臭常山內生真菌綠色合成納米銀的優化、表征及催化活性研究

茍琴,張振

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550000)2(貴州省分析測試研究院,貴州 貴陽,550000)

納米銀(silver nanopartcicles, AgNPs)是指尺寸在1～100 nm的粒子,由于AgNPs具有穩定的物理和化學性能,其在電子、光學、抗菌、催化等方面的應用受到越來越多的關注[1]。AgNPs的制備方法有物理、化學、生物法3種[2],物理和化學合成法對環境會造成一定的污染,存在反應的條件苛刻、生成的AgNPs不穩定等問題[3], 近年來,利用內生真菌生物合成AgNPs被廣泛關注,真菌可以分泌大量合成AgNPs相關的胞外酶、多肽類物質及次級代謝產物等,在合成過程中,這些物質可以充當還原劑角色還原Ag+為AgNPs[4],傳統的物理和化學方法合成AgNPs,其能耗高且使用有毒的化學試劑,采用內生真菌生物合成AgNPs具有綠色環保、有利于對合成條件的優化、使用的設備簡單、花費低等優點,表現出工業化的潛力[5-6]。

臭常山(OrixajaponicaThunb.)為蕓香科臭常山屬植物,在《貴州民間方藥集》《貴陽民間藥草》《貴州草藥》中稱為臭山羊、大山羊[7],其根、莖、葉入藥,主治風熱感冒、瘧疾等病癥[8]。本研究以課題組前期從臭常山莖中分離得到的一株內生真菌Diaportheorixaesp.nov.[9]為研究對象,對其進行生物合成AgNPs的條件優化,并對AgNPs的表征和催化作用進行闡述和分析,為進一步利用內生真菌生物合成金屬納米材料提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗所用菌株Diaportheorixaesp.nov.為本課題組前期從臭常山莖中分離得到[9],已鑒定(GenBank登錄號:No.OK293041)并保存于中國科學院昆明植物研究所和貴州省農業科學院的植物標本室。

1.2 主要試劑和儀器

AgNO3,國藥集團化學試劑有限公司;KBH4,鄭州銀豐化驗試劑有限公司;4-硝基苯酚(4-nitrophenol, 4-NP), 阿拉丁(上海)有限公司;甲基橙、亞甲基藍,天津市致遠化學試劑有限公司,以上試劑均為分析純。

UV1901PC型紫外可見分光光度計,上海奧析科學儀器有限公司;L550型離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;ZEISS sigma500型場發射掃描電鏡,德國蔡司公司;iS5型傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR),美國賽默飛公司;D8 Advanced型X射線多晶衍射儀(X-ray diffraction,XRD),德國布魯克公司;FD-1A-50型冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 培養基

斜面培養用培養基(potato dextrose agar, PDA)(g/L):馬鈴薯300,葡萄糖20,瓊脂15,氯霉素0.1。

種子培養基(potato dextrose broth,PDB)(g/L):馬鈴薯300,葡萄糖20,pH 5.6±0.2。

發酵培養基(g/L):酵母提取粉3、可溶性淀粉20、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、維生素B10.1, pH 6.5。

以上培養基均在115 ℃高溫蒸汽滅菌15 min后使用。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的發酵培養

將菌種Diaportheorixaesp.nov.從4 ℃冰箱中取出,解凍后,接種在PDA斜面上,27 ℃培養7 d,然后從PDA斜面上取4塊活化的菌塊(0.5 cm×0.5 cm)接入PDB培養基中(250 mL錐形瓶裝液量100 mL),27 ℃、140 r/min振蕩培養4 d,獲得菌株種子液。將菌株種子液按接種量7%(體積分數)接入裝液量40%(體積分數)的發酵培養基,將其置于27 ℃,140 r/min的振蕩培養箱內培養4 d。采用布氏漏斗分離菌絲體和發酵液,發酵液棄之,用無菌去離子水充分洗滌菌絲體 3次,獲得無培養基成分的菌體。

1.4.2 菌絲裂解液的制備

取4 g無培養基成分的菌體放入裝無菌去離子水中的錐形瓶中(100 mL/250 mL),27 ℃,140 r/min振蕩培養24 h。采用布氏漏斗收集菌絲體和發酵液,菌絲體棄之,留下的發酵液則為菌絲裂解液,將其置于4 ℃備用。

