天然蝦青素提取和純化的研究進展

◆作者：郝孔利 張策

◆單位：山東金城生物藥業有限公司

蝦青素（3,3'-二羥基-b,b'- 胡蘿卜素-4,4'- 二酮）是一種氧化類胡蘿卜素，蝦青素（AXN）最初發現于1938 年，并首次用作水產養殖的色素。自1991 年以來，蝦青素已被批準作為食品補充劑的色素（Nouchi等，2020）。蝦青素的抗氧化活性是玉米黃質、葉黃素、角黃素、β- 胡蘿卜素的10 倍，是α-生育酚的100 倍，其抗氧化活性比輔酶Q10 或維生素E 高約100～1000 倍（Zhang 等，2020）。蝦青素對癌癥、高血壓、糖尿病、心血管疾病、胃腸疾病、肝臟疾病、神經退行性疾病和皮膚病在內的多種疾病具有潛在作用，經常被用來對抗病變細胞的氧化損傷（Aneesh 等，2022）。

蝦青素有兩個對稱的手性中心，有3 種異構體（3R，3'R）、(3R，3'S)和（3S，3'S）。合成蝦青素含有三種異構體的混合物，比例為25∶50∶25。天然蝦青素也含有三種異構體，但比例與合成蝦青素不同。藻類產生的蝦青素，例如淡水雨生紅球藻，產生90%以上的3S，3'S 異構體，酵母黃葉菌產生90% 以上的3R，3'R 異構體（Rezanka 等，2020）。合成蝦青素的抗氧化能力低于天然蝦青素，這可能是因為合成蝦青素是外消旋混合物，含有三種異構體。此外由于合成中間體和副產物的潛在殘留，合成蝦青素用于人類存在安全問題（Shah 等，2016）。迄今為止，合成蝦青素尚未被批準用于人類（Koller 等，2014）。目前，市場上95%以上的蝦青素是人工合成的（Nouchi 等，2020）。

在動物飼料的應用中，全微生物細胞可以配制成飼料成分，而不需要提取色素。然而，對于更多的定制應用，如化妝品和食品配料，色素的提取和純化尤為重要（Harith 等，2020）。蝦青素是微生物細胞內的產物，有效的工藝應該使提取的色素保持其穩定性、顏色和生物活性。提取蝦青素的純度決定了它的市場價格，可能在2500～7000 美元/kg之間（Shah 等，2016）。鑒于蝦青素對健康的潛在益處，其在食品工業、醫藥、化妝品和動物飼料（如鮭魚和大蝦）中的需求正在迅速增加。到2025 年，其全球市場預計將達到25.7 億美元（Nouchi 等，2020）。文章擬介紹雨生紅球藻和紅法夫酵母蝦青素下游工藝提取純化的方法，旨在為推動天然蝦青素的規模化生產提供理論依據。

1 細胞回收

AXN 通過生物技術工藝生產，下游工藝的第一步就是細胞回收。通過這種方式生產的蝦青素，必須選擇一種合適的細胞回收方法，以確保得到最多的細胞，并減少與細胞脫水的相關成本。微生物細胞主要通過重力沉降、絮凝、浮選、膜過濾和離心來回收，表1 列舉了這幾種回收方法的優缺點。

表1 微生物細胞回收常用的方法

2 細胞破碎和天然蝦青素的提取

2.1 細胞破碎

AXN 的提取過程中，細胞破碎和提取是相關的，提取AXN的量取決于所選細胞破碎方法的效率。細胞破碎技術主要有珠磨、超聲波、滲透沖擊、高壓勻漿、凍融、酶裂解和化學裂解，這些技術可以單獨應用或組合應用。珠磨和高壓均質等機械方法可以保證AXN 的高破碎率。然而，這些技術的能耗很高，同時這些方法會產生較多的細胞碎片，局部的過度加熱可能會破壞AXN。據報道，珠磨和高壓勻漿主要用于破壞大規模雨生紅球藻細胞的（Panis 等，2016）。有研究表明，β-1,3- 葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶和果膠酶可對雨生紅球藻和紅酵母有很高的細胞破碎率和AXN 提取率（Harith等，2019；Ye 等，2020）。離子液體（IL）是由相對較大的不對稱有機陽離子與較小的無機或有機陰離子組成的鹽。具有高水解活性、對各種有機和無機化合物顯著的增溶能力、高導電性、低揮發性、低粘度以及高熱和化學穩定性等多種特性。Choi 等（2018）評估了10 種基于1- 乙基-3- 甲基咪唑（Emim）的離子液體、果膠酶/纖維素酶（1∶1）和4 mol/L 的HCl 破壞雨生紅球藻細胞，結果表明AXN 的提取率分別為86.71%、71.0%和80.52%。IL 被認為是機械細胞破碎方法的真正替代品（Choi 等，2018；Liu 等，2019）。

