維生素D輔助低分子肝素治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及對(duì)血栓前狀態(tài)、抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1的影響

張瑞青，劉莉萍，武淑慧

鄭州市中醫(yī)院，1 優(yōu)生優(yōu)育/不孕不育科，2 婦科，3 婦產(chǎn)科，鄭州 450006

美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）定義為2次或2次以上的妊娠失敗；英國(guó)皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)則定義為與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上于妊娠24周前胎兒丟失；我國(guó)通常將3次或3次以上于妊娠28周前胎兒丟失稱為RSA［1-2］。研究顯示［3］，RSA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，約有1/2以上的患者存在血栓前狀態(tài)（prethrombotic state，PTS）。PTS可導(dǎo)致胎盤微血栓，胎盤血供顯著減少，胚胎或胎兒難以正常發(fā)育，致使發(fā)生RSA。除普遍存在PTS外，RSA的發(fā)生還與抗dsDNA抗體、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、可溶性FMS樣酪氨酸激酶1（soluble FMS-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）等血清學(xué)指標(biāo)水平異常密切相關(guān)［4-5］。對(duì)于RSA，既往多給予低分子肝素治療。盡管低分子肝素可改善RSA患者PTS，但其臨床療效不理想［6］。研究顯示［7］，維生素D可增強(qiáng)RSA患者機(jī)體對(duì)胚胎的免疫耐受，提高妊娠成功率。基于此，本研究在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)用低分子量肝素鈉注射液和維生素D滴劑治療RSA，評(píng)價(jià)其臨床療效并探究對(duì)血栓前狀態(tài)、抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1的影響，以期為臨床治療RSA提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月～2022年10月期間于我院治療的120例RSA患者作為研究對(duì)象，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組60例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者及家屬均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識(shí)》［2］中診斷標(biāo)準(zhǔn)者：妊娠 28周前存在3次或3次以上胎兒丟失，也將連續(xù)發(fā)生2次自然流產(chǎn)的患者納入研究。②單胎妊娠者。③年齡23～37歲者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)本研究藥物過敏者。②生殖器官結(jié)構(gòu)異常者。③3個(gè)月內(nèi)使用抗凝、促纖溶及避孕藥物者。④男方精液異?；蚍蚱抟环剑ɑ螂p方）染色體異常者。⑤異位妊娠者。⑥合并內(nèi)分泌、感染疾病者。⑦肝腎功能異常者。⑦其他感染性疾病者。⑧依從性差者。

1.2 研究方法

兩組均給予葉酸片（北京斯利安藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10970079，規(guī)格0.4mg）、黃體酮膠囊（浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041902，規(guī)格50mg）等常規(guī)治療：根據(jù)個(gè)人孕前補(bǔ)充葉酸情況給予葉酸片1～2片/次，口服，qd；黃體酮膠囊100mg/次，口服，bid。對(duì)照組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用低分子量肝素鈉注射液（齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030429，規(guī)格：0.4ml∶5000IU）5000IU/次，皮下注射，qd，治療至孕12周。試驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上口服維生素D滴劑（青島雙鯨藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113033；規(guī)格：每粒含維生素D 400單位）400IU/次，qd，治療至孕12周。期間密切監(jiān)測(cè)血25羥維生素D［25（OH）D］水平，以避免維生素D中毒。若25（OH）D水平≥60ng/ml，則暫停服用維生素D滴劑；直至其水平降至＜60ng/ml，方可再次給予維生素D滴劑。每4周監(jiān)測(cè)1次血25（OH）D水平。

1.3 觀察指標(biāo)

①觀察兩組抗體清除及流產(chǎn)、保胎成功率等妊娠結(jié)局情況。②分別于治療前后采集患者清晨空腹靜脈血2ml，采用TDZ4K低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，r=15cm），以3500r/min于25℃離心10min后取血清，保存于-80℃冰箱內(nèi)待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）；采用凝血酶凝膠空斑法檢測(cè)抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ）活性，試劑盒購(gòu)自上海生物制品研究所。③分別于治療前后采集患者清晨空腹靜脈血2ml，采用TDZ4K低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，r=15cm），以3500r/min于25℃離心10min后取血清，保存于-80℃冰箱內(nèi)待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平，試劑盒購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司。④觀察并記錄兩組患者治療期間一過性過敏、惡心嘔吐、血小板減少、肝功異常等不良反應(yīng)的發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理。計(jì)量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