1.4.3 AgNPs的生物合成及條件的優化

將AgNO3與菌絲裂解液按照體積比為1∶9混合,室溫避光反應。觀察反應混合液的顏色變化,并使用紫外可見分光光度計對反應混合液進行全波長掃描,檢測范圍為300～600 nm[10]。

為了探究不同反應時間對AgNPs合成的影響,按照上述方法,在不同反應時間點(1、2、4、6、8、10、12、24 h)取出混合液進行波長掃描;在最適反應時間條件下,接種不同生物量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g)的菌株獲得菌絲裂解液,按照上述方法合成AgNPs并進行波長掃描;在最適反應時間和菌株生物量條件下,按照上述方法,通過添加不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmo1/L)的AgNO3溶液,對混合液進行波長掃描;在最適反應時間、菌株生物量和底物濃度的條件下,分別調節溶液pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,按照上述方法合成AgNPs并進行波長掃描;在最適反應時間、菌株生物量、底物濃度和pH的條件下,將混合液分別置于15、25、35、45、55、65、75 ℃的條件下避光培養合成AgNPs并進行波長掃描。

1.4.4 AgNPs的質量表征

1.4.4.1 紫外可見分光光度計(ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-vis)分析

取2 mL的AgNPs在300～600 nm下掃描,檢測AgNPs的特征吸收峰,以未加AgNO3溶液的空白菌絲裂解液作對比。

1.4.4.2 場發射掃描電鏡分析

將獲得的AgNPs經干燥、研磨后,在超聲波的作用下,使得AgNPs均勻地分散在酒精中,然后取1滴納米銀酒精溶液滴銅網,晾干后在場發射掃描電鏡下觀察AgNPs的粒徑和形貌。

1.4.4.3 FT-IR分析

取適量AgNPs溶液,離心后用超純水洗滌,棄上清液,重復3次,沉淀物經冷凍干燥除去水分獲得AgNPs粉末。將AgNPs粉末與KBr粉末混合,于瑪瑙研缽中混合研磨進行壓片,室溫下用FT-IR在500～4 000 cm-1掃描測定,掃描速度和間隔為5 kHz和2 nm。

1.4.4.4 XRD分析

取獲得的AgNPs研磨成細小粉末進行壓片,然后進行XRD測試。測試條件:入射光源采用Cu-Kα射線、射線管電流30 mA、電壓40 kV,掃描范圍5°～90°,掃描速度為8°/min,步長為0.02°。

1.4.5 AgNPs的催化活性

1.4.5.1 AgNPs對4-NP的催化還原

選擇4-NP為目標底物,考察菌株D.orixae合成AgNPs的催化性能。在石英比色皿中,將濃度為0.5 mol/L的KBH4溶液取100 μL (現配現用)添加至2.5 mL濃度為0.2 mmol/L的4-NP溶液,二者混合均勻,隨后加入50 μL的AgNPs(0.1 mg/L),在室溫下,使用UV-vis連續全波掃描對反應過程進行監測,通過400 nm左右處峰的吸光度變化來監測4-NP濃度隨時間的變化,掃描范圍為300～600 nm,掃描間隔1 nm,以1 min的時間間隔記錄吸收光譜。

參照文獻[11]的方法,4-NP的催化降解可通過偽一級動力學模型對實驗數據進行擬合,其模型參照公式(1):

(1)

式中:k,催化反應速率常數,min-1;t,反應時間,min;Ct,4-NP在t時刻的濃度;C0,4-NP的初始濃度;At,不同反應時間混合液的吸光度;A0,混合液的初始吸光度;用ln(At/A0)與反應時間t作圖,其斜率即為催化反應速率常數k。

