沼澤生紅冬孢酵母類胡蘿卜素合成條件的優(yōu)化

周 可，張峰峰，趙 瓊，田 陽(yáng)，謝鳳行，趙玉潔

（天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，天津 300384）

紅酵母是一種廣泛存在于自然界的腐生菌，其抗逆性較強(qiáng)，可合成類胡蘿卜素，包括β-胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素等[1]. 類胡蘿卜素由于具有營(yíng)養(yǎng)、藥用、保健等功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品等行業(yè)[2]，據(jù)報(bào)道，2022 年全球類胡蘿卜素市場(chǎng)價(jià)值預(yù)計(jì)將達(dá)到20 億美元[3].紅酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于改變養(yǎng)殖動(dòng)物體色、提高免疫力和抗氧化能力等[4-5]，但目前紅酵母合成色素的能力都比較低，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).因此，篩選出可高效合成類胡蘿卜素的菌株并優(yōu)化其合成條件，進(jìn)一步提高色素產(chǎn)量是類胡蘿卜素生物合成產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的基礎(chǔ). 目前研究者們已經(jīng)從環(huán)境中選育出紅色色素產(chǎn)量較高的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）[6-7]、黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）[8-9]、沼澤生紅冬孢酵母（Rhodotorula paludigenum）[10-11]、海洋紅酵母[12]等優(yōu)良菌株.Braunwald 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，提高培養(yǎng)基中的碳氮比可顯著提高黏紅酵母類胡蘿卜素的生物合成；Zhang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑暗、低溫、碳氮比為90 的培養(yǎng)條件有利于黏紅酵母生物量的累積和類胡蘿卜素合成，類胡蘿卜素質(zhì)量濃度可達(dá)4.2 mg/L；Dias 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，pH 值和溶解氧能顯著影響圓紅冬胞酵母（Rhodosporidium toruloides）NCYC 921 類胡蘿卜素的合成；Banzatto 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在糖蜜中適當(dāng)添加尿素更利于深紅酵母（Rhodotorula rubra）的生長(zhǎng)和色素合成；Maldonade 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于碳源，膠紅酵母菌類胡蘿卜素的合成對(duì)培養(yǎng)基中氮源的變化更敏感.除了優(yōu)化培養(yǎng)條件外，還可通過(guò)向培養(yǎng)基中添加促進(jìn)劑，如番茄汁、花生油、玉米漿、乙醇等提高菌株的類胡蘿卜素合成能力[17-19].不同紅酵母的類胡蘿卜素合成途徑存在差異，意味著不同促進(jìn)劑對(duì)不同的紅酵母菌株類胡蘿卜素合成能力的影響也存在差異.

本研究擬對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期從水產(chǎn)養(yǎng)殖中分離的紅酵母菌進(jìn)行類胡蘿卜素含量測(cè)定，篩選類胡蘿卜素合成能力強(qiáng)的菌株，在培養(yǎng)基中加入可促進(jìn)三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)（檸檬酸鈉、乙醇）和色素合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)（番茄紅素、β-胡蘿卜素），研究番茄勻漿、胡蘿卜汁、檸檬酸鈉、乙醇對(duì)該菌株類胡蘿卜素合成的影響，以優(yōu)化菌株類胡蘿卜素的合成條件從而提高含量.為利用紅酵母進(jìn)行類胡蘿卜素的生物合成產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 菌株

本課題組前期從養(yǎng)殖環(huán)境中分離出8 個(gè)紅酵母菌分離株，編號(hào)分別為CN6、CN7、DN9、DN11、DD1、DD2、DD3、DG2，其中，CN6、CN7、DD1、DD2、DD3 鑒定為Rhodosporidium paludigenum，DG2 鑒定為Rhodotorula minuta，DN9 和DN11 鑒定為Rhodotorula asteroides.此外，從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買了紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma），編號(hào)為F.

1.2 培養(yǎng)基及種子液的準(zhǔn)備

本課題組對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，成分為：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，番茄汁30 mL/L.培養(yǎng)基初始pH 值為5.0，115 ℃高壓滅菌20 min.從試管斜面上刮取一環(huán)菌種，接種于裝有30 mL 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，25 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 作為種子液.

