手工雪茄主要霉菌的分離鑒定及其生物學特性研究

朱貝貝，黃闊，薛芳，安泓汋，葉長文，李棟，李東亮*

1 四川中煙工業有限責任公司雪茄煙技術創新中心，成都市龍泉驛區成龍大道二段 610066；

2 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

雪茄是以發酵醇化的煙葉為原料卷制而成的特殊煙草制品[1]。由于發酵后的煙葉富含有機酸、糖等營養物質，因此更適宜霉菌生長繁殖，進而引發霉變[2-3]。手工雪茄近年來發展迅猛，但雪茄煙支在養護、運輸和儲存等過程中，受環境溫濕度影響造成的霉變現象日益突出。生產過程中發現，手工雪茄因特殊的加工過程面臨更大的霉變風險。霉菌在高溫、潮濕或無氧等條件下發酵，可導致煙葉腐爛，產生雜氣[4]，對雪茄的內在感官及質量安全性產生不利影響[5-6]。據報道，自然界引起商品變質腐敗的霉菌有130 屬231 種[7]，其中引起煙葉霉變的優勢霉菌主要為曲霉屬和青霉屬[8-10]，也有少量的毛霉、根霉等[11-12]。霉菌生長繁殖的最適條件受自身生物學特性及氣候條件影響有很大差異[13]。Welty 等[14]研究表明美國烤煙霉變煙葉81%樣品中檢測出了匍匐曲霉。Tamayo 等[15]研究表明引起西班牙煙葉霉變的微生物主要為芽孢桿菌和球菌。引起我國煙葉霉變的微生物主要有黑曲霉、煙曲霉、溜曲霉、孔曲霉等[16-19]。引起我國卷煙煙支霉變的主要微生物有黃曲霉、桔青霉和米曲霉等[20-21]。

目前對煙草霉變的研究多集中于烤煙煙葉儲存、卷煙加工和儲存中霉菌等方面，缺乏對手工雪茄煙支中主要霉菌種類及其生物學特性的研究。為此，本研究通過對市場反饋易霉變的手工雪茄煙支中霉菌含量及種類進行研究，旨在明確引起手工雪茄煙支霉變的主要霉菌及其生物學特性，為雪茄霉變防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：收集市場反饋的易霉變手工雪茄煙支，共9 種，分別命名為A-I。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；孟加拉紅瓊脂培養基；高鹽察氏培養基；察氏培養基；氯硝胺18%甘油瓊脂（DG18）培養基按照說明書配制；10%煙汁培養基的制備：1000 mL 蒸餾水中加入100 g發酵前雪茄煙葉，煮沸后過濾，加水補足到1000 mL，加18 g 瓊脂，121℃消毒20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 手工雪茄煙支中霉菌含量的測定

在無菌條件下將手工雪茄煙支樣品剪碎、混勻，稱取25 g 樣品，裝入無菌均質袋中，加入225 mL 無菌磷酸鹽緩沖液，均質器12 m/s 均質3 min，制成原始菌懸液，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度梯度的菌懸液。參考GB 4789.15—2016 中霉菌計數方法并進行改進，將0.333 mL 稀釋液涂布接種于孟加拉紅培養基，每組樣品設置3 個重復。28℃恒溫培養5 d，最終以霉菌含量在10～100 CFU/平板的稀釋度平板進行霉菌含量計算。

1.2.2 手工雪茄煙支中霉菌的分離和純化

選取培養基上菌落形態不同的霉菌，在無菌條件下將不同的霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行純化，后置于（28±1）℃恒溫培養箱培養3～7 d，直至形成單一菌落。

1.2.3 手工雪茄煙支中霉菌的鑒定

形態學觀察：通過觀察單菌落在生長初期、中期和后期的生長速度、大小、高度、色澤、質地、結構、邊緣形狀、培養基顏色變化和滲出物等特征，對霉菌菌落形態特征進行初步鑒定。

產孢結構特征分析：將菌落邊緣帶孢子的菌絲置于載玻片上的乳酸石碳酸液中，菌絲分散均勻后蓋上蓋玻片通過鏡檢對霉菌菌絲及霉菌孢子、產孢結構等特征進行鑒定。

ITS 分子生物學鑒定：稱取20 mg 干燥的菌絲并用液氮研磨成粉末，使用Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行 DNA 提取。 利用 ITS1（ 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）真菌通用引物對霉菌ITS 區進行PCR 擴增。PCR 反應總體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol /L）0.5 μL，上下游引物（5 μmol /L）各1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL（5 U /μL），無菌水19 μL，DNA 0.5 μL。PCR 反應條件：預變性95℃ 5 min；30 個循環（變性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 90 s）；總延伸72℃ 10 min。將測序結果在GenBank 上進行Blast 比對，找出與檢測菌株序列同源性最高的菌株。運用MEGA 6.06軟件，以Kimura 雙參數模型和鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育進化樹。

