高速逆流色譜分離制備高純度牛蒡多酚及其抗氧化研究

伍智蔚， 董 露， 韓佳佳

（1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110015；2.沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110122）

牛蒡（Arctium Lappa L）又名：惡實(shí)、大力子、東洋參，原產(chǎn)于中國(guó)，可與人參媲美[1]。多酚，分布于植物的果實(shí)、莖、根和葉，且具有多種活性[2]，如清除自由基，延遲衰老，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制腫瘤和治療心血管疾病等[3]。Ferracane 等人[4]對(duì)牛蒡成分進(jìn)行了大量的分析，發(fā)現(xiàn)牛蒡中含有非常豐富的多酚類物質(zhì)。在食品行業(yè)，牛蒡多酚類物質(zhì)可被用作一種天然抗氧化劑、天然抗菌劑和保健性功能因子，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5]。一般情況下，酚類化合物可采用溶劑/水提取、超聲波提取法、酶法以及超臨界提取[6]。在酶法提取工藝中，目標(biāo)組分容易發(fā)生變化，酶法提取的成本可能會(huì)提高[7]。超臨界萃取法不存有毒性的溶劑，這種方法必需有專門的設(shè)備，所以它需要巨額的資金支持[8]。溶劑萃取是提取多酚的最流行最普及的手段。典型的溶劑包括甲醇，丙酮，乙醇等，其中最常用溶劑為乙醇和水[9]。同時(shí)超聲波法通過(guò)空化效應(yīng)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞，加快目標(biāo)成分分離，從而縮小提取的時(shí)間，減弱高溫對(duì)有效成分的損壞[10]。在分離純化方面，高速逆流色譜（High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）分離因其液-液分配色譜的獨(dú)特特點(diǎn)及簡(jiǎn)便的溶劑體系，可應(yīng)用于單個(gè)產(chǎn)物的精制以及天然產(chǎn)物的粗提物的提純[11]。本實(shí)驗(yàn)利用乙醇提取和超聲波提取結(jié)合的方法，旋蒸濃縮后得到牛蒡多酚粗提物；結(jié)合高速逆流色譜分離純化技術(shù)，建立高純度牛蒡多酚的制備分方法，為牛蒡多酚的分離純化以及大量生產(chǎn)提供一些新的方法與研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1）主要儀器設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器設(shè)備有KQ-1000DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D 型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司），T600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），TEB300C 型高速逆流色譜儀（上海同田生物有限公司），ME104E 型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

2）主要試劑

牛蒡購(gòu)于遼寧省沈陽(yáng)市雨潤(rùn)農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所植物分類專家鑒定為菊科牛蒡?qū)僦参铩Ｒ掖肌⒄〈肌⒁宜嵋阴ゾ鶠榉治黾儯姿帷⒓状紴樯V純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

牛蒡多酚的提取方法為有機(jī)溶劑乙醇提取和超聲波提取相結(jié)合。用電子天平準(zhǔn)確稱取干燥的牛蒡粉100 g，放入以固液比1∶8 為標(biāo)準(zhǔn)，加入70%的乙醇溶液中。將其放入超聲波清洗儀中超聲40 min 后，過(guò)濾，濾液在60 ℃下水浴旋蒸12 min，然后將其用70 ℃的水浴蒸干殘留乙醇，將樣品置于培養(yǎng)皿中，靜置待用。

1.2.2 溶劑體系的制備

根據(jù)選擇的最佳溶劑體系的比例，在2000 mL 的容器中配置2000 mL 的溶劑體系。制備后，將其充分地震蕩；搖勻20 min 后，將其靜置12 h。靜置完成后，將兩相溶液分別放到2000 mL 的錐形瓶中，固定相是上相，流動(dòng)相是下相，將它們超聲脫氣60 min，靜置一段時(shí)間。再用移液管分別移取10 mL 的上相和10 mL的下相于試管之中，向試管中加入500 mg 牛蒡提取物。將其超聲30 min，使樣品全部溶解在兩相溶劑中，靜置待用。

1.2.3 溶劑體系的選擇與優(yōu)化

根據(jù)樣品的極性，選擇合適的溶劑體系。先從經(jīng)典體系出發(fā)，配置多種溶液比例放于試管中，劇烈震蕩試管，將其放在超聲波清洗器里面超10 min，靜置。待兩相溶液達(dá)到平衡后，各取5 mL 上下相溶劑，放置在同一25 mL 試管中，向其試管加入一定量的樣品。將其放置在超聲清洗器里面超聲30 min，拿出、靜置1 h。待樣品在兩相間均勻地分配平衡后，取相同體積的上下相溶液，將其在砂芯過(guò)濾裝置（0.45 μm 尼龍濾膜）中過(guò)濾1 次。用高效液相色譜分別測(cè)定目標(biāo)組分的上下相中的峰面積A 上和A 下。根據(jù)公式計(jì)算出分配系數(shù)K 值，根據(jù)分配系數(shù)是否在0.5 ～2.0 之間來(lái)初步判定溶劑體系是否合適。

