物理處理后乳清分離蛋白對羊乳膻味的影響

劉越，馬月，姜瞻梅,2，侯俊財,2

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱 150028）

0 引 言

羊乳營養價值高，富含維生素和礦物質，有利于人體消化吸收，不易產生過敏反應[1]。此外，羊乳中蛋白質含量較高，蛋白凝塊較軟，其成分更接近人乳[2]，對于乳糖不耐受患者來說，羊乳是牛乳的絕佳替代品[3-4]。但大多數人對羊乳及乳制品本身具有的膻味極其敏感，嚴重制約了羊乳及其制品的生產加工與銷售[5]。羊乳膻味的來源可能是羊乳中的短-中鏈游離脂肪酸(SM-FFA)，羊乳中己酸(C6)、辛酸(C8)和癸酸(C10)的含量比牛乳中高[6-7]。還有可能是由于特定比例SMFFA 的相互作用，因為這幾種SM-FFA 單獨存在時不存在膻味[8]。

乳清分離蛋白（WPI）是奶酪生產副產品產生的球狀蛋白的混合物[9]，營養價值高，是食品工業生產中廣泛使用的蛋白質[8]。WPI 的主要成分是β-乳球蛋白（β-LG），β-LG 能夠結合小的疏水配體，如視黃醇，維生素和脂肪酸[10]。β-LG 與脂肪酸結合形成復合物的主要作用力是疏水相互作用[11]。研究發現β-乳球蛋白具有良好的結合疏水性物質的能力，是脂溶性藥物或生理活性成分的合適輸送載體。BELLISSIMO 等[12]發現乳清分離蛋白通過涂覆油滴顯示出保護菜籽油的能力。此外，β-乳球蛋白的結構可以被改性修飾，改性后其結構與功能特性可能發生改變。SIMION 等[13]證實了β-乳球蛋白通過在熱處理過程中形成復合物結合油酸的能力。因此，推測通過對WPI 物理處理可以增強其疏水性，更好地與羊乳中的膻味物質結合，達到除去羊乳中膻味的目的。β-環狀糊精(β-CD)已被證實可以用于羊乳脫膻。β-環狀糊精在分子中心有疏水空腔，其外緣親水，內壁疏水或非極性[14]，它可以包埋疏水分子，并從食品系統中去除不需要的味道，在食品工業中廣泛應用[15]。β-CD 也被用來與其他物質復合添加用于羊乳脫膻[16]。WANG 等[6]研究表明，當β-環狀糊精添加量達到0.5%時，發酵羊乳具有優良的感官特性，但是β-環狀糊精添加量不易過多，過多添加導致溶解困難。目前，鮮少有關于乳清分離蛋白對羊乳脫膻處理的相關研究。因此，探究物理處理乳清分離蛋白以及與β-CD 復配添加對羊乳膻味的影響尤為重要。

本文通過超微粉碎，高壓均質以及擠壓膨化技術改性乳清分離蛋白，探究乳清分離蛋白羊乳脫膻的改性條件，同時與β-環狀糊精復合添加，探究改性乳清分離蛋白與β-環狀糊精的最佳復配比例，力求研究出較為經濟、簡便、實用的羊乳脫膻工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊乳樣品，黑龍江哈爾濱羊奶廠；乳清分離蛋白（蛋白含量為93%），德國Meker 公司；β-環糊精(食品級)，江蘇奧福生物科技有限公司(江蘇南京)；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市天力化學試劑有限公司。所有的化學品和試劑都是分析純的，所有溶液都是用去離子水配制的。

1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；精密電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-4J 數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州市金壇友聯儀器研究所；AH-NANO 高壓均質機，ATS Engineering Limited；QM-QX 行星式球磨機，上海凈信實業發展有限公司；Process 11 平行雙螺桿擠出機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯用儀，束倫(上海)技術服務有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羊乳的預處理

取新鮮的羊乳在20 MPa 下均質，均質后在65 ℃下水浴加熱30 min 進行巴氏殺菌，殺菌后冷卻至室溫，備用。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 超微粉碎WPI 的制備