1.2.4 手工雪茄煙支中主要霉菌的生物學特性

不同培養基對霉菌生長的影響：選取PDA 培養基；高鹽察氏培養基；孟加拉紅培養基；察氏培養基；DG18 培養基；10%煙汁培養基對兩種主要霉菌進行培養。菌株在28℃恒溫培養箱中培養5 d 后，在菌落邊緣用內徑為5 mm 的打孔器取菌餅，將菌餅移入相應的培養基平板中央，于28℃、75%濕度培養5～7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理設3 次重復。實際生長的菌落直徑=菌落直徑平均值－5 mm。

不同溫度條件對霉菌生長的影響：在無菌條件下，將直徑為5 mm 的菌餅移入生長狀況良好的培養基平板中央，分別在25℃、30℃、35℃和40℃條件下培養，濕度均設置為75%，5～7 d 后測量菌落直徑。每個處理設3 次重復。

不同熱處理條件對霉菌生長的影響：分別設40℃、50℃和60℃ 3 個恒溫水浴，制備聚多曲霉和產黃青霉孢子懸浮液各2 mL 于無菌試管中，將試管置于相應溫度條件下水浴10 min，未進行恒溫水浴的孢子懸浮液于室溫放置10 min 并作為CK 對照，每個處理設3 次重復，將水浴后的孢子懸浮液均勻涂抹至相對應的培養基平板上培養5～7 d，計算霉菌含量。

不同紫外線照射時間對霉菌生長的影響：制備聚多曲霉和產黃青霉孢子懸浮液，將孢子懸浮液進行梯度稀釋至10-7，隨后將稀釋過的孢子懸浮液均勻涂抹至相對應的培養基平板上，置于生物安全柜中紫外燈下分別照射10 min、20 min、30 min、60 min、120 min，并以紫外光照0 min 為CK 對照。培養5～7 d，計算霉菌含量。每個處理設3 次重復。

不同濕度條件對霉菌生長的影響：在無菌條件下，將直徑為5 mm 的菌餅移入生長狀況良好的培養基平板中央，分別在濕度為50%、70%和90%下培養，溫度均設置為28℃，5～7 d 后測量菌落直徑。每個處理設3 次重復。

2 結果

2.1 手工雪茄煙支中霉菌含量

對9 種手工雪茄煙支樣品的霉菌含量進行測定，將所得檢測數據進行分析，如圖1 所示。每組樣品的平行性較好，檢測結果可靠。A～I 手工雪茄煙支中霉菌的含量范圍為0～2.10×104CFU/g。B、C 和G 樣品的霉菌含量較高，均大于104CFU/g。

圖1 雪茄煙支樣品中霉菌含量Fig.1 Mold content in cigar samples

2.2 手工雪茄煙支中霉菌的分離與鑒定

2.2.1 手工雪茄煙中主要霉菌種類及數量占比

根據9 種樣品在選擇性培養基平板上的霉菌生長情況，將各樣品中不同霉菌種類進行編號，根據霉菌菌落的形態學特征對其種類進行到屬水平的初步鑒定，并對其含量占比進行分析，結果如表1 和圖2 所示：手工雪茄樣品中的菌落按照生長形態特征劃分共有6 種曲霉屬，1 種擬青霉屬和1 種青霉屬。其中A-1、B-1、C-1、D-1 和I-3 形態學特征相同，為曲霉屬同一種霉菌；A-2、B-2、C-2、E-2、H-1 和I-1 形態學特征相同，為青霉屬同一種霉菌。為方便后續研究將前者命名為#1，后者命名為#2。其中#1 和#2 在多個樣品中有檢出，且含量占比較高，為手工雪茄煙中的主要霉菌。

表1 樣品主要霉菌種類及含量占比Tab.1 Types and proportion of main molds in cigar samples

圖2 雪茄煙樣品中主要霉菌種類及形態圖Fig.2 The main mold species in cigar samples and their morphological images

2.2.2 雪茄煙支中主要霉菌鑒定

2.2.2.1 主要霉菌形態學特征

#1 型菌株在PDA 培養基上培養5 d 后，菌落形態如圖3 所示：菌落直徑5～10 mm，棕色，緊密，表面絨狀，菌落反面淡褐色，無色素，菌落上無滲出物。#2 在PDA 培養基上菌落形態：正面呈綠色、灰綠色，菌落表面呈不規則形狀，菌落反面呈白色、淡黃色。

圖3 #1 和#2 在PDA 培養基上的菌落生長形態Fig.3 Colony morphology of #1 and #2 strains on PDA medium

2.2.2.2 主要霉菌產孢結構

從圖4 可以看出#1 型菌株的分生孢子穗為黑色、褐黑色或紫褐色，部分發生淺色的突變；分生孢子梗光滑；頂囊大的呈球形或近球形，小的稍膨大，產生小梗；小梗單層或雙層；分生孢子粗糙，具有褐黑色的條紋。

圖4 #1 和#2 型菌株的產孢結構Fig.4 Spore structure of #1 and #2 strains

#2 型菌株菌絲呈淡綠色，菌絲和分生孢子梗均有橫隔，光滑或粗糙；分生孢子梗經過多次分枝，產生幾輪對稱或不對稱的小梗，為掃帚狀；分生孢子為球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙。