1.2.4 高速逆流色譜分離條件優(yōu)化

1）固定相保留率的測(cè)定

主機(jī)分離管路的體積在一定條件下是一定值。首先通過(guò)泵入固定相后，記錄總進(jìn)入固定相的體積V入、固定相溢出的體積V溢出，計(jì)算分離管路的體積V總=V入-V溢出。然后，向主機(jī)管路中泵進(jìn)入流動(dòng)相后，得到流動(dòng)相所推出上相（固定相）體積V出。最后根據(jù)保留率計(jì)算公式w=（V總-V出）/（V總-20）×100%計(jì)算出固定相保留率。HSCCC 固定相的保留率影響樣品分離的效果，當(dāng)固定相的保留率大于等于40%時(shí)，樣品的分離效果較好。

2）流動(dòng)相流速的優(yōu)化

流速是影響HSCCC 分離效果的很重要因素，主要影響分離時(shí)間的長(zhǎng)短和分離度，在分離過(guò)程中選擇合適的流動(dòng)相流速很關(guān)鍵。研究1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min 這5 個(gè)流速，并在高速逆流色譜儀800 r/min 的轉(zhuǎn)速、25 ℃的溫度條件下進(jìn)樣，以此來(lái)研究HSCCC 流速的變化對(duì)固定相保留率的影響。

3）轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

高速逆流色譜儀的轉(zhuǎn)速是影響固定相保留率的主要因素，高的轉(zhuǎn)速可以獲得更好的保留率。轉(zhuǎn)速過(guò)高會(huì)給分離管帶來(lái)很大壓力，從而使分離管受到損傷。我們研究700 r/min、750 r/min、800 r/min、850 r/min、900 r/min 5 個(gè)轉(zhuǎn)速條件。保持其他最佳條件不變，我們研究HSCCC 轉(zhuǎn)速的變化對(duì)固定相保留率的影響。

4）分離溫度的優(yōu)化

HSCCC 溫度也會(huì)對(duì)固定相的保留時(shí)間產(chǎn)生影響。我們研究15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃這5 個(gè)溫度條件。保證其他最佳條件不變，我們研究溫度對(duì)高速逆流色譜儀固定相保留時(shí)間的影響。

1.2.5 高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分析

按下列條件進(jìn)行HPLC 分析：色譜柱是Diamonsil Plus C18 色譜柱，250×4.6 mm，5 μm；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流動(dòng)相為1%冰乙酸：甲醇=3：1；流速大小為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.6 各組分的抗氧化活性

以最佳提取純化工藝制備的3 個(gè)組分（I、II 和III）為研究對(duì)象，以維生素C（Vc）為空白對(duì)照，采用試劑盒測(cè)試法測(cè)定各組分DPPH 溶液和ABTS 自由基清除能力。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)立3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用Origin（版本2018）軟件進(jìn)行畫圖和方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC 溶劑體系的選擇與優(yōu)化

HSCCC 進(jìn)行樣品分離的關(guān)鍵就是樣品在溶劑體系中具有合適的分配系數(shù)（目標(biāo)物上相峰面積與下相峰面積比，K）。我們初步選定氯仿-甲醇-正丁醇-水和乙酸乙酯-正丁醇-水為兩相的溶液體系，不同溶劑體系的選擇與優(yōu)化見(jiàn)表1。

表1 溶劑體系的選擇與優(yōu)化

由表1 知，在經(jīng)典溶劑體系氯仿-甲醇-正丁醇-水（4：3：0.2：2，v/v）中，其HPLC 譜圖的出峰在上相，下相只存在1 個(gè)峰，且峰面積較小，出峰慢，分配系數(shù)為1.98；隨著增加正丁醇和水的比例，減少甲醇的比例，多酚特征峰仍然出在上相，下相出峰少且出峰慢，且分配系數(shù)均大于2，故舍棄該溶劑體系。而在溶劑體系乙酸乙酯-正丁醇-水中，隨著乙酸乙酯和正丁醇比例的增加，分配系數(shù)逐漸增大，當(dāng)乙酸乙酯：正丁醇：水=3：4：5 時(shí)，分配系數(shù)為0.93，特征峰比較圓滑，而其他溶劑比例的特征峰面積比較寬扁，因此，選擇溶劑體系乙酸乙酯：正丁醇：水=3：4：5 為最佳分離體系。

2.2 高速逆流色譜分離及條件優(yōu)化

2.2.1 固定相保留率的測(cè)定

由表2 可知，主機(jī)分離管路的總進(jìn)入固定相的體積V入為342 mL，固定相溢出的體積V溢出為50 mL，所以管路測(cè)定總體積V總=V入-V溢出=292 mL。而流動(dòng)相所推出上相體積V出為120 mL，所以固定相保留率=×100%=63.2%，本文所采用溶劑體系的固定相保留率大于40%，滿足固定相保留率的要求。

