堿法提取茶酒糟中茶蛋白及其抗氧化抑菌研究

葉有明， 廖政達 ， 韋佳汝， 韋 華， 唐玉梅

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 來賓 546199；2.廣西三江縣吉龍農(nóng)業(yè)科技開發(fā)責任有限公司，廣西 柳州 545500）

茶酒是以茶葉、 蔗糖和水為主要原料釀制而成的具有保健功能的酒（周丹丹等，2010），既具有茶的清香還具有抗氧化、抗菌消炎等作用（胡桂萍等，2016）。研究發(fā)現(xiàn)，茶酒釀造的副產(chǎn)物茶酒糟中仍然含有茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶蛋白等較多的營養(yǎng)成分（羅發(fā)美等，2020）。茶蛋白是一種天然的植物蛋白，主要存在于植物細胞中（王威威等，2022）。 在茶蛋白中非水溶性蛋白約為80%，其中含有80%谷蛋白、13%醇溶性蛋白質和少量球蛋白、白蛋白（陸晨，2012）。由于茶蛋白具有溶解性、起泡性、乳化性等較好的理化性質以及抑菌性、抗氧化性等生理活性，可有效地抑制腐敗菌活性（王洪新等，2005），因此可作為天然的飼糧添加劑，在禽畜飼養(yǎng)中廣泛應用。

目前， 非水溶性蛋白質提取的方式主要有酶法、復合法和堿液浸提法（金紅等，2017；李永富等，2015；羅紅玉等，2010）。 其中利用堿液浸提茶酒糟中的蛋白質是最傳統(tǒng)的方法， 堿性溶液對茶酒糟中蛋白質的氫鍵具有破壞作用， 其可使蛋白質的溶解性增加（譚曉妍等，2018），提高提取時蛋白質的溶出。 酶法提取蛋白質，條件比較溫和，能夠使得與蛋白質相連的物質水解， 提高蛋白質的提取率（李圓圓等，2013）。 復合法采用微波、超聲波、酶法等結合提取茶渣中蛋白質，極大增加了蛋白質提取率（陳仕學等，2015）。本文以蒸餾茶酒酒糟為原料， 采用恒溫水浴振蕩輔助堿法提取茶酒糟中蛋白質， 并對提取得到的茶蛋白進行抗氧化和抑菌性能研究， 為茶蛋白作為飼料在禽畜飼養(yǎng)中應用提供依據(jù)。

1 試驗材料及儀器

1.1 材料與試劑 茶酒糟：廣西三江吉龍農(nóng)業(yè)科技有限公司。菌種：大腸桿菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，學院保藏菌種。 氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、甲醛、乙酰丙酮、硫酸銨、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、硫酸鉀、硫酸、95%乙醇：西隴科學股份有限公司；水楊酸、對硝基苯酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯基：合肥巴斯夫生物科技有限公司，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備 電熱恒溫鼓風干燥箱：鶴壁市華泰儀器儀表有限公司，粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司，水浴恒溫振蕩器：杭州旌斐儀器科技有限公司，可見分光光度計：北京北分瑞利分析儀器有限公司，旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器生產(chǎn)廠，臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，電熱恒溫真空干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司，電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司，傅里葉紅外光譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

2 試驗方法

2.1 茶酒糟中蛋白質的提取工藝流程 茶酒糟→烘干→粉碎→過篩（100 目）→熱水浸提→過濾去除上清液→茶酒糟水浴振蕩堿液提取→6000（r/min） 離心10 min→收集上清液→消化→測定吸光度值。

2.2 茶蛋白質的測定 茶蛋白質參照《GB5009.5-2016 食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》（2017）進行測定。吸取試樣溶液和試劑空白溶液各2 mL 于25 mL 的具塞比色管中， 分別加入4 mL顯色劑和4 mL 乙酸鈉-乙酸緩沖溶液，混勻。 在100 ℃恒溫水浴中反應15 min， 將比色管取出冷卻后，置于1 cm 比色皿中，在最大吸收波長400 nm處測定其吸光度值， 利用所測得的氨氮標準曲線的回歸方程，計算得到的提取液中氮的含量，按下式計算茶酒糟中蛋白質的提取量。

式中：C 為提取液中氮的含量，μg；m 提取液的質量，g；V1為提取液體積，mL；V2消化液體積，mL；V3為試樣溶液總體積，mL；V4試樣溶液體積，mL；1000 為換算系數(shù)；6.25 為轉換系數(shù)。