試驗(yàn)組：年齡23～37歲，平均年齡（30.32±3.38）歲；流產(chǎn)次數(shù)2～4次，平均流產(chǎn)次數(shù)（3.41±0.37）次；孕周5～11周，平均孕周（8.88±0.93）周。對(duì)照組：年齡23～37歲，平均年齡（29.91±3.32）歲；流產(chǎn)次數(shù)2～4次，平均流產(chǎn)次數(shù)（3.36±0.33）次；孕周5～11周，平均孕周（8.81±0.89）周。兩組一般資料比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 兩組一般資料比較 n=60，±s

表1 兩組一般資料比較 n=60，±s

組別年齡（歲）流產(chǎn)次數(shù)（次）孕周（周）試驗(yàn)組30.32±3.383.41±0.378.88±0.93對(duì)照組29.91±3.323.36±0.338.81±0.89 t值0.67030.78120.4212 P值0.50400.43630.6744

2.2 抗體清除率及妊娠結(jié)局情況

試驗(yàn)組流產(chǎn)率（3.33%）低于對(duì)照組（15.00%，P＜0.05）；試驗(yàn)組抗體清除率、保胎成功率均高于對(duì)照組（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組抗體清除率、流產(chǎn)率及保胎成功率比較 n=60，n（%）

2.3 血栓前狀態(tài)指標(biāo)

治療前，兩組PC、PS及AT-Ⅲ活性比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療后，兩組PC、PS及AT-Ⅲ活性均升高（P＜0.05），且試驗(yàn)組高于對(duì)照組（P＜0.05）（表3）。

表3 兩組血栓前狀態(tài)指標(biāo)比較 n=60，±s，%

表3 兩組血栓前狀態(tài)指標(biāo)比較 n=60，±s，%

PC：蛋白C；PS：蛋白S；AT-Ⅲ：抗凝血酶Ⅲ；與同組治療前比較，a：P＜0.05。下同

PC活性PS活性AT-Ⅲ活性治療前治療后治療前治療后治療前治療后試驗(yàn)組52.76±5.6184.77±8.82a48.67±5.13100.65±11.49a75.76±7.91105.83±13.29a對(duì)照組53.18±5.6580.55±8.38a49.05±5.1694.74±9.60a76.32±7.9099.54±11.27a χ2值0.40862.68680.40453.05750.38802.7961 P值0.68360.00830.68660.00280.69870.0060組別

2.4 血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平

治療前，兩組血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療后，兩組血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平均降低（P＜0.05），且試驗(yàn)組低于對(duì)照組（P＜0.05）（表4）。

表4 兩組血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平比較 n=60，±s

表4 兩組血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平比較 n=60，±s

HMGB1：高遷移率族蛋白B1；sFlt-1：可溶性FMS樣酪氨酸激酶1

抗dsDNA抗體（IU/ml）HMGB1（ng/ml）sFlt-1（ng/ml）治療前治療后治療前治療后治療前治療后試驗(yàn)組8.78±0.904.28±0.44a95.15±9.7450.37±5.41a0.68±0.080.47±0.05a對(duì)照組8.75±0.884.55±0.48a94.97±9.7253.64±5.68a0.66±0.070.50±0.06a χ2值0.18463.21190.10133.22911.45742.9753 P值0.85380.00170.91950.00160.14770.0036組別

2.5 不良反應(yīng)發(fā)生情況

兩組患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表5）。

表5 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較 n=60，n（%）

3 討論

PTS為機(jī)體凝血、纖溶及抗凝機(jī)制失調(diào)或障礙導(dǎo)致的病理狀態(tài)，是致使發(fā)生RSA的重要因素［8］。PTS可使血液高凝，致使胎盤供血不足或微血栓形成，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎難以獲得充足的血供而無法正常發(fā)育甚至死亡。PTS還可導(dǎo)致血小板繼發(fā)性增殖，誘導(dǎo)蛻膜發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致RSA［9］。對(duì)于存在PTS的RSA患者，臨床多行抗凝治療，以改善血液高凝狀態(tài)，降低血流阻力，維持胎盤血供［10］。低分子肝素為抗凝藥物，可使抗磷脂抗體及其補(bǔ)體失活，抑制血栓形成。低分子肝素可通過影響凝血因子，阻斷血小板激活，抑制其聚集，以解除PTS，避免形成局部微血栓，進(jìn)而改善胎盤血供［11］。低分子肝素可緩解炎癥反應(yīng)過度激活導(dǎo)致的滋養(yǎng)細(xì)胞損傷，維持胚胎正常發(fā)育。低分子肝素對(duì)內(nèi)源性凝血機(jī)制無影響，不會(huì)導(dǎo)致內(nèi)出血，安全性較高。但因低分子肝素治療RSA難以根治病因，故其臨床療效不理想［12］。維生素D為機(jī)體重要的維生素，對(duì)于避免發(fā)生RSA、維持妊娠正常進(jìn)行具有重要作用［13］。維生素D可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌血栓調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮抗凝作用，以改善PTS［14］。維生素D可通過降低機(jī)體同型半胱氨酸水平緩解PTS，避免微血栓形成及胎盤血管損傷，保護(hù)胚胎血管及維持胎盤血供，以避免發(fā)生RSA［15］。

