 010、1 487 個(gè)差異代謝物。KEGG富集分析表明，這些差異代謝物均富集到類(lèi)黃酮相關(guān)的通路。類(lèi)黃酮是一種酚類(lèi)次生代謝物，廣泛存在于谷物、水果、蔬菜、茶葉中。由于其具有抗氧化、抗炎、抗誘變和抗癌的特性，以及調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞酶功能的能力，對(duì)人體健康有益，成為各種營(yíng)養(yǎng)保健品、藥品和化妝品中不可或缺的成分[25]。現(xiàn)已從各種植物中分離出5 000多種不同植物來(lái)源的類(lèi)黃酮[26]。類(lèi)黃酮分為幾個(gè)亞組，包括黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇、異黃酮、花青素[27]。

辣椒果實(shí)具有豐富的顏色，顏色差異主要是由于類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素的積累不同所致[28]。在之前的研究中，已經(jīng)報(bào)道了一些從辣椒果實(shí)中鑒定的黃酮類(lèi)化合物。Jang等[11]對(duì)辣椒“CM334”果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的次級(jí)代謝物進(jìn)行分析，鑒定出8 種黃酮類(lèi)化合物，其在果實(shí)發(fā)育早期階段（花后16 d和25 d）含量較高，然后逐漸下降。Mi Si等[15]分析雞澤辣椒和韓國(guó)辣椒成熟果實(shí)的代謝組，發(fā)現(xiàn)韓國(guó)辣椒上調(diào)最高的10 種代謝物中，有7 種黃酮類(lèi)化合物。本研究在2 個(gè)辣椒品種中也鑒定出槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素、柚皮素及其衍生物等黃酮類(lèi)物質(zhì)。

Liu Yuhua等[12]為探究辣椒果實(shí)顏色形成的機(jī)理，對(duì)4 種不同顏色的辣椒品種代謝組和轉(zhuǎn)錄組譜進(jìn)行分析，其中CJ12-17-1（圓錐椒、30 d為紫色、50 d為紅色）和0622-1-3-2-1-3-1（線椒、30 d為綠色、50 d為紅色）兩個(gè)品種，與本研究的材料最為接近；2 個(gè)品種在30 d和50 d鑒定出的大多數(shù)差異類(lèi)黃酮代謝物均在CJ12-17-1中含量更高。本研究結(jié)果與之類(lèi)似，在類(lèi)黃酮生物合成和異黃酮生物合成通路中，2 個(gè)品種之間的多數(shù)差異類(lèi)黃酮代謝物也在紫色辣椒HN191中的含量更高，這些結(jié)果表明紫色辣椒類(lèi)黃酮物質(zhì)含量更加豐富。

3.3 花青素差異代謝物

花青素作為一種重要的色素，在未成熟辣椒果實(shí)顏色形成中起著至關(guān)重要的作用。花青素的積累導(dǎo)致未成熟辣椒果實(shí)呈現(xiàn)紫黑色[5]。在紫色辣椒果實(shí)中被鑒定出的花青素主要是飛燕草素及其衍生物[29-31]。在本研究中，從HN30 vs EJT30、HN60 vs EJT60、HN60 vs HN30三個(gè)比對(duì)組中總共鑒定出花青素合成通路的25 個(gè)差異代謝物，包括6 種飛燕草素衍生物、6 種矢車(chē)菊素衍生物、8 種天竺葵素衍生物。與二荊條30 d果實(shí)相比，3 種飛燕草素衍生物，飛燕草素、飛燕草素-3-(P-酰基)-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、飛燕草素3-葡萄糖苷5-咖啡酰葡萄糖苷；2 種矢車(chē)菊素衍生物，矢車(chē)菊素3-O-蕓香糖苷5-O-β-D-葡萄糖苷和矢車(chē)菊素3-O-β-D-桑布糖苷；2 種天竺葵素衍生物，天竺葵素3-葡萄糖苷5-咖啡酰葡萄糖苷和天竺葵素3-O-β-D-桑布糖苷在HN30中含量較高。飛燕草素、矢車(chē)菊素、天竺葵素衍生物在HN191未熟果中的大量積累使其呈現(xiàn)紫色，這與Liu Yuhua等[12]的報(bào)道基本一致。此外，紫色辣椒的花青素含量在花后20～30 d的果實(shí)中達(dá)到最大值，而在果實(shí)成熟后降解[30,32]。在HN191果實(shí)成熟過(guò)程中（即HN60 vs HN30），上述7 種代謝物的含量明顯下降，與果實(shí)花青素的積累與降解模式一致。

4 結(jié)論

本研究使用基于LC-MS的非靶向代謝組學(xué)分析方法，研究紫色辣椒材料HN191和二荊條在未熟期和成熟期果實(shí)中的差異代謝物，并對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)在類(lèi)黃酮生物合成和異黃酮生物合成通路中的多數(shù)差異類(lèi)黃酮代謝物在紫色辣椒HN191中的含量更高。另外在花青素生物合成通路中發(fā)現(xiàn)的7 種飛燕草素、矢車(chē)菊素、天竺葵素衍生物在HN191未熟果中大量積累，可能是紫色辣椒HN191花青素合成的關(guān)鍵代謝物。這些結(jié)果表明，紫色辣椒除了花青素含量高以外，黃酮類(lèi)物質(zhì)含量也更加豐富，適合進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用。在后期研究中，還需要在非靶向代謝組學(xué)的基礎(chǔ)上，利用靶向代謝組學(xué)對(duì)紫色辣椒中的類(lèi)黃酮代謝物作進(jìn)一步的定性和定量研究。