2.3 茶蛋白質提取的單因素試驗

2.3.1 料液比對茶蛋白質提取量的影響 稱取1 g茶酒糟粉末分別置于5 個干燥的錐形瓶中， 固定NaOH 溶液的濃度為0.3 mol/L， 料液比為1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（g/mL），在50 ℃恒溫水浴中振蕩10 min，提取茶蛋白質，研究料液比對茶蛋白質提取量的影響。

2.3.2 浸提時間對茶蛋白質提取量的影響 稱取1 g 茶酒糟粉末分別置于5 個干燥的錐形瓶中，固定料液比為1：25（g/mL），NaOH 溶液濃度為0.3 mol/L，在50 ℃恒溫水浴中分別振蕩6、8、10、12 min 和14 min，提取茶酒糟中蛋白質，研究浸提時間對茶蛋白質提取量的影響。

2.3.3 浸提溫度對茶蛋白質提取量的影響 稱取1 g 茶酒糟粉末分別置于5 個干燥的錐形瓶中，料液比為1：25（g/mL），堿液濃度0.3 mol/L，在溫度分別為30、40、50、60 ℃和70 ℃的恒溫水浴中振蕩12 min，提取茶酒糟中蛋白質，研究浸提溫度對提取茶蛋白質的影響。

2.3.4 堿液濃度對茶蛋白質提取量的影響 稱取1 g 茶酒糟粉末分別置于5 個干燥的錐形瓶中，固定料液比1：25（g/mL），按照NaOH 溶液濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 和0.5 mol/L，在60 ℃的恒溫水浴中振蕩12 min， 提取茶酒糟中蛋白質，研究堿液濃度對茶蛋白質提取量的影響。

2.4 響應面法優(yōu)化試驗 根據(jù)從茶酒糟中提取蛋白質的單因素試驗結果，以料液比、浸提溫度、浸提時間和堿液濃度四個因素為響應面試驗設計中的因素， 以茶酒糟中蛋白質提取量為響應值進行工藝條件優(yōu)化。 采用Design-Expert8.0.6 軟件，設計Box-Behnken 的中心組合試驗方案，本試驗選取四因素三水平設計試驗， 響應面安排表如表1 所示。

表1 響應面試驗設計

2.5 紅外光譜檢測

2.5.1 茶蛋白質樣品的制備 將茶蛋白提取液濃縮后，置于電熱恒溫真空干燥箱24 h，將其烘干研磨，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 紅外光譜檢測方法 參照李圓圓（2013）的方法對茶蛋白進行紅外表征，觀察其特征基團。

2.6 茶酒糟中蛋白質抗氧化活性測定

2.6.1 茶酒糟中蛋白質提取液的制備 把最佳條件下制備得到提取液，在60 ℃的旋轉蒸發(fā)器中濃縮至原來體積的1/2 后， 置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 羥自由基清除率測定 參照謝雨尋等（2022）的方法，按下式計算茶蛋白對羥自由基的清除率：

式中：Ao為空白組對照；Ai為樣品組的吸光度；Aj為樣品本底的吸光度。

2.6.3 DPPH 自由基清除率測定 參照參照謝雨尋等（2022）的方法，按下式計算茶蛋白對DPPH·的清除率：

式中：Ao為空白組對照；Ax為樣品組的吸光度；Ay為樣品本底的吸光度。

2.7 抑菌試驗 抑菌試驗主要參照蘇巧玲等（2022）的方法并作修改。選取大腸桿菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3 種菌種作為試驗材料，采用牛津杯法測試茶蛋白的抑菌活性， 采用湯強等（2018）的方法配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

茶蛋白提取液經(jīng)濃縮，烘干。準確稱取一定量的茶蛋白粗提物， 使用50 mL 的無菌水溶解，采用連續(xù)稀釋法，配制成8 組不同濃度（0、0.1559、0.3117、0.6233、1.2467、2.4934、4.9867、9.9734 mg/mL）溶液，紫外燈下滅菌30 min。

取直徑為6 mm 的濾紙片， 放到不同濃度的茶蛋白溶液浸泡2 h， 貼于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，使其充分擴散后，放入培養(yǎng)箱，在37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌水浸濕的濾紙片作空白，測量各抑菌圈直徑（趙建英等，2022）。 每個菌種分別在不同的茶蛋白濃度條件下做平行試驗3 個，結果取平均值。

3 結果與分析

3.1 茶蛋白質提取的單因素試驗結果

3.1.1 料液比對茶蛋白質提取量的影響 由圖1可知，在料液比為1：15 ～1：35（g/mL）時，茶蛋白質的提取量隨NaOH 溶液體積的增大而增加，料液比1：25 （g/mL) 時蛋白質提取量達到最大為17.93（mg/g）。 料液比在1：25（g/mL）之后，由于茶酒糟中的蛋白質充分溶出， 蛋白質的提取量不會隨之增多。因此，可以初步確定從茶酒糟中提取蛋白質的最佳料液比為1：25（g/mL）。