1.3 類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選

將不同菌株的種子液按5%的接種量接種于裝有40 mL 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，25 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 后收獲菌體，測(cè)菌株生物量和類胡蘿卜素含量，篩選類胡蘿卜素含量高的菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.4 番茄勻漿對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

取新鮮成熟番茄用果汁機(jī)勻漿后過(guò)濾，濾液經(jīng)360 W 微波處理20 s，過(guò)濾滅菌后即為番茄勻漿.在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5、10、20、40 和80 mL/L 的番茄勻漿，每個(gè)處理3 次重復(fù)，以篩選到的CN7 菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，按1.3 中的方法進(jìn)行培養(yǎng)，72 h 后收集菌體，測(cè)生物量和類胡蘿卜素含量.

1.5 胡蘿卜汁對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

新鮮胡蘿卜搗碎后添加少量水，用果汁機(jī)制備勻漿，過(guò)濾滅菌后分別按10、20、40、60 和80 mL/L 的量添加到培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3 次重復(fù).按1.3 中的方法進(jìn)行培養(yǎng)，72 h 后收集菌體，測(cè)生物量和類胡蘿卜素含量.

1.6 檸檬酸鈉對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 g/L 的檸檬酸鈉，每個(gè)處理3 次重復(fù)，按1.3 中的方法進(jìn)行培養(yǎng)，72 h 后收集菌體，測(cè)生物量和類胡蘿卜素含量.

1.7 乙醇對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

按1.3 中的方法接種培養(yǎng)菌株24 h 后，在發(fā)酵液中分別添加0.5、1.5、2.5、3.5 和4.5 mL/L 的乙醇，每個(gè)處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)72 h 后收獲菌體，測(cè)生物量和類胡蘿卜素含量.

1.8 類胡蘿卜素含量的測(cè)定方法

先將10 mL 離心管編號(hào)，稱重記錄.每個(gè)處理取5 mL菌液6 份，6 000 r/min 離心10 min，棄去上清液.加入5 mL 蒸餾水，沖洗后繼續(xù)以6 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，再加入5 mL 蒸餾水，沖洗后6 000 r/min 離心10 min，棄上清，稱重記錄.其中3 份95 ℃烘24 h，用于測(cè)量干質(zhì)量，另外3 份用于提取色素.提色素時(shí)，先將二甲基砜（DMSO）在水浴鍋中45 ℃預(yù)熱，然后取2 mL 預(yù)熱過(guò)的DMSO 加入菌液中，充分振蕩均勻，45 ℃水浴10 min，加入5 mL 無(wú)水乙醇浸提40 min，6 000 r/min 常溫離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，再加5 mL 無(wú)水乙醇浸提40 min，浸提直至菌體細(xì)胞無(wú)色，合并所有上清液，在474 nm 處測(cè)OD 值.

類胡蘿卜素含量（μg/g）=OD474×V×D/（0.16×W）式中：OD474為474 nm 處的吸光度值；V為提取所用有機(jī)溶劑體積；D為稀釋倍數(shù)；0.16 為類胡蘿卜素含量與OD474的換算系數(shù)；W為酵母菌的干質(zhì)量（g）.

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Origin 9.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、作圖，所得數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示.應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析.采用Duncan 法，在P=0.05水平上進(jìn)行數(shù)據(jù)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素合成能力強(qiáng)的紅酵母菌株的篩選

本研究中分離得到的8 個(gè)紅酵母菌株類胡蘿卜素的合成能力差異顯著，如圖1 所示.由圖1 可以看出，有4 株菌的類胡蘿卜素含量顯著高于紅法夫酵母F（P＜0.05）的含量，分別為DG2、CN6、CN7 和DN9，含量分別為紅法夫酵母F 的1.45、1.43、1.97、1.51 倍.其中，CN7 菌株的類胡蘿卜素含量最高，達(dá)到了170.11 μg/g，顯著高于其他菌株，因此后續(xù)研究以CN7 為實(shí)驗(yàn)菌株.

圖1 不同紅酵母菌株類胡蘿卜素的含量Fig.1 Carotenoid content in different Rhodotorula strains

2.2 番茄勻漿對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

培養(yǎng)基中添加不同量的番茄勻漿對(duì)紅酵母菌CN7 菌株合成類胡蘿卜素的影響如圖2 所示.由圖2可以看出，向培養(yǎng)基中添加不同量的番茄勻漿會(huì)顯著影響CN7 的類胡蘿卜素含量.其中，添加10 mL/L 和20 mL/L 的番茄勻漿處理下，CN7 類胡蘿卜素的含量顯著高于其他的番茄勻漿處理，這2 個(gè)處理之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.添加20 mL/L 番茄勻漿的處理中，類胡蘿卜素含量最高，達(dá)到239.19 μg/g，而添加80 mL/L 番茄勻漿的處理中，類胡蘿卜素的含量最低，僅為205.70 μg/g.所有添加番茄勻漿處理中的類胡蘿卜素含量均高于零添加的含量，說(shuō)明番茄勻漿的添加有利于菌株CN7 類胡蘿卜素的合成.

