糖耐康改善KKAy小鼠Toll樣受體4通路及葡萄糖轉運子4的作用機制研究

王 芬 何華亮 劉銅華 吳麗麗

(1 北京中醫藥大學第三附屬醫院,北京,100029; 2 中國人民解放軍武裝警察部隊北京總隊醫院,北京,100027; 3 北京中醫藥大學教育部中醫養生學重點實驗室,北京,100029)

目前,2型糖尿病已成為世界范圍所面臨的嚴重的公共衛生問題。據統計全球糖尿病的醫療成本已達人均醫療保健支出的3.2倍,而糖尿病并發癥的醫療成本已增加9.4倍[1]。國際糖尿病聯盟預計,2015年全球糖尿病患病率達4.15億,到2040年將增至6.42億人[2]。眾所周知,肥胖及超重與2型糖尿病發病密切相關,因其數量的快速增長,已成為代謝性疾病風險更高的預測因子[3-4]。現已公認,機體的慢性炎癥反應參與了有關肥胖及胰島素抵抗的一系列病理過程,也是2型糖尿病的發病機制之一[5]。故有人呼吁將抗炎劑納入2型糖尿病的治療方案中[6]。為此,加強炎癥通路靶點的研究具有重大的現實意義。

中藥復方糖耐康是治療2型糖尿病的經驗方,是以辨證論治為基礎并結合多年臨床經驗及藥理研究成果組方而成。前期研究結果顯示,該方具有能夠改善胰島素抵抗、調節糖脂代謝、調節腸道菌群等的作用[7]。為進一步探究其作用機制,本研究選取與腸道菌群密切相關的脂多糖介導的Toll樣受體通路中部分炎癥介質作為觀察指標,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 10周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性KKAy小鼠65只,雄性C57BL/6J小鼠13只[北京華阜康生物科技有限股份公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004],體質量(35.5±3.0)g。在SPF級條件下,飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物中心。飼養條件:溫度(21±2)℃,濕度(60±10)%,12 h/12 h光照黑暗循環。合格證號:SYXK(京)2016-0021。符合實驗動物倫理委員會相關指導原則,由動物實驗倫理會審查批準(倫理審批號:2019-067)。普通飼料及高脂飼料(豬油10%、蛋黃粉10%、普通飼料80%)均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 藥物 中藥糖耐康顆粒由北京海德潤制藥有限公司制備。由人參、女貞子、夏枯草、三白草、番石榴葉,按1∶4∶2∶4∶2比例組成。3 g/袋,1 g顆粒相當于生藥3.61 g。實驗前用蒸餾水配制,超聲30 min后4 ℃保存。阿卡波糖片(德國拜耳醫藥保健有限公司,批號:BJ51061)。

1.1.3 試劑與儀器 IL-6酶聯免疫試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司,批號:L150715400)。Formamide去離子甲酰胺(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司,批號:37B00160)、核酸染料(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司,批號:54D00150)、2×Taq PCR GreenMix(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司,批號:55H001200)。蛋白質分子量Marker(Bio-rad,美國,批號:310007919),聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(Millipore,德國,批號:K1EA1531FK)、磷酸化蛋白酶抑制劑(Roche公司,瑞典,批號:19987800),TLR4兔來源的多克隆抗體(Abcam公司,美國,批號:GR3218684-1),IKK兔來源的單克隆抗體(Abcam公司,美國,批號:GR3218250-2),GAPDH小鼠來源的單克隆抗體(Abcam公司,美國,批號:GR232949-14)。