2.2 天然蝦青素的提取

2.2.1 傳統溶劑萃取方法

在AXN 提取過程中，大量的AXN 是通過兩步獲得的。第一步涉及細胞破碎，第二步涉及有機溶劑提取。在AXN 提取的過程中，乙醇、丙酮、己烷、異丙醇、二氯甲烷和二甲基亞砜（DMSO）是最常用的，美國食品藥品監督管理局（FDA）將它們歸類為對人類健康低風險物質，這些溶劑在一定限度內被批準用于制藥（L 等，2021）。

2.2.2 新型萃取方法

加壓液體萃取（PLE）是一種在高溫和高壓下應用常規溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的技術。該技術使用的溶劑為液態，更容易滲透到細胞基質中，從而能夠提高AXN 的溶解度和萃取率，但高溫可能會影響不耐熱類胡蘿卜素的穩定性，因此應用該方法時必須把控好溫度（Gallego 等，2019）。

超臨界流體萃取（SFE）具有萃取和分離的雙重作用，超臨界流體具有高滲透性、擴散性，能夠迅速滲透到復雜基質的孔隙中。SC-CO2（超臨界CO2）是大規模生產用最多的技術（Panis 等，2016；X 等，2020）。SC-CO2比傳統有機溶劑更易擴散到細胞內，在溫度為40～60℃下運行，避免了化合物的降解，最終產品無溶劑，在減壓過程中易與AXN 分離，通常使用乙醇作為助溶劑來提高萃取效率（Antonio 等，2018）。影響SFE 萃取率的主要條件是溫度、壓力、助溶劑的類型和濃度、溶劑流速和提取時間。SFE 的主要限制是設備成本高（X 等，2020；Musmarra 等，2020）。

脈沖電場（PEF）輔助提取技術的原理是應用重復的短高壓脈沖來誘導生物材料（植物、動物或微生物細胞）的透化（電穿孔）。這種技術具有低能耗、易于擴展和非熱能的優勢，并且可以最大限度減少細胞碎片的釋放，因此還能夠進一步提高提取物的純度（熊強等，2022）。PEF 會隨著樣品的電導率和質地的變化而變化，因此脈沖持續時間和電場強度應隨樣品的不同進行優化（Aguilar-Machado等，2020）。表2 列舉了不同破壁和提取方法對AXN 回收率的影響。

表2 AXN 細胞破壁和提取方法

Praveenkumar 等（2015）報道了使用金納米手術刀在雨生紅球藻細胞中切開并提取AXN，隨后該細胞治愈了傷口并重新萌發，釋放出含有AXN 的游動孢子。Bauer 和Minceva（2019）使用乙酸乙酯直接從含有雨生紅球藻細胞的培養基中提取AXN。

3 天然蝦青素的純化

AXN 的生物活性已在臨床試驗中得到廣泛測試，其有效性使其成為具有巨大潛力的化合物，可用作營養品或醫藥產品，制備這類產品時，必須保證化合物的純度（L 等，2021）。AXN 提取完成后，由于其他類胡蘿卜素、蛋白質、鹽、酯、細胞碎片、消泡劑、溶劑和其他污染物等雜質，需要進行純化。表3 是有關AXN 純化過程的最新研究結果。

表3 AXN 純化方法

4 結論

天然蝦青素比合成的蝦青素具有更好的生物相容性，但天然蝦青素的生產成本較高。近年來，破壁技術和提取技術取得了很大的進展，為天然蝦青素的高效提取提供了新的思路和方法，如脈沖電場法、離子液體法、DES（低共溶劑）法、雙水相法等破壁提取技術，但這些研究還處于初步階段，沒有進一步運用到生產過程中。SC-CO2技術因其提取效率高且分子沒有降解（溫和的操作條件），而被廣泛用于大規模AXN 提取過程。在制藥應用中，需要高純度產品。目前已通過液- 液色譜結合液- 固色譜的方法得到99%的高純度蝦青素。然而在AXN 生產工藝中未呈現。

天然蝦青素下游工藝占蝦青素生產成本的80%，天然蝦青素生產成本的改進主要是下游工藝，這些階段的任何改進都可能對整個工藝的可行性產生相當大的影響。因此對下游工藝的改進仍然是重中之重。

參考文獻：（略）