圖2 不同含量番茄勻漿條件下CN7 類胡蘿卜素的含量Fig.2 Carotenoid content in CN7 under different content of tomato homogenate

2.3 胡蘿卜汁對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

培養(yǎng)基中添加不同量的胡蘿卜汁對(duì)CN7 菌株的類胡蘿卜素含量的影響如圖3 所示. 由圖3 可以看出，隨著胡蘿卜汁添加量的增加，CN7 菌株合成類胡蘿卜素的能力增強(qiáng).添加80 mL/L 胡蘿卜汁處理的類胡蘿卜素含量最高，達(dá)到342.82 μg/g，顯著高于其他處理.添加5 mL/L 與10 mL/L 之間及添加20 mL/L與40 mL/L 之間，CN7 的類胡蘿卜素含量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 80 mL/L 的胡蘿卜汁添加處理下CN7 菌株的類胡蘿卜素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于80 mL/L 番茄勻漿處理下的含量，說(shuō)明胡蘿卜汁更利于CN7 類胡蘿卜素的合成.這可能是因?yàn)楹}卜汁含有豐富的β-胡蘿卜素，而在類胡蘿卜素的生物合成途徑中β-胡蘿卜素是底物番茄紅素環(huán)化的一個(gè)產(chǎn)物[20].

圖3 不同含量胡蘿卜汁條件下CN7 類胡蘿卜素的含量Fig.3 Carotenoid content in CN7 under different content of carrot juice

2.4 檸檬酸鈉對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

檸檬酸不僅可用作某些微生物的碳源，還可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的良好調(diào)節(jié)劑.培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的檸檬酸對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響如圖4 所示.由圖4 可以看出，CN7 菌株類胡蘿卜素的合成能力隨培養(yǎng)基中檸檬酸鈉質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為6.0 g/L 時(shí)，CN7菌株的類胡蘿卜素合成能力最強(qiáng)，含量達(dá)到255.62 μg/g，顯著高于1.0 g/L 和2.0 g/L 的處理（P＜0.05），略高于檸檬酸鈉質(zhì)量濃度8.0 g/L 的處理（P＞0.05）.

圖4 不同質(zhì)量濃度檸檬酸鈉條件下CN7 類胡蘿卜素的含量Fig.4 Carotenid content in CN7 under different mass concentration of sodium cirate

2.5 乙醇對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響

向培養(yǎng)基中添加乙醇對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素合成的影響如圖5 所示.

圖5 不同含量乙醇條件下CN7 菌株類胡蘿卜素的含量Fig.5 Carotenoid content in CN7 under different content of ethanol

由圖5 可以看出，培養(yǎng)基中乙醇含量為0.5～4.5 mL/L 范圍內(nèi)，CN7 菌株的類胡蘿卜素含量為248.23 ～280.00 μg/g，均高于初始的170.11 μg/g，說(shuō)明乙醇對(duì)CN7 菌株類胡蘿卜素的合成有一定的促進(jìn)作用. 其中，添加1.5 mL/L 乙醇處理下CN7 菌株類胡蘿卜素的含量最高，達(dá)到280.00 μg/g，顯著高于0.5 mL/L乙醇處理（P＜0.05），略高于3.5 mL/L 和4.5 mL/L 乙醇處理（P＞0.05）.

3 討論與結(jié)論

生物體內(nèi)物質(zhì)的合成受多種因素調(diào)控，如果合成途徑及相關(guān)酶比較清楚，通過(guò)加入生物合成途徑中的中間物質(zhì)或前體物質(zhì)，或是對(duì)相關(guān)酶進(jìn)行調(diào)控，可有效提高產(chǎn)量[21-22].本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離的產(chǎn)類胡蘿卜素的8 株紅酵母菌株為實(shí)驗(yàn)材料，篩選出類胡蘿卜素合成能力強(qiáng)的沼澤生紅冬孢酵母菌CN7，培養(yǎng)基中添加不同量的番茄勻漿、胡蘿卜汁、檸檬酸鈉、乙醇，均顯著提高了CN7 菌株類胡蘿素的合成能力.