紫外分光光度計(Eppendorf公司,德國,型號:Biophotometer),微量加樣器(Eppendorf公司,德國,型號:Eppendorf Research plus),生物分析儀(Agilent Technologies,Palo Alto,美國,型號:Agilent 2100),熒光定量儀(Invitrogen,Carlsbad,加拿大,型號:Qubit 2.0 Fluorometer),高通量測序儀(Illumina公司,美國,型號:HiSeq 2500型),高通量測序儀(Illumina公司,美國,型號:Illumina MiSeq),超凈工作臺(東聯哈爾儀器制造有限公司,型號:DL-CJ-2NDI型),電子天平(Sartouris公司,德國,型號:BS224S型),垂直電泳槽(Bio-Rad公司,美國,型號:MP3型)、高速低溫離心機(Bio-Rad公司,美國,型號:3K15型),半干轉電轉印儀(Bio-Rad公司,美國,型號:TransBlot SD型),穩壓穩流電泳儀(Bio-Rad公司,美國,型號:Powerpac HQ型),梯度PCR儀(Bio-Rad公司,美國,型號:T100型)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠適應性喂養2周,以雄性C57B/6J小鼠設為正常組,喂養普通飼料;高脂飼料喂養雄性KKAy小鼠2周,以隨機平均血糖≥13.9 mmol/L,設為成模小鼠,共65只。設C57B/6J小鼠13只為正常組,KKAy小鼠按體質量及血糖隨機分為5組,包括阿卡波糖組、糖耐康高劑量組、糖耐康中劑量組、糖耐康低劑量組、模型組,每組13只。

1.2.2 給藥方法 給藥劑量:阿卡波糖組按3.9 mg/kg,糖耐康高劑量組、糖耐康中劑量組、糖耐康低劑量組分別按4.68、2.34、1.17 g/kg,模型組按生理鹽水20 mL/kg。給藥組均按0.01 mL/g的體質量標準灌胃給藥1次,正常組和模型組給予等同劑量的生理鹽水灌胃1次,連續8周。過程中,中劑量組及模型組各死亡3只。喂養過程中,每周監測小鼠血糖和體質量,小鼠均自由取食、飲水。8周后,末次給藥后禁食不禁水12 h,于眶靜脈取血,分離血清備用。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 血糖及體質量檢測 給藥期間,于第0、4、8周,禁食6 h后,血糖檢測以血糖儀尾靜脈取血進行;每周同一時間測量體質量并記錄。

1.2.3.2 半定量酶聯免疫吸附試驗法及蛋白質免疫印跡法檢測 半定量酶聯免疫吸附試驗法檢測血漿中白細胞介素6(Interleukin,IL-6)及葡萄糖轉運蛋白4(Glucose Transporter4,GluT4)的水平。各項操作均嚴格按照說明書操作。

2018年6月11日稗草1-3葉期，將4%氟嘧啶草醚+2.5%五氟磺草胺可分散油懸浮劑100毫升/畝。甩施，施藥后保持水層3-5厘米7天以上，田間管理同一般生產田。

蛋白質免疫印跡法檢測肝組織、肌肉組織中Toll樣受體4(Toll-likeReceptor4,TLR4)及核因子κB激酶β抑制物(Inhibitor of NF-kappaB Kinase Beta,IKKβ)水平。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳:上樣量約40 μg,90 V 45 min濃縮,150 V 80 min電泳分離。轉膜:按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿依次順序裝好轉膜裝置120 V、150 mA轉膜60 min。封閉:15 mL Blocking buffer TTBS 37 ℃輕搖1 h。加TLR4一抗(1∶1 000)、IKKβ一抗(1∶1 000),GAPDH為內參(1∶5 000)。4 ℃孵育過夜,洗膜,加二抗,TLR4二抗(1∶2 000)、IKKβ二抗(1∶2 000),GAPDH為內參(1∶3 000)。增強化學發光,Storm掃描,對掃描圖像測特異蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內參照,每個樣品重復測量3次。

2 結果

2.1 糖耐康對KKAy小鼠空腹血糖和體質量的影響 與治療前比較,各給藥組血糖有明顯下降;與模型組比較,糖耐康高劑量組、阿卡波糖組差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01);除正常組外,各組體質量均有不同程度上升,與模型組比較,各給藥組差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組KKAy小鼠空腹血糖和體質量比較