將WPI 粉末放入陶瓷罐中并使用行星式球磨機研磨，研磨的時間8 h。設定球磨機罐的填充率為25%，轉速為480 r/min，球和WPI 粉末的比例為6∶1。WPI 在通過研磨處理后，獲得超微粉化的乳清分離蛋白UWPI，密封保存。

1.3.2.2 高壓均質WPI 的制備

將5 g 的WPI 溶于100 mL 的去離子水中，使溶解后WPI 的最終濃度為50 g/L，將盛有WPI 溶液的燒杯放置在磁力攪拌器上充分攪拌2～3 h，直到WPI溶液均一穩定，長時間放置無沉淀析出。用1 mol/L 的NaOH 調整樣品pH 值為7.0，然后進行高壓均質處理。壓力分別設定30、60 MPa，循環次數為4 次，凍干后獲得高壓均質后的乳清分離蛋白HWPI-30、HWPI-60。

1.3.2.3 擠壓膨化WPI 的制備

將45 g 的乳清分離蛋白作為原料，進行擠壓預處理。擠壓參數設置為：喂料速度11 g/min, 物料含水量45%，進水速度5.5 mL/min, 螺桿轉速240 r/min。該擠出機有8 個獨立加熱區(7 個內置加熱區，1 個外部口模加熱區)，本實驗改變第四區到第六區的機筒溫度為50～125 ℃，其他加熱區的溫度保持恒定：第一區25 ℃、第二區35 °C、第三區45 °C、第七區45 °C、第八區(口模加熱區) 25 °C。擠壓結束后，獲得擠出物。將獲得的50、75、100、125 ℃下不同溫度擠壓的WPI 擠出物冷凍干燥，研磨成粉分別標記為EWPI-50、EWPI-75、EWPI-100、EWPI-125。

1.3.3 脫膻羊乳的制備

向預處理后的羊乳里分別加入制備的WPI 樣品，然后震蕩攪拌30 min，在20 MPa 的壓力下進行均質處理得到脫膻羊乳。以未添加WPI 的羊乳為對照組，添加質量分數0.5%的EWPI-50、EWPI-75、EWPI-100、EWPI-125，探究不同擠壓溫度乳清分離蛋白對羊乳膻味的影響；添加0.3%、0.5%、0.7%的WPI、UWPI、HWPI、EWPI，探究不同物理處理乳清分離蛋白的添加量對羊乳膻味的影響；添加不同比例的β-CD 與改性乳清分離蛋白，探究β-環狀糊精與改性乳清分離蛋白復配對羊乳膻味的影響。

1.3.4 評定標準

1.3.4.1 感官評價

根據感官評分標準，如表1 所示，將實驗結果通過十點標度法進行感官評價分析，感官評分小組由接受過《食品感官評定》課程培訓的10 名成員組成（5 名男性和5 名女性，年齡19～30 歲），給每個成員發放樣品，一張評分表和一杯純凈水，采用雙盲法進行檢驗，對不同樣品進行密碼編號，將樣品隨機化并要求小組成員分別對羊乳的氣味、滋味、色澤、組織狀態進行打分。評定過程中成員每次感官評定前進行漱口，為了避免因適應膻味而導致打分不準確，對不同樣品打分時，中間需讓成員漱口后休息2～3 min 對下一個樣品進行評定。

表1 感官評價標準

1.3.4.2 模糊數學模型的建立

應用模糊數學模型建立感官評價體系。

因素集和評語集的建立：羊乳的因素集U=｛u1，u2，u3，u4｝，u1，u2，u3，u4分別代表羊乳氣味、滋味、色澤、組織狀態。經過評定小組討論，確定羊奶的評價等級為非常好（v1）、好（v2）、較好（v3）、一般（v4）、差（v5），得到羊奶的評語集V=｛v1，v2，v3，v4，v5｝。

