基于InDel標記的杏鮑菇遺傳多樣性評價

姜曉紅 朱家漘, 孫忠剛 曲紹軒 馬 林 李輝平*

（1. 江蘇省農業科學院蔬菜研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2. 江蘇大學生命科學學院，江蘇 鎮江 212013；3. 江蘇淮香食用菌有限公司，江蘇 淮安 223009）

杏鮑菇（Pleurotuseryngii），學名刺芹側耳，隸屬側耳科、側耳屬，是我國三大重要工廠化栽培珍稀食用菌之一，其野生種質資源主要集中在南歐、北非、中亞等地[1]。杏鮑菇含有多種膳食纖維、維生素、人體必需氨基酸及功能性多糖等，具有藥食兼用的功能，深受消費者的歡迎。

分子標記的開發對開展種質資源收集與評價，培育優質新品種具有重要意義。杏鮑菇子實體形態特征較少且極易受外界環境因素影響，單從形態水平鑒定杏鮑菇菌株的親緣關系比較困難。DNA分子標記技術作為一種快速鑒定樣品間遺傳多樣性的方法被廣泛應用于種質資源鑒定、基因定位、分子輔助育種等多方面。目前在杏鮑菇上得到應用的分子標記主要包括有限制性片段長度多態性（RFLP）[2]、隨即擴增多態性DNA（RAPD）[3]、簡單重復序列多態性（SSR）[4]、簡單重復序列間區（ISSR）[5]和多核苷酸多態性（MNP）[6]標記技術等。

插入/缺失（insertion-deletion，InDel）是指在不同個體之間基因組同一位點的序列發生了數個堿基的插入或缺失，在基因組中的分布密度僅次于SNP，適用于全基因組分子標記的開發。InDel標記目前在醫學、動植物遺傳學都得到廣泛應用，在食用菌遺傳多樣性中也逐步得到應用[7]。Xiang等篩選了68對InDel引物，分析了88個香菇栽培群體的遺傳多樣性[8]。沈秀芬等通過對5個香菇菌株重測序，開發并利用InDel標記對44份香菇菌株進行遺傳多樣性分析，并將其分為4個亞群[9]。

本研究通過InDel分子標記技術，對搜集的杏鮑菇菌株進行遺傳多樣性評價，為杏鮑菇種質資源評價及開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

65份杏鮑菇菌株由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供（表1），其中栽培菌株主要來自國內企業和市場，CCMSSC菌株來自國家食用菌標準菌株庫。

表1 供試菌株編號信息

1.2 菌絲培養

采用常規的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）進行菌絲活化3 d后，打孔接入250 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）搖瓶進行菌絲擴大培養，25 ℃下150 r/min培養5 d，接真空泵抽濾收集菌絲，用純凈水洗滌2次。

1.3 DNA純化

取10 mg的菌絲體，研缽中用液氮將其迅速研磨成粉狀，用DNA提取試劑盒（上海生工）按操作手冊純化DNA。檢測OD260/OD280比值，范圍在1.7～1.9為合格，并將核酸濃度統一為50 ng/μL后放入 - 20 ℃冰箱備用。

1.4 InDel位點篩選與引物設計

依據NCBI網站公布的杏鮑菇基因組數（GCA_015484515.1和GCA_001717165.1），通過Minimap2進行基因組比對[10]，以GCA_001717165.1為參考基因組，篩選30～200 bp堿基差異的InDel位點，隨機選擇36個位點，在其上下游各150 bp內利用Primer 3設計（參數默認）引物（表2），引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

表2 引物序列及多態性

1.5 PCR擴增和電泳分析

PCR反應體系：2 × PCRmix 10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1μL，模板DNA 1μL，補dd H2O至20 μL。PCR反應條件：98 ℃ 4 min預變性；95 ℃10 s，63 ℃10 s，72 ℃ 10 s，30個循環；72 ℃ 5 min延伸后4 ℃保存。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，200 V電泳20 min，凝膠成像系統拍照并記錄結果。

1.6 數據處理

在Excel 2016中用1或0標記泳道間相同位移上條帶的有或無，再導入NTSYSpc 2.10進行分析，計算遺傳相似系數并用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 InDel標記開發