1.4.5.2 AgNPs對有機染料的催化降解

考察菌株D.orixae合成的AgNPs對2種有機染料(甲基橙、亞甲基藍)的催化脫色效果。在石英比色皿中,將濃度為0.06 mol/L的KBH4溶液吸取0.5 mL (現配現用)分別添加至2 mL濃度為0.1 mmol/L兩種有機染料的溶液,二者混合均勻,隨后加入50 μL的AgNPs(0.1 mg/L),在室溫下,使用UV-vis連續全波掃描對反應過程進行監測。甲基橙檢測范圍為300～600 nm,掃描間隔1 nm,以1 min的時間間隔記錄吸收光譜的變化;亞甲基藍檢測范圍為400～800 nm,掃描間隔1 nm,以3 min的時間間隔記錄吸收光譜的變化。

1.5 數據分析

采用Excel 2010、Nano Measurer軟件處理數據,通過SPSS 25.0軟件進行統計學分析,OriginPro 9.0軟件進行繪圖,試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 AgNPs合成條件優化

如圖1-a所示,反應體系從1 h時開始,在416 nm處開始出現明顯的特征吸收峰,證明開始形成AgNPs,隨著反應時間的增加,反應體系中吸收峰的強度也逐漸增大,且12 h時吸收峰的強度達到最大,從24 h之后,吸收峰強度開始降低,這表明體系中AgNPs的量從1～12 h逐漸遞增,24 h時又開始減少,12 h時反應體系已基本完成,因此本實驗選取12 h作為合成AgNPs的最佳時間。

a-反應時間;b-菌株生物量;c-AgNO3 濃度;d-pH值;e-溫度

選擇接種不同菌株生物量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g)獲得的菌絲裂解液對合成AgNPs的影響如圖1-b所示。隨著菌株生物量的增加,其紫外吸收光譜呈現出先增加后降低再增加又降低的趨勢,當菌株生物量為5.0 g時,峰的強度達到最大,由此可知在此生物量范圍內合成的AgNPs的產量最多,因此,本實驗選取菌株生物量為5.0 g的條件下,進行后續實驗。

楊婧等[3]研究表明,在AgNPs合成過程中會受到AgNO3初始濃度的影響,基于此,本實驗探究不同AgNO3濃度對菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs的影響,實驗結果如圖1-c所示。當AgNO3濃度由0.5 mmol/L逐步增加至2.0 mmol/L時,其UV-Vis圖中特征吸收峰的峰值也逐漸增加,當濃度為2.0 mmol/L時,特征吸收峰峰值達到最大值。當AgNO3濃度增加至3.0 mmol/L時,特征吸收峰峰值開始降低,說明濃度為2.0 mmol/L時反應已基本完成,并且隨著濃度的增加,特征吸收峰的位置發生藍移且峰寬也變小,表明AgNPs的粒徑尺寸在逐漸變小,其尺寸的分布更為均一。綜上,本實驗選取AgNO3濃度為2.0 mmol/L為AgNPs合成的最佳濃度。

在不同pH值的反應體系中,菌絲裂解液釋放次生代謝產物的穩定性會受到影響,從而也會影響AgNPs的合成[12]。本實驗設置6個不同的反應體系pH梯度,以探究反應在堿性、中性和酸性條件下對AgNPs合成的影響情況,實驗結果如圖1-d所示。當pH值為5.0～6.0時,其UV-Vis圖表現出的特征吸收峰不明顯,說明了在強酸條件下不利于AgNPs的合成,當pH=7.0時,其UV-Vis圖開始出現特征吸收峰,表明在此條件下逐漸形成AgNPs,pH值增加至8.0時,其特征吸收峰值達到最大,表明反應體系中合成的AgNPs最多,但隨著pH逐漸增加,特征吸收峰值開始逐漸下降,當pH值增加至10,峰值下降幅度較大,由此可以判斷,反應體系處于較高的堿性條件也會不利用AgNPs的合成。有文獻研究表明,在強酸和強堿條件下,AgNPs的合成可被抑制,而在中性或弱堿性條件下,AgNPs的合成可被促進[13-14],這與本實驗結果相一致。綜上,pH=8.0為菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs的最適pH。