權重的確定：采用頻數統計法，對羊乳氣味、滋味、色澤、組織狀態單獨評分，得到質量因素權重集X＝｛0.4，0.4，0.1，0.1｝。

模糊矩陣的建立和模糊轉換：統計10 位評價員的感官評價分數，將各級的票數除以10 得到模糊關系矩陣R，將質量因素權重集X 與模糊關系矩陣R 合成，得到模糊關系評價集Y＝X×R，即羊乳的評價結果為Y＝X×R。最后引進綜合評分矩陣T 處理模糊關系評價集Y，設評價等級集K＝｛9，7，5，3，1｝，得到羊乳樣品的模糊綜合評價總分T＝Y×K。

1.3.4.3 游離脂肪酸含量測定

根據ZHU[17]的方法稍作修改，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用(SPME-GC-MS)法測定羊乳中游離脂肪酸含量。在20 mL 的頂空瓶（75.5 mm×22.5 mm）中加入12 mL 乳樣和3.6 g NaCl，用密封墊迅速密封頂空瓶。在30 ℃下水浴震蕩平衡30 min。將75 μm CAR/PDMS 萃取頭在250 ℃下老化1 h。將已老化的CAR/PDMS 萃取頭在50 ℃下萃取40 min，在250 ℃下解析5 min，以出峰數和峰面積為檢測指標，每個樣品重復3 次。氣相色譜條件：采用程序升溫模式，起始溫度為80 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升至230 ℃，保持10 min，以氮氣為載氣，流量是3.0 mL/min；分流比3∶1 進樣。質譜條件：質譜鐵源保持在230 ℃，全掃描。電子撞擊模式為70 eV，質量范圍(20～500)m/z。將結果與NIST 11 數據庫進行定性分析，采用面積歸一化方法對游離脂肪酸進行定量分析。

1.3.4.4 電子鼻分析

根據YANG 等[18]的方法，利用電子鼻技術對羊奶揮發性風味進行評價，并對數據進行主成分分析(PCA)。電子鼻測定采用頂空進樣法，用進樣器自動進樣。每個樣品重復3 次。電子鼻測試參數設置：檢測時間60 s，測量計數1 s，自動歸零時間10 s。選取傳感器對應信號曲線的48～52 s 處的響應值作為樣本信息采集點，記錄數據。

1.3.4 數據統計與分析

每組實驗均重復3 次，最終數據表示為平均值±標準差。采用SPSS.22 軟件對所得數據進行分析處理。利用Duncan 方法分析比較變量之間差異性。P＜0.05表示為顯著性差異。采用Orign 8.0 軟件對實驗數據進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 不同擠壓膨化溫度WPI 對羊乳膻味的影響

以未添加膨化乳清分離蛋白的羊乳為對照組進行了感官評定，使用模糊數學法和感官評價相結合的方式進行評價分析，根據評定結果建立模糊評定矩陣，結果如表2。

表2 不同溫度擠壓膨化的WPI 對羊乳的影響感官評價結果

由表2 可知，以空白羊奶樣品的氣味為例，0 人評8～10 分，0 人評6～8 分，0 人評4～6 分，3 人評2～4 分，7 人評2 分以下，則得到U1＝｛0，0，0，0.3，0.7｝，同理可得到U2＝｛0，0，0，0.2，0.8｝，U3＝｛0.8，0.2，0，0，0｝，U4＝｛0.8，0.2，0，0，0｝。將計算得出的U1、U2、U3、U44 個單因素模糊矩陣的評價結果寫成一個矩陣，即：

根據公式Y＝X×R，由X=｛0.4，0.4，0.1，0.1｝得出Y1＝｛0.16，0.04，0，0.2，0.6｝，Y2＝｛0.32，0.52，0.16，0，0｝，Y3＝｛0.36，0.48，0.16，0，0｝，Y4＝｛0.53，0.35，0.12，0，0｝，Y5＝｛0.65，0.35，0，0，0｝。模糊綜合評價總分T＝Y×K，由評價等級集K＝｛9，7，5，3，1｝，經計算得出模糊綜合評價總分見表3。

