HSP70和S100A9蛋白在腦膠質瘤組織中的表達及其意義*

廖秋林,彭大云,賴續文

(1.廣東祈福醫院,廣東 廣州 511495;2.中國人民解放軍南部戰區總醫院,廣東 廣州 510010)

作者前期進行了腫瘤實體組織比較蛋白質組學研究,鑒定出了較多低級別膠質瘤與胚胎發育不良性神經上皮腫瘤(DNT)的差異表達蛋白質[1]。其中,差異蛋白質熱休克蛋白70(HSP70)屬于HSP家族中最重要的成員,也是研究最為熱門的一個,其具有“分子伴侶”功能,與蛋白質的合成、折疊、寡聚化和運輸密切相關,在蛋白質的生物合成和細胞間運輸起著紐帶作用[2]。S100鈣離子結合蛋白A9(S100A9)是S100家族的重要成員,與腫瘤的發生發展密切相關,具有促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉移和誘發腫瘤免疫抑制的作用[3]。HSP70與S100A9之間作用機制并無直接關聯,選做驗證研究是因為在前期新鮮組織用同位素標記相對和絕對定量技術(iTRAQ)對比研究中發現這2種蛋白質在低級別膠質瘤組織與DNT組織中的表達有顯著差異,為作進一步的驗證,本研究顯著增加樣本量,采用石蠟標本進行回顧性研究。

本研究采用免疫組織化學法檢測膠質瘤組織中HSP70和S100A9的表達情況,分析這2種蛋白質在膠質瘤臨床分期和預后中的意義,為膠質瘤的診斷和鑒別診斷、臨床分期和預后判斷尋找新的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 所有病理標本取自2015年1月至2020年12月廣東祈福醫院和南部戰區總醫院確診的160例膠質瘤初診患者,根據2016年世界衛生組織(WHO)膠質瘤診斷標準進行分級,WHO Ⅰ級膠質瘤40例,包含毛細胞型星形細胞瘤34例、毛黏液樣型星形細胞瘤4例、室管膜下巨細胞星形細胞瘤2例;WHO Ⅱ級膠質瘤40例,包含彌漫性星形細胞瘤23例、少突膠質細胞瘤12例、混合型少突-星形細胞瘤5例;WHO Ⅲ級膠質瘤40例,包含間變性星形細胞瘤32例、間變性少突膠質細胞瘤8例;WHO Ⅳ級膠質瘤40例,包含星形細胞瘤來源的膠質母細胞瘤25例、少突膠質細胞來源的膠質母細胞瘤15例。其中,不包含WHO Ⅰ級的星形細胞來源的腫瘤共80例,少突膠質細胞瘤35例,混合型少突-星形細胞瘤5例。也可根據2016年WHO膠質瘤診斷標準簡單分為低級別膠質瘤(WHO Ⅰ級和WHO Ⅱ級)和高級別膠質瘤(WHO Ⅲ級和WHO Ⅳ級),各80例。所有病例中男111例,女69例;年齡21～78歲,中位年齡58歲。所有病例均為初診患者,均無嚴重并發癥,無基礎性代謝性疾病,均為初診患者,術前未行放化療及靶向治療,常規病理取材,10%中性緩沖福爾馬林固定液固定6～8 h,常規脫水處理及石蠟切片,所選取的蠟塊均包含腫瘤旁正常腦組織。本實驗通過廣東祈福醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法 免疫組織化學法試劑HSP70和S100A9均購自Abcam公司,均為兔抗人多克隆抗體,工作濃度均為1∶50,所選蠟塊以4 μm厚度常規切片,涂膠片撈片,脫蠟,采用微波修復抗原,檢測方法嚴格按照試劑盒所附操作說明書的步驟進行。采用縮短一抗/二抗孵育時間,并多次以不同抗體濃度、多次預實驗等以選擇最合適的工作濃度及實驗方法,進而大規模染片、判讀、打分及統計分析。

1.2.2免疫組織化學法結果判讀 由2位副主任醫師各自獨立觀察判斷,2個免疫標記均以細胞核和(或)細胞質出現棕黃色顆粒著色為陽性細胞,從正常著色細胞、著色位置、內對照及外對照等綜合判斷染片質量,排除非特異染色干擾。選取5～10高倍鏡視野(400倍),計數500～1 000個細胞。采用二級計分法判定結果,陽性細胞數低于5%為0分;5%～25%為1分;>25%～50%為2分;>50%～75%為3分;>75%為4分。染色強度分類:淡黃色為1分;黃色或深黃色為2分;褐色或棕黃色為3分。兩者相加低于2分為陰性(-);2～3分為陽性(+);4～5分為中等陽性(++);6～7分為強陽性(+++)。

1.3統計學處理 應用SPSS25.0軟件進行數據處理,計數資料以率或構成比表示,采用κ系數檢驗及χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HSP70和S100A9在膠質瘤組織中的表達 HSP70主要表達于腫瘤細胞的胞質,偶爾表達于細胞膜和細胞核;正常人體組織較少表達HSP70。免疫組織化學染色結果顯示,HSP70在膠質瘤組表達陽性率為85.0%(136/160),在正常腦組織表達陽性率為23.1%(37/160),二者比較,差異有統計學意義(P<0.05)。S100A9在大部分腫瘤細胞陰性表達,主要表達于反應性或出血灶中的中性粒細胞、巨噬細胞的細胞核,部分細胞質也有表達。S100A9在膠質瘤組表達陽性率為7.5%(12/160),在正常腦組織組表達陽性率為4.4%(7/160),二者比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注:A.膠質瘤腫瘤細胞中HSP70的典型陽性表達,以細胞質及細胞核表達為主;B.S100A9的典型陽性形態,以細胞核表達為主。