圖1 料液比對茶酒糟中蛋白質提取量的影響

3.1.2 浸提時間對茶蛋白質提取量的影響 由圖2 可知，浸提時間在6 ～12 min 時，隨著浸提時間的不斷延長，茶蛋白質的提取量增加明顯，主要是由于浸提的是茶酒糟表面易溶出的谷蛋白和醇溶蛋白，在水浴振蕩時間為12 min 時，蛋白質提取量達最大值18.60 mg/g。 當時間過長時，部分蛋白在溶液中長時間受熱發(fā)生水解（梁杰等，2020），導致提取率下降。 因此，可以初步選擇12 min 為蛋白質提取的最佳浸提時間。

圖2 浸提時間對茶酒糟中蛋白質提取量的影響

3.1.3 浸提溫度對茶蛋白質提取量的影響 由圖3 可知， 水浴振蕩浸提茶蛋白質的溫度在30 ～60 ℃時，隨著水浴振蕩溫度的不斷上升，茶酒糟中蛋白質的提取量也不斷增加。 在浸提溫度為60 ℃時，蛋白質提取量最大可達19.10 mg/g，溫度過高提取率會下降， 原因是溫度過高蛋白質會變性（梁杰等，2020），所以溫度升高，將不利于蛋白質的提取。 因此，可以初步確定60 ℃為茶酒糟中蛋白質提取的最佳浸提溫度。

圖3 浸提溫度對茶酒糟中蛋白質提取量的影響

3.1.4 堿液濃度對茶酒糟中蛋白質提取量的影響由圖4 可知， 在NaOH 溶液濃度為0.1 ～0.3 mol/L時， 茶酒糟中蛋白質提取量隨NaOH 溶液濃度的增大而增加，在堿液濃度為0.3 mol/L 時，蛋白質提取量達最大值19.4 mg/g。 由于在較高濃度堿液的情況下，蛋白質易變性和水解，造成蛋白質分子之間肽鍵的斷裂， 導致提取液中的非蛋白物質增多（林彬彬等，2018）。從而導致茶酒糟中蛋白質提取量減少。 因此，選擇NaOH 溶液濃度0.3 mol/L為最佳堿液濃度。

圖4 堿液濃度對茶酒糟中蛋白質提取量的影響

3.2 茶酒糟中蛋白質提取的工藝優(yōu)化

3.2.1 響應面法優(yōu)化試驗 使用Design-Expert8.0.6 軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進行分析， 建立二次回歸方程，得到自變量料液比（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）和堿液濃度（D）與響應值茶酒糟中蛋白質提取量之間的二次多項回歸方程：Y=-45.06+7.32A+11.92B+9.73C+124.93D-8.15×10-3AB-2.85×10-3+0.98AD+5.09×10-3BC-1.83BD+1.53CD-0.15A2-0.48B2-0.08C2-366.33D2。

表2 響應面設計茶酒糟中蛋白質提取試驗結果

對上述回歸模型進行顯著性檢驗， 其結果見表3 所示。 表3 為各變量對茶酒糟中蛋白質提取量的方差分析， 從表中可看出模型P＜0.001，即此模型為極顯著， 失擬項P =0.0581＞0.05 為不顯著，說明該模型預測與實際試驗相符，可用于茶酒糟中蛋白質的提取。 在響應面中復合相關系數(shù)R2=0.9581，R2Adj=0.9036， 表明該設計模型與試驗的擬合程度良好。 各變量的F 值能反映出對茶酒糟中蛋白質的提取量的影響強度，F(xiàn) 值越大對提取量的影響越大， 各變量對蛋白質提取量的顯著性順序為浸提溫度＞料液比＞浸提時間＞堿液濃度， 因此可知浸提溫度直接影響蛋白質提取量的大小，而料液比、浸提時間和堿液濃度對蛋白質提取量的影響較小。