PC、PS、AT-Ⅲ是反映機(jī)體凝血功能的重要指標(biāo)，其水平低下常預(yù)示機(jī)體處于高凝狀態(tài)［16］。PC活化后可通過抑制多種凝血因子發(fā)揮抗凝作用，從而阻斷凝血進(jìn)程，避免機(jī)體凝血持續(xù)進(jìn)展［17］。PS不但可提高PC活性，增強(qiáng)其抗凝作用，還可結(jié)合多種凝血因子抑制其活化，發(fā)揮抗凝作用［18］。AT-Ⅲ可結(jié)合肝素抑制凝血因子活性，維持機(jī)體抗凝與凝血機(jī)制間的動(dòng)態(tài)平衡［19］。本研究中，經(jīng)治療后，試驗(yàn)組流產(chǎn)率（3.33%）低于對(duì)照組（15.00%，P＜0.05）；試驗(yàn)組抗體清除率、保胎成功率均高于對(duì)照組（P＜0.05）；兩組PC、PS及AT-Ⅲ活性均升高（P＜0.05），且試驗(yàn)組高于對(duì)照組（P＜0.05），提示維生素D輔助低分子肝素治療可抑制RSA的發(fā)生，維持妊娠正常進(jìn)行。

母體免疫紊亂導(dǎo)致無法正確識(shí)別胚胎及對(duì)胚胎的免疫不耐受是RSA發(fā)生的重要因素［20］?？筪sDNA抗體水平大幅升高是自身免疫活性增強(qiáng)的表現(xiàn)。目前，對(duì)于抗dsDNA抗體致使RSA發(fā)生的機(jī)制尚不清晰。部分研究認(rèn)為［21］，抗dsDNA抗體可能通過異常激活機(jī)體免疫，促進(jìn)免疫復(fù)合物于胎盤血管表面沉積，致使胎盤血管損傷?？筪sDNA抗體還可抑制子宮內(nèi)膜發(fā)育，導(dǎo)致胚胎著床及發(fā)育障礙，進(jìn)而導(dǎo)致RSA［22］。HMGB1為DNA結(jié)合蛋白，可經(jīng)細(xì)胞分泌或凋亡細(xì)胞破裂后釋放進(jìn)入血液，參與機(jī)體多種炎癥反應(yīng)。HMGB1可高表達(dá)于胎盤組織，誘導(dǎo)Th1/Th2失衡，致使母體免疫異常，引發(fā)胚胎免疫排斥［23］。sFlt-1多表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，可作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）影響新生血管及子宮內(nèi)膜形成，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)生流產(chǎn)。機(jī)體免疫亢進(jìn)可促進(jìn)sFlt-1生成，誘發(fā)并促進(jìn)RSA進(jìn)展［24］。維生素D可通過抑制B細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，降低抗dsDNA抗體水平，抑制機(jī)體免疫亢進(jìn)，從而緩解機(jī)體過度免疫反應(yīng)［25］。維生素D可通過調(diào)控miR-21發(fā)揮對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖及分化的調(diào)節(jié)作用，從而抑制機(jī)體免疫，改善機(jī)體免疫耐受，維持妊娠正常進(jìn)行［26］。維生素D可增強(qiáng)免疫耐受，在促進(jìn)Th2細(xì)胞增殖的同時(shí)，抑制生成Th1細(xì)胞，糾正Th1/Th2失衡［27］。維生素D還可參與調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子，提高子宮內(nèi)膜容受性，有助于胚胎著床及生長(zhǎng)［28］。本研究中，兩組治療后血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平均降低（P＜0.05），且試驗(yàn)組低于對(duì)照組（P＜0.05），提示維生素D輔助低分子肝素治療RSA可糾正患者母體免疫紊亂，降低血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平。此外，兩組患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），且均較為輕微，提示2種治療方案均具有較高的安全性。

綜上所述，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予維生素D輔助低分子肝素治療RSA可改善患者血栓前狀態(tài)，糾正母體免疫紊亂，降低血清抗dsDNA抗體、HMGB1、sFlt-1水平，維持妊娠正常進(jìn)行，治療效果理想，且安全性較高。然而，本研究仍存在一定的局限性，如選取的樣本較少，且為單中心研究，研究范圍較為狹窄，需繼續(xù)開展大樣本、多中心的研究，以獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)論，為臨床治療RSA提供依據(jù)。