因發酵液中存在酶、蛋白質和多糖等生物分子,在不同的溫度環境下可能抑制或促進這些生物分子的活性,從而影響AgNPs的合成過程[15],因此探究溫度對AgNPs的影響具有重要的現實意義,本實驗將接種5.0 g菌株生物量獲得的菌絲裂解液與2.0 mmol/L的AgNO3溶液進行反應,調節反應體系的pH值為8.0,隨后將這7個相同的反應體系放置不同的溫度條件下反應12 h,結果如圖1-e所示。反應體系在55 ℃和65 ℃條件下AgNPs的峰值較其他溫度高,但65 ℃開始出現峰值下降的變化,55 ℃特征吸收峰的峰值達到最大值,表明其到達反應終點,此時合成AgNPs的產量最高,由此可以推測升溫促進了AgNPs的產率,但溫度不宜超過65 ℃;此外,UV-Vis圖中顯示隨著溫度的增加,吸收峰位置開始逐漸紅移,表明AgNPs的粒徑尺寸增大,結合實際應用考慮,實驗采用以AgNPs產量為主要優化的指標。因此,本實驗選取55 ℃作為菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs的最佳溫度。

2.2 AgNPs的質量表征

2.2.1 UV-vis結果分析

在得出最優合成AgNPs條件后,將AgNO3溶液與菌株D.orixae菌絲裂解液混合避光反應12 h后,混合液的顏色從無色變成淡黃色,結果如圖2所示。菌株D.orixae菌絲裂解液與AgNO3溶液反應后,在410 nm處可以看到生成的復合物突顯出一個較強的吸收峰,說明納米銀顆粒存在于生成的復合物中。菌株D.orixae菌絲裂解液中含有蛋白質、糖類、功能酶等生物分子,與AgNO3反應后,將其中的無機物金屬銀離子還原制備成銀納米粒子,生成的AgNPs被賦予較大的紫外吸收波長,結果表明,菌株D.orixae菌絲裂解液可應用于納米銀顆粒的綠色合成。

圖2 菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs的紫外吸收波長

2.2.2 合成AgNPs形貌及粒徑分布

利用掃描電鏡考察了菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs的形貌及尺寸,結果如圖3-a所示,合成的AgNPs為球狀的顆粒,粒徑尺寸均一,分散性好,無明顯團聚現象,從圖中隨機選取不同區域的近100顆AgNPs粒子進行粒徑分析,結果如圖3-b所示,合成的AgNPs粒徑在9～36 nm,主要分布在17～20 nm,平均粒徑為20 nm。

a-掃描電鏡圖;b-粒徑分布圖

2.2.3 FT-IR結果分析

圖4 菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs的紅外光譜圖

2.2.4 XRD結果分析

圖5出現了5個明顯的特征衍射峰,其對應的2θ值分別為38.10°、44.41°、64.51°、77.48°和81.70°,依次與標準銀晶態的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)的晶面相對應(參照JCPDS No.04—0873),說明菌株D.orixae菌絲裂解液合成的AgNPs結構其晶相為面心立方結構。整個衍射圖譜峰寬較寬,晶粒尺寸較小,有雜峰,其原因可能是在合成AgNPs過程中操作不當,引入雜質。

圖5 菌株D. orixae菌絲裂解液合成AgNPs的XRD光譜圖

2.3 AgNPs的催化活性

2.3.1 AgNPs對4-NP的催化還原

4-NP作為一種廣泛應用的硝基芳香化合物,主要被用來生產合成染料、醫藥、炸藥、工業溶劑以及有機磷農藥[21],因其具有高溶解度、穩定性強、毒性大等特性,土壤和水體被4-NP污染后會嚴重威脅人類及其他動植物的正常發育,美國環保局已將其列入優先控制的污染物名單中[22]。以4-NP為模型化合物對合成的AgNPs的催化性能進行研究,在4-NP的還原過程中,KBH4作為還原劑,AgNPs作為催化劑進行催化反應,在此還原反應中,加入了過量的KBH4作為一個確定的因素,以排除其在不同催化反應中的不同作用。4-NP常溫下為淡黃色溶液,其紫外特征吸收峰在 320 nm處,將其加入KBH4后,混合液顏色由淡黃色變為亮黃色,且在UV-vis圖410 nm處出現特征吸收峰, 主要原因是由于在堿性環境下4-NP會生成大量的對硝基苯酚離子所導致。在本實驗中,向混合液加入少量AgNPs后,410 nm處的特征吸收峰強度逐漸減弱,在360 nm處出現了新的吸收峰(4-氨基苯酚),表明4-NP逐漸被還原,并且會產生(4-氨基苯酚)。反應7 min后,410 nm處的特征吸收峰基本消失,去除效率達92.87%,反應溶液顏色由亮黃色逐漸變為無色,證明反應完全(圖6)。根據公式(1)計算可得AgNPs催化4-NP降解的反應速率常數k為0.348 min-1。