經比對發現，GCA_015484515.1和GCA_001717165.1間30～200 bp InDel位點共135個，其中插入45個，缺失90個，分布在64條Contig上，每條Contig上的目標InDel位點少于5個。位點之間平均距離大于20 kb，50個位點之間距離大于10 kb，只有4個位點距離小于1 kb。隨機選取的36對InDel引物中篩選出條帶清晰、重復性好的多態性引物25對，對擴增出的63個位點進行統計分析（表2，圖1）。

圖1 PerSV16和PerSV20 InDel標記多態性標記檢測結果

2.2 供試菌株遺傳多樣性分析

利用NTSYSpc 2.10軟件進行矩陣分析并計算65份材料間遺傳相似系數，供試菌株遺傳相似系數最低值是0.362，表明存在較大的遺傳差異，有豐富的遺傳多態性，具有很大的開發潛力。其中菌株Per22與其他菌株間的遺傳相似系數均很低，與Per18之間的相似遺傳系數僅為0.362；而Per53、Per54、Per55、Per56兩兩之間的相似系數為1，表明這四者之間的親緣關系極近，很有可能屬于同株異名。

通過UPGMA聚類分析法構建的杏鮑菇菌株遺傳親緣聚類樹（圖2），在遺傳相似系數為0.616的水平上將其分為5大類，第1類群數量最多，包括Per1、Per2、Per14等51個菌株，包含了大量國內栽培菌株；第2類群6個菌株，分別是Per4、Per37、Per39、Per42、Per17、Per46；第3類群6個菌株，分別是Per3、Per48、Per68、Per70、Per67、Per69。Per45和Per22與其他菌株之間的親緣關系都很遠。

圖2 65株杏鮑菇菌株遺傳親緣聚類樹

3 結論與討論

InDel在基因組中分布廣泛、數目眾多，分布密度僅次于SNP，遠高于SSR，是人類和植物中第二豐富的基因變異形式[11-13]，而且大片段InDel標記可以直接利用瓊脂糖凝膠電泳進行分型檢測，對檢測設備要求低、簡單易行，成本大大低于SNP和SSR檢測成本[14,15]，更因其共顯性遺傳、變異穩定、準確性高、重復性好等特點，在群體遺傳分析、基因定位及遺傳圖譜構建等領域被廣泛應用[9,11,16-19]。本研究專門針對30～200 bp的InDel位點進行開發，雖然得到的候選標記位點數量有限，但是符合易于檢測的出發點，且在首批36個位點中就篩選得到25個多態性候選標記，都可用瓊脂糖凝膠直接電泳檢測，成功比例較高。

InDel標記開發一般利用不同材料重測序后與參考基因組進行比對分析獲得[9,20-22]，這就需要該物種有公開的參考基因組，同時對不同材料進行重測序，需要一定的資金和時間成本。對于SNP和小InDel，重測序數據更多的測序深度帶來了更高的準確度。但隨著測序技術和組裝算法的不斷進步，大InDel在基因組組裝過程中假陽性越來越低。本研究通過比對已公開的杏鮑菇基因組數據，簡單快捷且成本低，后續可利用更多的基因組組裝數據進一步擴充。

杏鮑菇野生種質資源主要分布于南歐、北非、中亞等地區，雖我國四川、青海、新疆也有分布報道[23]，但關于野生種質資源采集的報道較少。國內工廠化栽培菌株很多是引進自日本，并得到推廣[24]。此間經過系統選育和雜交育種，我國栽培菌株具有一定的遺傳多樣性。劉曉紅等對來自中國不同地區的杏鮑菇品種進行RAPD分析，發現23份材料遺傳多樣性很豐富，可分為5大類[25]。馬紅等用RAPD和ISSR標記將34個中國工廠化栽培杏鮑菇菌株分為4～5大類[26]。楊和川等基于ISSR標記對27株杏鮑菇種質資源評價也得到類似結果[27]。這與本研究結果較為類似。但是魏傳正等利用基因二代測序技術的MNP標記對國內56份工廠化栽培菌株分析后，發現相似度均接近100.00%，認為國內杏鮑菇栽培品種高度一致[6]。對國內栽培菌株的遺傳多樣性分析還值得進一步研究探討。