表2 固定相保留率測(cè)定結(jié)果 單位：mL

2.2.2 流動(dòng)相流速的影響

在高速逆流色譜儀轉(zhuǎn)速為800 r/min 的情況下，我們研究1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min 這5 個(gè)流速下固定相保留率的變化情況，并觀察待測(cè)物質(zhì)中各組成成分的色譜分離情況，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同流動(dòng)相流速對(duì)固定相保留率的影響

圖1顯示，當(dāng)流速大小小于2.0 mL/min 時(shí)，固定相的保留率都大于70%。較小的流速能夠得到比較好的保留率，但又會(huì)延長(zhǎng)體系的平衡時(shí)間，從而對(duì)分離的效果產(chǎn)生影響。流速較大時(shí)會(huì)減少固定相保留率，對(duì)分離的效果造成改變。故本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相的流速選取2.0 mL/min，這樣既可以有很好的分離效果，同時(shí)也可以縮短分離時(shí)間。

2.2.3 轉(zhuǎn)速的影響

圖2 顯示，隨著轉(zhuǎn)速愈來(lái)愈大，固定相保留率也愈來(lái)愈大。提高轉(zhuǎn)速，螺旋管柱中兩相間的分配和分離頻率也會(huì)相應(yīng)地增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速高到一定程度后，固定相會(huì)大量流失，從而減弱分離效果。結(jié)合轉(zhuǎn)速對(duì)分離柱和分離效果影響，本實(shí)驗(yàn)選擇轉(zhuǎn)速為800 r/min，可以達(dá)到理想的分離能力。

圖2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)固定相保留率的影響

2.2.4 分離溫度的影響

5 個(gè)溫度條件對(duì)固定相的保留率的影響結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同分離溫度對(duì)固定相保留率的影響

合適的分離溫度能夠提高固定相的保留率，繼而增強(qiáng)HSCCC 分離的效果；改善色譜峰的分離度、提高分配效率。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的分離溫度為25 ℃，可以達(dá)到理想的分離效果。

2.3 高速逆流色譜的分離效果

以2 mL/min 的流速、800 r/min 的轉(zhuǎn)速條件，采用HSCCC 對(duì)牛蒡提取物進(jìn)行了分離，固定相的保留率為63.2%，分離時(shí)間為200 min，高速逆流色譜分離圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 牛蒡提取物的HSCCC 分離結(jié)果

圖4顯示，接取有特征吸收峰17～22min、32～50min、78～85 min 和110～128 min 時(shí)間段的分離液樣品，其中17～22 min 為溶劑特征峰，其余分離液分別記為組分I、組分II 和組分III。

2.4 HSCCC 峰成分及純度測(cè)定

應(yīng)用HPLC 法對(duì)制備得到的3 組樣品進(jìn)行純度分析。在3 個(gè)分離組分中主要單一成分對(duì)應(yīng)峰的保留時(shí)間分別為3.54 min、7.76 min 和10.17 min。采用HPLC峰面積歸一化法，計(jì)算得到3 個(gè)單一成分的峰面積百分比分別為80.5%、82.7%和85.6%。利用加標(biāo)回收法測(cè)定各組分定性推斷，3 個(gè)單一成分分別為綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸。

2.5 各組分的抗氧化活性分析

如圖5 所示，圖（a）和圖（b）分別為各組分DPPH和ABTS 自由基去除率分析結(jié)果。隨著Vc 溶液和各組分濃度的增加，DPPH 和ABTS 自由基的去除率逐漸增大。同一濃度下，各組分的DPPH 和ABTS 自由基去除能力均比維生素C 高，說(shuō)明各組分均具有較強(qiáng)的抗氧化能力；各組分按照DPPH 和ABTS 自由基去除率由大至小分別為：組分I（綠原酸）、組分II（咖啡酸）、組分III（對(duì)香豆酸）。

圖5 各組分DPPH 和ABTS 去除率分析結(jié)果

在高速逆流色譜分離中，以最佳條件下提取出的牛蒡粗多酚為原料，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定目標(biāo)組分在兩相間分配系數(shù)K 值，從而選擇最佳的溶劑體系。利用對(duì)不同的溶劑體系及同一溶劑體系中不同比例的比較，最終確定了最佳溶劑體系為：乙酸乙酯-正丁醇-水（3 ∶4 ∶5，v/v）。研究流動(dòng)相在不同流速、轉(zhuǎn)速以及分離溫度對(duì)牛蒡提取物分離效果的影響，確定最優(yōu)分離條件：流速2 mL/min、轉(zhuǎn)速800 r/min、溫度25 ℃，且各個(gè)單一成分的純度分別達(dá)到80.5%（綠原酸）、82.7%（咖啡酸）和85.6%（對(duì)香豆酸）。各組分按照DPPH 和ABTS 自由基去除率由大至小分別為：組分I（綠原酸）、組分II（咖啡酸）、組分III（對(duì)香豆酸）。