圖6 AgNPs對4-硝基苯酚催化還原的UV-Vis光譜圖

2.3.2 AgNPs對有機染料的催化降解

水污染一直是現代社會所關注的民生問題,特別是紡織工業的廢水對環境造成嚴重破壞。紡織工業將未經處理的染料廢水排放到水體中,影響了水生態系統的正常運作,從而導致嚴重的疾病,如人類的肝臟和腎臟受損。染料廢水(如甲基橙、亞甲基藍)具有成分復雜、色度高、生物毒性高等特點[23],是公認的難處理有機廢水,因此,尋求高效、簡單的染料廢水處理技術對于環境的治理具有重要的意義。目前關于生物合成AgNPs用于對有機染料催化降解中的應用研究仍然較少,本實驗利用菌株Diaportheorixaesp.nov.菌絲裂解液合成的AgNPs對2種有機染料進行催化脫色,結果見圖7,在還原劑KBH4的條件下,加入AgNPs后,2種有機染料的脫色速率加快,甲基橙在反應6 min后,465 nm處的特征吸收峰就基本消失,根據吸光度值變化計算出脫色率為85.41%,反應溶液顏色也由橙色逐漸變為無色,證明反應完全(圖7-a);亞甲基藍在反應21 min后,665 nm處的特征吸收峰基本消失,脫色率為93.83%,溶液顏色由藍色逐漸變為無色,證明該反應結束(圖7-b)。反應體系中染料的濃度遠低于KBH4溶液的濃度,整個反應過程中KBH4的量保持不變,符合偽一級動力學模型,根據公式(1)計算出AgNPs的催化反應速率常數k分別為:0.243 min-1(甲基橙)、0.138 min-1(亞甲基藍)。

a-甲基橙;b-亞甲基藍

3 結論與討論

本研究選用菌株D.orixae菌絲裂解液合成AgNPs,對其合成條件進行優化,利用掃描電鏡、FT-IR、XRD對合成的AgNPs進行質量表征,最后利用4-NP和甲基橙、亞甲基藍對合成AgNPs的催化活性進行考察,結果如下:

a)菌株D.orixae可應用于AgNPs的綠色合成,且反應時間、菌株生物量、AgNO3濃度、pH及溫度對AgNPs的合成均會產生一定的影響。

b)合成的AgNPs為球狀的顆粒,顆粒尺寸均一且分散性好,平均粒徑為20 nm;XRD光譜圖顯示合成的AgNPs晶相結構為面心立方結構;通過FT-IR分析可得羥基、羰基、酰胺鍵等官能團可能有助于AgNPs的形成和穩定。

c)本實驗合成的AgNPs對4-NP和甲基橙、亞甲基藍都有較好的催化活性,其催化反應速率常數k分別為:0.348 min-1(4-NP), 0.243 min-1(甲基橙)、0.138 min-1(亞甲基藍)。

d)內生真菌可以產生大量的蛋白質和其他生物分子等,這些生物分子與合成過程中AgNPs的聚集和穩定有關[24],本研究選用的菌株D.orixae菌絲裂解液其細胞能夠分泌蛋白或酶等,以及自身含有多種還原性官能團(如羥基、羰基),能將Ag+還原為AgNPs。利用內生真菌生物合成AgNPs具有方式簡單、環保、易于實現的優勢,對于進一步解析臭常山內生真菌發酵產物合成穩定AgNPs的機制具有重要的指導作用。目前,真菌生物合成AgNPs機理的分析主要依靠FT-IR等常規方法,在未來的研究中,可以利用基因工程等技術改造相關菌株,結合基因組學、轉錄組學等組學方法,更詳細地分析影響真菌生物合成納AgNPs的關鍵基因、蛋白質和調控系統,為今后真菌生物合成AgNPs的工業化生產提供參考與理論支撐。