液態(tài)發(fā)酵茯苓菌有機(jī)相提取物抗氧化活性研究

陳 林

（常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，湖南常德 415000）

自由基是機(jī)體代謝過程中的產(chǎn)物，正常水平下對機(jī)體的細(xì)胞生長、環(huán)核苷酸合成有著調(diào)節(jié)作用。這種物質(zhì)尤其活躍且極不穩(wěn)定，容易附著于健康細(xì)胞上奪取脂肪、蛋白質(zhì)、DNA 等分子的電子，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，引起多種疾病發(fā)生。如炎癥、癌癥、心血管等疾病的發(fā)生，都與機(jī)體自由基過?；蛳芰p弱有關(guān)[1-7]。

茯苓三萜是茯苓主要有效成分之一，在食品、藥品、化妝品等研發(fā)生產(chǎn)領(lǐng)域中被廣泛運(yùn)用。因其表現(xiàn)出顯著的抗癌、抗炎、降血糖等活性，目前相關(guān)研究也多集中在這幾個方面，對茯苓三萜消除自由基的研究較少。茯苓三萜為親脂性成分，易溶于有機(jī)溶劑[10]，用甲醇溶出和加熱回流、乙酸乙酯加熱回流3種方式對茯苓菌絲產(chǎn)物進(jìn)行提取的不同三萜產(chǎn)物，并進(jìn)行抗氧化活性研究。

1 材料

1.1 菌株

Poria cocos5.0078，購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 試劑

生物試劑：瓊脂，玉米漿粉，維生素C（Vc）；分析純：葡萄糖，ZnSO4，MnSO4，CuSO4，2-硫代巴比妥，鄰二氮菲，F(xiàn)eSO4，30%H2O2，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），KH2PO4，K2HPO4，無水乙醇，甲醇，乙酸乙酯。

1.3 儀器

SN-CJ-2D 型雙人凈化工作臺（上海尚儀設(shè)備有限公司），LRH-70 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），THZ-98C 振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），8L 發(fā)酵罐（上海保興生物），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（析?？萍迹?、旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀（上海尚儀設(shè)備有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（日本島津UV-1800），臺式酸度計(jì)（上海理達(dá)），GL-21M 立式高速冷凍離心機(jī)（長沙平凡）。

2 方法

2.1 菌種保存與活化

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面保存Poria cocos5.0078 菌種，接種PDA 平板活化，28℃下培養(yǎng)7 d，備用。

2.2 液體菌種制備

將活化后的Poria cocos5.0078 接種到100 mL/250 mL 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d。相同培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)接1次，培養(yǎng)5 d，備用。

2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵

取6 瓶液體菌種，培養(yǎng)基組成：30 g/L 葡萄糖、7.5 g/L 玉米漿粉、0.03 g/L ZnSO4、0.03 g/L MnSO4、0.03 g/L CuSO4、0.01 g/L 2-硫代巴比妥、初始pH 5，進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵9 d。

2.4 三萜產(chǎn)物提取

甲醇溶出三萜產(chǎn)物：取發(fā)酵液200 mL，過濾，菌絲體加甲醇進(jìn)行破碎，溶出液合并，過濾，濾液濃縮至干粉，備用。

甲醇加熱回流得三萜產(chǎn)物：取發(fā)酵液200 mL，過濾，菌絲體烘干研磨成細(xì)粉，加200 mL 甲醇加熱回流1 h，重復(fù)提取3次，合并提取液，濃縮得干粉。

乙酸乙酯加熱回流得三萜產(chǎn)物：取發(fā)酵液200 mL，過濾，菌絲體烘干研磨成細(xì)粉，加200 mL乙酸乙酯加熱回流1 h，重復(fù)提取3次，合并提取液，濃縮得干粉。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH消除能力測定

取上述3 種三萜產(chǎn)物各25 mg，甲醇定容5 mL。設(shè)置樣品不同濃度梯度，各取1 mL 與1 mL 0.1 mmol/L DPPH 混合，30 min 后在517 nm 下測定吸光度值，重復(fù)3次。以Vc 為陽性對照，以甲醇為空白對照。式（1）得DPPH 自由基消除率[11–12]。

式中，D1為樣品吸光度值；D0為甲醇吸光度值。

2.5.2 H2O2消除能力測定

相同方法制備不同濃度梯度樣品適量。另將0.75 mmol/L 鄰二氮菲1 mL、150 mmol/mL 磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）1.5 mL 混合，加入0.75 mmol/L FeSO41 mL 混合，制備7份。分別加不同濃度樣品1 mL 及0.01% H2O21 mL，剩余兩份均不加樣品，一份加0.01% H2O21 mL，一份不加H2O2，這兩份分別用甲醇和50%甲醇補(bǔ)足。37℃水浴加熱1 h，510 nm 下測定吸光度值，重復(fù)3次。以Vc 陽性對照。式（2）得H2O2·自由基消除率[13]。

式中：A0為不加H2O2溶液吸光度值，A1為加H2O2溶液吸光度值，A2為樣品溶液吸光度值

3 結(jié)果與分析

3.1 DPPH消除能力

茯苓三萜產(chǎn)物對DPPH 的消除能力見表1。以Vc為陽性對照，這三種方式提取的三萜產(chǎn)物對DPPH 均有消除能力，甲醇加熱回流的三萜產(chǎn)物比甲醇溶出的三萜產(chǎn)物、乙酸乙酯加熱回流的三萜產(chǎn)物的消除能力強(qiáng)；但因三萜產(chǎn)物均是粗提取，三者對DPPH 消除能力均沒有Vc 的強(qiáng)。

表1 不同提取方式的茯苓三萜對DPPH的清除能力

3.2 H2O2·消除能力

茯苓三萜產(chǎn)物對H2O2的清除能力見表2。以Vc為陽性對照，這三種方式提取的三萜產(chǎn)物對H2O2均有消除能力，甲醇溶出得三萜產(chǎn)物與甲醇加熱回流得三萜產(chǎn)物對H2O2的消除能力接近；相同提取方式，甲醇加熱回流的三萜產(chǎn)物比乙酸乙酯加熱回流的三萜產(chǎn)物對H2O2的消除能力強(qiáng)；三者對H2O2消除能力均沒有Vc的強(qiáng)。

表2 不同提取方式的茯苓三萜對H2O2的清除能力

4 結(jié)論

這三種提取方式的茯苓三萜產(chǎn)物對DPPH、H2O2有顯著的消除能力，且在一定范圍內(nèi)對濃度梯度有密切聯(lián)系；但與抗氧劑Vc 相比，這三種三萜產(chǎn)物對DPPH、H2O2抗氧化能力較弱，與提取液中有效抗氧化物質(zhì)含量低有直接的關(guān)系。因此在后期實(shí)驗(yàn)中，可以進(jìn)一步分離純化有效抗氧化物質(zhì)并分析鑒定其成分。