2.2.2.3 主要霉菌的分子生物學鑒定

菌株鑒定的ITS 序列及系統進化樹結果如圖5、6所示，結合形態學觀察和產孢結構特征分析，最終確定#1 為聚多曲霉（Aspergillus sydowii），#2 為產黃青霉（Penicillium chrysogenum）。

圖5 #1 系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of type 1 strain

圖6 #2 系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of type 2 strain

2.3 手工雪茄煙支中主要霉菌的生物學特性

2.3.1 不同培養基對主要霉菌生長的影響

如表2 所示，聚多曲霉在DG18 培養基上生長最快，在察氏培養基上生長最慢；產黃青霉在DG18 培養基上生長最快，在煙汁培養基上生長最慢。不同霉菌種類對培養基的選擇不同，選擇不同培養基對霉菌生長速率有重要影響。

表2 培養基對霉菌生長狀況的影響Tab.2 Growth status of molds in different culture mediums

2.3.2 不同溫度對主要霉菌生長的影響

如表3 所示，聚多曲霉的最適生長溫度為30℃，25～35℃均能生長，40℃時未生長。產黃青霉的最適生長溫度為25℃，25～35℃均能生長，在40℃時未生長。

表3 培養溫度對霉菌生長狀況的影響Tab.3 Effects of temperature on the growth of molds

2.3.3 不同熱處理對主要霉菌生長的影響

如表4 所示，聚多曲霉在40℃加熱10 min 時霉菌含量高于空白對照，在加熱50℃時，霉菌含量從107數量級驟減至103，60℃時霉菌已全部死亡。產黃青霉隨著溫度的升高，霉菌含量呈現遞減的現象，當溫度為60℃時，霉菌已全部死亡。

表4 熱處理對霉菌孢子濃度的影響Tab.4 Effects of heat treatment on the mold spore concentration

2.3.4 紫外線對主要霉菌生長的影響

如表5 所示，聚多曲霉和產黃青霉對紫外線不敏感。聚多曲霉和產黃青霉經紫外線處理10 min、20 min、30 min、1 h、2 h，霉菌數量沒有明顯變化。

表5 不同紫外線照射時間對霉菌孢子濃度的影響Tab.5 Effects of different ultraviolet irradiation time on the concentration of mold spores CFU/mL

2.3.5 不同濕度對主要霉菌生長的影響

不同濕度下聚多曲霉和產黃青霉生長直徑如表6所示，濕度的增加，有利于聚多曲霉的生長，當濕度為90%時，聚多曲霉生長最快。產黃青霉生長速度隨著濕度的增加先增加后減少，當濕度為70%時，產黃青霉的生長速度最快。

表6 培養濕度對霉菌生長狀況的影響Tab.6 Effects of humidity on the growth of molds

3 討論

本研究從9種手工雪茄煙支中分離得到8種霉菌，主要為曲霉屬、青霉屬和擬青霉屬。相關研究表明，曲霉屬和青霉屬是報道較多的導致卷煙及煙葉霉變的主要霉菌，其中數量最多的是黑曲霉、匍匐曲霉、紅曲霉、產黃青霉等[12,22-23]。本研究發現導致手工雪茄霉變的主要霉菌為聚多曲霉和產黃青霉，其中產黃青霉被報道是誘發云南、山東存儲片煙霉變的主要霉菌[17-18,24]，而由聚多曲霉引起雪茄霉變的研究尚未見報道。與卷煙及煙葉相比，雪茄煙總氮和生物堿的含量較高，糖含量較低，微生物生長基質不同，優勢霉變菌群也不盡相同，而目前國內外尚未見關于手工雪茄霉變微生物的研究。

霉菌的最適生長溫度為25～30℃[12]，不同霉菌之間存在差異。聚多曲霉、產黃青霉在DG18 培養基上生長最快，在溫度40℃時生長最慢甚至不生長，孢子懸浮液在60℃熱處理下失活，紫外照射對其無顯著影響；聚多曲霉在濕度為90%時，產黃青霉在濕度為70%時，生長速度最快。因此，在雪茄生產過程中可以通過控制溫度或熱處理等方式抑制主要霉菌的生長繁殖，進而控制霉變發生。但本研究未能全面了解主要霉菌在雪茄煙支上的生長規律，后續將通過以手工雪茄煙支為介質，研究主要霉菌在雪茄煙支上的生長情況，為手工雪茄霉變的防治提供更具參考價值的技術依據。

4 結論

曲霉屬、青霉屬和擬青霉屬是引起手工雪茄煙霉變的主要霉菌菌屬，其中聚多曲霉和產黃青霉是導致手工雪茄霉變的主要霉菌菌株。聚多曲霉和產黃曲霉適宜生長的培養基為DG18，其孢子懸浮液在60℃失活，對紫外照射不敏感。聚多曲霉最適生長溫度30℃、濕度90%。產黃曲霉最適生長溫度25℃、濕度70%。