表3 不同溫度擠壓膨化的WPI 對羊乳的影響感官評價綜合得分

從表3 可以看出，與對照組相比，擠壓膨化處理后的乳清分離蛋白對羊乳的綜合評分顯著增高，隨著擠壓溫度的升高，羊乳的感官評價綜合得分增加。EWPI-50、EWPI-75、EWPI-100、EWPI-125 處理的羊乳分別增加了151.7%、153.4%、167.8%、186.2%。隨著擠壓溫度的升高，擠壓過程促進了蛋白質疏水性基團的暴露，導致了蛋白疏水相互作用的增強，這可能增強了WPI 與游離脂肪酸的結合能力，使羊乳膻味減輕，綜合感官評價得分增加。肖志剛等[19]在研究擠壓溫度對高水分植物蛋白肉流變學和結構特性的影響過程中發現，擠壓破壞了蛋白微粒的完整性，隨著擠壓溫度的升高，蛋白質分子受到破壞發生了重組，樣品體系形成三維網狀結構。綜上，選用125 ℃下擠壓膨化對乳清分離蛋白進行改性處理用于羊乳脫膻。

2.2 不同物理處理WPI 添加量對羊乳膻味的影響

以未添加乳清分離蛋白的羊乳為對照組進行了感官評定，使用模糊數學法和感官評價相結合的方式進行評價分析，試驗處理方法同“2.1”，結果如表4。

表4 不同物理處理的WPI 對羊乳的影響感官評價綜合得分

由表4 可以看出，在相同物理處理條件下，隨著乳清分離蛋白添加量的增加，羊乳的感官評價綜合得分逐漸增大。比較幾種不同物理處理的乳清分離蛋白，與空白羊乳相比，3 種處理WPI 均使羊乳感官評價綜合得分增加。高壓均質使蛋白分子解聚為較小的亞基單位，同時亞基單位展開，包裹在球狀蛋白分子內部的極性和疏水基團暴露出來，增強疏水相互作用[20]。超微粉碎能夠使蛋白質的高級結構發生改變，使蛋白質的疏水基團暴露出來。SUN 等[21]對WPC-80 乳液進行了超細研磨, 研究表明乳清蛋白的表面疏水性增大，提高了油水界面吸附能力。孫嬋嬋等[22]在對乳清蛋白進行超微粉碎-微粒組合加工處理時發現乳清蛋白的表面疏水性增加。擠壓過程促進了蛋白質疏水性基團的暴露，導致了蛋白疏水相互作用的增強，這些原因可能導致了蛋白與游離脂肪酸的結合增強，使羊乳感官評價綜合得分增加。其中添加125 ℃擠壓膨化乳清分離蛋白的羊乳的綜合評價顯著高于其他處理，且添加量0.5%和0.7%的125 ℃擠壓膨化乳清分離蛋白綜合評價相同。綜上，選用添加量為0.5%的125 ℃擠壓膨化乳清分離蛋白用于羊乳脫膻。

2.3 β-環狀糊精與EWPI-125 復配對羊乳膻味的影響

以空白羊乳為對照組進行了感官評定，使用模糊數學法和感官評價相結合的方式進行評價分析，試驗處理方法同“2.1”，結果如表5。

表5 β-CD/EWPI-125 不同復配比例對羊乳的影響感官評價綜合得分

從表5 可以看出，總添加量均為0.5%的情況下，β-環狀糊精與EWPI-125 比例為3∶2 時脫膻效果最好。在總添加量一定的情況下，復配添加后的羊乳比添加單一β-環狀糊精或EWPI-125 的感官綜合評價更好，這可能是β-環狀糊精與WPI 在羊乳脫膻方面具有一定的協同作用。WANG 等[23]在研究β-環狀糊精與熱聚合乳清分離蛋白對發酵酸羊乳脫膻作用時發現二者具有協同作用。

2.4 游離脂肪酸含量檢測

SPME-GC-MS 用于測定SM-FFA 含量。向3份羊乳樣品中分別添加單獨EWPI-125（添加量0.5%）、β-環狀糊精和EWPI-125 混合物（其中β-環狀糊精添加量0.3%，EWPI-125 添加量0.2%）以及單獨β-環狀糊精（添加量0.5%），并以未添加的羊乳作為空白組。將制備得到的羊乳，在20 MPa 的壓力下進行均質處理得到脫膻羊乳。以未添加脫膻劑的羊乳為空白對照組通過SPME-GC-MS 進行游離脂肪酸含量的檢測，游離脂肪酸峰面積r 如圖1 所示。