表3 茶酒糟中蛋白質提取量響應面回歸方程的方差分析

3.2.2 響應面圖形分析 依據(jù)響應面圖形分析的原則，判斷各因素間交互作用的顯著性，需結合圖形和方差分析表的結果綜合判斷。由圖5 可知，圖中（a）為料液比和浸提時間的交互作用，由圖可知料液比和浸提時間的曲線平緩，在設定的范圍內，其結果變化幅度不大， 說明這兩個因素對蛋白質的提取量影響較小。圖中（b）為料液比和浸提溫度的交互作用， 由圖可知料液比對提取量的影響不顯著，而浸提溫度的坡面比較陡峭，有明顯的上升和降低的趨勢， 說明浸提溫度對蛋白質提取量的影響較大， 與方差分析表中浸提溫度對蛋白質提取量影響為顯著的分析結果一致。 圖（c）（d）（e）（f）與上述分析一致，表明浸提溫度對蛋白質提取量影響顯著，而料液比、浸提時間和堿液濃度對蛋白質提取量的影響不顯著。

圖5 各因素交互作用

3.2.3 驗證試驗 通過軟件分析， 可得從茶酒糟中提取蛋白質的最佳試驗條件為料液比為1：25 g/mL，堿液濃度0.3 mol/L，在60 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩12 min。 應用最佳試驗條件，進行3 組平行試驗檢測提取液中蛋白含量， 得到蛋白質提取量平均值為24.62 mg/g， 與預測最優(yōu)模型結果24.12 mg/g 相近，證明此試驗方法重復性好，適用于茶酒中蛋白質的提取。

3.3 紅外光譜檢測結果 由圖6 可知， 在3413 cm-1處有強吸收峰， 為O-H 伸縮振動峰；2939 cm-1處有弱吸收峰，為C-H 拉伸引起；2312、2126 cm-1和1410 cm-1均為蛋白質肽鍵或氨基中的NH 鍵形成的吸收峰，其中2312 cm-1處為蛋白中亞甲基和次甲基彎曲振動的二倍頻區(qū)，2126 cm-1處為蛋白或氨基中N-H 鍵伸縮振動或彎曲振動的倍頻區(qū)和合頻區(qū)，1410 cm-1處為肽鍵和氨基中N-H 鍵伸縮振動一倍頻區(qū)。 所以可以推斷出該樣品中有N-H 鍵和肽鍵等基團，該樣品與蛋白質中主要基團一致。

圖6 茶酒糟中蛋白質紅外光譜圖

3.4 茶蛋白質抗氧化試驗

3.4.1 茶蛋白質對羥自由基清除效果 由圖7 可知，蛋白質濃度為1 ～5 mg/mL 時，其對羥自由基的清除效果逐漸增強，最高時清除率可達26.6%。

圖7 茶酒糟中蛋白質對羥自由基清除效果

3.4.2 茶酒糟中蛋白質對DPPH·清除效果 由圖8 可知， 蛋白質濃度為1 ～5 mg/mL 時， 其對DPPH·的清除效果逐漸增強， 最高時清除率為34.0%。

圖8 茶酒糟中蛋白質對DPPH·清除效果

考慮到提取液本身色素影響，由于顏色較深不便于測定吸光度值， 所以未繼續(xù)測定在5 mg/mL之后濃度的提取液對羥自由基的清除效果， 但從茶蛋白質對羥自由基和DPPH·的清除效果來看，茶蛋白質具有一定抗氧化活性。

3.5 抑菌試驗結果 由表4 可知，茶蛋白對不同菌種具有較強的抑菌能力， 因為除了茶蛋白具有一定的抑菌能力外， 茶酒糟提取得到的蛋白質中含有茶多酚， 茶多酚也具有抑菌能力 （魏漢等，2022）。茶蛋白對不同菌種的抑菌效果與菌種的類型和提取液濃度有關， 對不同菌種的抑菌能力大小依次為大腸桿菌＞表皮葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌。 茶蛋白提取液對三種供試菌的最小抑制濃度分別為0.3117、0.6223、1.2467 mg/mL，其對細菌的抑制作用隨濃度的增大而增強。

表4 抑菌試驗結果

4 結論

本試驗結果表明：（1）通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化，得到最佳提取工藝：NaOH 溶液濃度為0.3 mol/L，料液比為1：25（g/mL），60 ℃的水浴中振蕩12 min，在此條件下茶酒糟中蛋白質的最大提取量為24.62 mg/g。 （2）對茶酒糟中提取的蛋白質粗制品掃描紅外光譜， 可以推斷出該樣品中有N-H 鍵和肽鍵等基團，該樣品與蛋白質中主要基團一致。（3）將從茶酒糟中提取出來的蛋白質進行抗氧化試驗，當茶蛋白提取液濃度為5 mg/mL 時，其對DPPH·和羥自由基清除率分別為34.0%和26.6%，表明茶蛋白具有一定的抗氧化性。 （4）抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，茶蛋白對大腸桿菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都有抑制作用， 抑菌效果與菌種的類型和提取液濃度有關， 抑制作用隨濃度的增大而增強。