2.2HSP70和S100A9在不同級別膠質瘤組織中的表達陽性率比較 HSP70在WHO分級Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤組織中的表達陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。S100A9在WHO分級Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤組織中的表達陽性率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 HSP70和S100A9在不同WHO分級膠質瘤組織中的表達差異[n(%)]

2.3HSP70和S100A9在低級別膠質瘤與DNT組織中的表達陽性率比較 HSP70在低級別膠質瘤組表達陽性率顯著高于DNT組,差異有統計學意義(P<0.05);S100A9在DNT組與低級別膠質瘤組表達陽性率比較,差異無統計學意義(P>0.05),無鑒別診斷意義。見表3。

表3 膠質瘤組與DNT組HSP70、S100A9表達陽性率比較[n(%)]

2.4膠質瘤組織中HSP70和S100A9表達的相關性分析 通過配對計數資料的κ系數檢驗,因為κ<0.4,可見HSP70和S100A9在腦膠質瘤組織中的表達無相關性。

3 討 論

HSP70是HSP家族的重要成員,主要作用是調控人體應急狀態下的蛋白質代謝水平,其表達水平與細胞的應激能力及功能狀態密切相關,也可在一定程度上反映細胞的老化程度[4]。在腫瘤患者中,不同分化程度和不同分期的腫瘤細胞中HSP70表達水平均有不同,部分研究發現繼發性耐藥的腫瘤患者HSP70表達水平升高[5]。也有研究認為HSP70可能誘導和增強人體自主的抗腫瘤免疫反應,抑制腫瘤細胞生長。如,HSP70參與了腫瘤細胞表型改變及與腫瘤特異性多肽抗原結合形成免疫復合物,誘導機體免疫系統識別腫瘤細胞,引發人體的抗腫瘤特異免疫反應;HSP70也可以間接或直接激活自然殺傷細胞(NK細胞),直接殺滅腫瘤細胞[6-7]。近年來,已發現在多種腫瘤中HSP70高表達,如膠質瘤[7]、肝細胞癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、肺腺癌[11]等。

本實驗研究結果表明,HSP70的表達在膠質瘤與正常腦組織之間有顯著差異,且隨著膠質瘤WHO級別的增加其表達水平升高,說明HSP70與膠質瘤的分化程度有密切關系,可用于膠質瘤的輔助診斷標志。HSP70還可作為膠質瘤的潛在治療靶點,如抑制HSP70的合成或阻斷其抗凋亡作用均可延長膠質瘤患者的生存期。DNT分為復雜型和單純型,典型的星形細胞瘤與單純型DNT有比較好分辨的形態學特征,而復雜型DNT由于具有特殊的少突膠質細胞樣細胞,與少突膠質細胞瘤鑒別十分困難。本實驗結果表明,HSP70在DNT與低級別膠質瘤組織中的表達有統計學差異,少突膠質細胞瘤表達明顯升高,可用于兩者的輔助鑒別診斷,從而避免將復雜型DNT診斷為WHO Ⅱ級的少突膠質細胞瘤,繼而導致不必要的過度治療,加重患者負擔且浪費醫療資源。本實驗設計沒有驗證HSP70與Ki-67等現有膠質瘤免疫標記的相關性,也無證據表明與已有的膠質瘤免疫組織化學指標有相關性。

S100A9蛋白屬于鈣結合蛋白,其編碼基因位于染色體1q21區,易發生重排、易位、缺失等改變,主要參與細胞的分化和增殖,以及部分蛋白磷酸化,也參與一些具有突變的腫瘤細胞的侵襲和轉移[12]。已有研究發現,S100A9蛋白在肺癌[13]、鼻咽癌[14]、宮頸癌[15]、乳腺癌[16]、胃癌[17]等諸多腫瘤中表達升高,且S100A9表達陽性率與腫瘤的分化程度呈負相關,可能與腫瘤的發展、增殖、侵襲及轉移相關。

本實驗結果表明,S100A9在大多數膠質瘤細胞中無表達,僅少許腫瘤細胞弱表達,而在腫瘤組織中出血灶表達增高,且主要表達于出血灶中的中性粒細胞、巨噬細胞,部分淋巴細胞也有表達,這與大多數文獻研究不同,作者仔細研讀相關文獻,發現很多文獻中的配圖也是表達于中性粒細胞及淋巴細胞,并不是表達于腫瘤細胞,作者在180例免疫組織化學中觀察到了這個現象,其原因尚不清楚。因此S100A9不能作為膠質瘤的輔助診斷標志物,不能用于判斷膠質瘤的預后,與膠質瘤的發生發展關系不明,也不能用于低級別膠質瘤與DNT的鑒別診斷。鑒于S100A9主要表達于中性粒細胞、巨噬細胞及部分淋巴細胞,提示可用于腫瘤免疫微環境的監測,但其具體臨床意義則需要大量的臨床實驗數據驗證才可得出結論。