圖1 游離脂肪酸峰面積

羊乳的膻味與SM-FFA 如己酸（C6）、辛酸（C8）和癸酸（C10）的存在有關。游離脂肪酸含量結果顯示，與對照組相比，β-CD，EWPI-125 以及β-CD 與EWPI-125 復合添加均使得羊乳中短-中鏈游離脂肪酸C6、C8、C10 含量減少。β-CD 能夠包埋疏水分子形成包合物。YOUNG 等[24]還發現，β-CD 結合4甲基支鏈脂肪酸及其直鏈異構體降低了酸奶的果味強度。

與對照組相比，添加0.5%的EWPI-125 的羊乳中C6、C8 和C10 的含量分別降低了66.93%、35.95%和44.80%。證明了EWPI-125 通過降低SM-FFA 含量來削弱羊乳膻味的假設。這可能是由于WPI 中的主要蛋白質β-乳球蛋白（β-LG），通過疏水鍵與脂肪酸結合。許多研究表明，β-乳球蛋白可以結合大多數飽和與不飽和脂肪酸[25]。LOCH 等[26]證明了β-乳球蛋白可以結合辛酸和癸酸。CHEN 等[27]發現在擠壓處理后，大豆分離蛋白分子間二硫鍵交聯，大豆分離蛋白發生聚集。游離脂肪酸含量減少的另一個原因可能是擠壓機的熱和剪切擠壓作用使WPI 分子間氫鍵斷裂，分子結構破壞，原封閉的分子內的疏水基因暴露出來，同時聚集形成蛋白網絡結構[28]，這種擠壓后形成的蛋白網絡結構，可能會有利于和游離脂肪酸結合從而使羊乳膻味減輕。

β-環狀糊精和EWPI-125 的組合在降低羊乳膻味方面表現出協同效應。與對照組相比，復合添加的β-環狀糊精和EWPI-125 使羊乳中C6、C8、C10 的含量分別降低78.69%、79.99%、75.49%，降低程度均高于單獨使用β-環狀糊精或者EWPI-125。因此復合添加的β-環狀糊精和擠壓膨化乳清分離蛋白比其單一添加的脫膻效果更好。NA 等[29]使用環狀糊精和乳清蛋白濃縮物來封裝魚油，發現封裝魚油的氣味強度降低到其原始值的30%。

2.5 電子鼻分析

采用電子鼻技術對不同處理組羊乳揮發性風味進行評價，主成分分析結果如圖2 所示。結果表明，羊乳主成分分析中PC1 和PC2 的方差貢獻率分別為59.2%和20.7%，累積貢獻率為79.9%。其中添加EWPI-125 組、β-CD 組和β-CD 與EWPI-125 復配組有差異，但他們與對照組都有部分重疊，差異較小，無法有效區分。這可能是由于添加β-CD 和EWPI-125能充分保留羊奶的風味。這說明β-CD 和EWPI-125的添加并沒有改變羊奶的整體品質特征。與本研究結果相反，有研究通過在脫脂羊乳中添加不同含量的羊乳脂肪，建立了不同羊乳風味強度的模型，具有明顯的區分效果[20]。

圖2 不同處理組的主成分分析

3 結 論

研究了WPI 以及3 種物理改性（超微粉碎，高壓均質，擠壓膨化）WPI 對羊乳膻味的影響。結果表明，與空白羊乳相比，添加WPI 以及改性WPI 可降低羊乳膻味，其中125 ℃擠壓膨化的WPI 對羊乳膻味減輕的效果最為顯著，且WPI 和β-CD 復配使用具有協同作用。在其總添加量0.5%，WPI 和β-CD 復配比例為2/3 時，C6，C8，C10 的含量分別降低了78.69%、79.99%、75.49%，且降低程度優于單一添加β-CD 或EWPI-125。因此，β-CD 和擠壓膨化WPI 均可減少羊乳游離脂肪酸含量，降低羊乳膻味，且復配添加后效果更好，可作為降低羊乳膻味的一種安全有效的方法，為羊乳及其乳制品的開發提供理論基礎。