番茄紅素（番茄勻漿）和β-胡蘿卜素（胡蘿卜汁）作為類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)物有直接影響.朱曉立等[23]、胡向東等[24]的研究表明，培養(yǎng)基中添加胡蘿卜汁或番茄汁可顯著提高紅法夫酵母蝦青素的含量和產(chǎn)量.番茄紅素和β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素生物合成途徑中的節(jié)點(diǎn)，在紅法夫酵母的蝦青素生物合成途徑中，番茄紅素經(jīng)過(guò)2 步環(huán)化形成β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素經(jīng)氧化形成蝦青素[25]；而在其他紅酵母中，番茄紅素可能環(huán)化生成β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素酮化、羥化后形成蝦青素[26].本研究中，向培養(yǎng)基中添加80 mL/L 胡蘿卜汁，CN7 菌株的類胡蘿素含量由170.11 μg/g 提高到342.82 μg/g，顯著高于添加20 mL/L 番茄勻漿的類胡蘿卜含量（239.19 μg/g）.這說(shuō)明CN7 菌株的類胡蘿卜素合成途徑不同于紅法夫酵母，番茄紅素環(huán)化產(chǎn)物不只有β-胡蘿卜素.對(duì)于紅酵母中類胡蘿卜素合成代謝的具體途徑和關(guān)鍵調(diào)控基因，還需要后續(xù)研究進(jìn)行確定.

檸檬酸既可作為微生物生長(zhǎng)的碳源，也是細(xì)胞代謝調(diào)控因子.廖春麗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸濃度對(duì)三孢布拉霉（Blakeslea trispora）的β-胡蘿卜素合成有顯著影響；肖安風(fēng)等[28]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加檸檬酸、乙醇等物質(zhì)可使法夫酵母JMU-VDL668 菌株的蝦青素產(chǎn)量較對(duì)照提高88.8%；茹毅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇可促進(jìn)紅法夫酵母細(xì)胞代謝中丙酮酸、乙酰輔酶A 代謝節(jié)點(diǎn)處的通量，使流向蝦青素合成途徑的通量增加；沈?qū)幯嗟萚29]研究認(rèn)為，乳酸鈉給法夫酵母提供了更多的乙酰輔酶A 等前體物質(zhì)以及能量，因此促進(jìn)了蝦青素的合成；郭銳等[30]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RKAcat 2基因可促進(jìn)紅冬孢酵母中更多的乙酰輔酶A 進(jìn)入甲羥戊酸途徑，從而提高了類胡蘿卜素的合成水平.本研究在培養(yǎng)基中加入可促進(jìn)三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)檸檬酸鈉和乙醇，發(fā)現(xiàn)上述促進(jìn)劑均有效提高了紅酵母類胡蘿卜素的合成，與前人的研究結(jié)果一致.乙醇能有效提高紅酵母蝦青素合成過(guò)程中甲羥戊酸合成途徑關(guān)鍵酶的活性，使流向蝦青素合成途徑的通量增加，進(jìn)而促進(jìn)了蝦青素的合成[19].至于檸檬酸鈉和乙醇在CN7菌株中是否也是通過(guò)促進(jìn)乙酰輔酶A 的合成來(lái)促進(jìn)類胡蘿卜素的合成，還是通過(guò)調(diào)控其他關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)色素的合成，將在后續(xù)研究中進(jìn)行確定.添加檸檬酸鈉能顯著提高紅酵母菌CN7 菌株合成類胡蘿卜素的能力，這與孔維寶等[21]的研究結(jié)果一致，但添加不同濃度檸檬酸鈉處理下CN7 菌株類胡蘿卜素的含量均高于膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）K-1的含量（180.14 μg/g）.

本研究向CN7 菌株培養(yǎng)基中分別添加4 種物質(zhì)，雖然均可提高其類胡蘿素的合成能力，但添加不同物質(zhì)產(chǎn)生的效果不同，提高CN7 菌株類胡蘿卜素合成能力的順序依次為胡蘿卜汁＞乙醇＞檸檬酸鈉＞番茄勻漿，即胡蘿卜汁對(duì)CN7 菌株合成類胡蘿卜素的促進(jìn)作用最明顯.促進(jìn)劑的最佳添加量分別為：胡蘿卜汁80 mL/L、乙醇1.5 mL/L、檸檬酸鈉6.0 g/L、番茄勻漿20 mL/L.在上述條件下，CN7 菌株的類胡蘿素含量分別達(dá)到342.82、280.00、255.62、239.19 μg/g，較初始值的170.11 μg/g 分別提高了101.5%、64.6%、50.3%、40.6%.