2.2 糖耐康對KKAy小鼠IL-6、TLR4、IKKβ水平的影響 與模型組IL-6比較,阿卡波糖組和糖耐康高劑量組差異有統計學意義(P<0.01)。與正常組比較,模型組GluT4水平明顯下降(P<0.05);與模型組比較,糖耐康高劑量組與阿卡波糖組均能夠明顯上調GluT4水平(P<0.01)。見表2。

表2 各組KKAy小鼠IL-6、GluT4水平比較

2.3 糖耐康對KKAy小鼠TLR4、IKKβ水平的影響 與正常組比較,模型組TLR4、IKKβ水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,糖耐康高劑量組與阿卡波糖組能夠顯著下調TLR4、IKKβ水平(P<0.01)。見表3,圖1～2。

圖1 糖耐康對肝組織TLR4蛋白表達的影響

圖2 糖耐康對肌肉組織IKKβ蛋白表達的影響

表3 各組KKAy小鼠TLR4、IKKβ水平比較

3 討論

因肥胖導致腸道微生物群失調,致細菌及其產物如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)泄漏到脂肪組織,能夠激活脂肪細胞中的TLR,其中,TLR4作為細胞膜表面受體,能夠誘發機體產生各種細胞因子,尤其是炎癥介質和相關酶類等[8-10]。已知經典的TLR4通路主要參與LPS的識別和轉導[11-12],LPS在機體內通過活化TLR4,降解IKB,來解除對核因子κB的抑制,而后進入核內促進炎癥介質包括TNF-α、IL-6等的轉錄,進一步促進核因子κB的活化,形成局部炎癥擴大的級聯效應[13]。各種細胞因子和促炎趨化因子,一旦被激活,就會加劇炎癥介質的產生,從而激活應激激酶,有效地阻止胰島素受體的信號轉導通路并引起胰島素抵抗[14-15]。因此,調節炎癥介質,可恢復胰島素的敏感性和改善異常血糖[16]。鑒于各種脂肪因子、細胞因子和趨化因子對疾病進展的影響,可將2型糖尿病視為一種自身炎癥性疾病,盡管它是由代謝失調引起的[17]。另外,GluT4是葡萄糖轉運體家族的成員之一,能夠轉移并定位在細胞膜上,促進葡萄糖的吸收,故在骨骼肌的葡萄糖轉運和代謝過程中發揮了重要作用[18]。胰島素抵抗時,因GluT4的轉位受阻,可影響糖脂代謝[19-20]。具體表現可見GluT4的易位受阻、表達減少,及含GluT4的囊泡不能與細胞膜融合,或者已融合但其活性降低等[21],這些都是胰島素抵抗的中心環節[22]。因此,上調GluT4的活性及轉位也是增強胰島素敏感性和改善骨骼肌代謝的有效途徑之一。

綜上所述,中藥糖耐康能夠明確改善2型糖尿病小鼠的血糖水平。在體質量方面,KKAy小鼠組體質量均有不同程度上升,考慮與其高脂飼料喂養有關。而與模型組比較,各給藥組具有明顯抑制體質量增長的趨勢。對于IL-6水平,與模型組比較,阿卡波糖組與糖耐康高劑量組均具有明確的下調作用,其余給藥組有一定的下調趨勢。對于GluT4水平,與模型組比較,阿卡波糖組與糖耐康高劑量組具有明確的上調作用。對于TLR4及IKKβ水平,與模型組比較,各給藥組均有下調趨勢,其中糖耐康高劑量組及阿卡波糖組最為顯著。

糖耐康是由夏枯草、番石榴葉、三白草、女貞子及人參5味藥組成。方中君藥夏枯草,清肝火散郁結。主要針對消渴病熱盛內郁的病機。番石榴葉、三白草為臣藥,番石榴葉能夠甘平養胃,生津止渴,斂澀固陰。早在1975年廣西醫學院糖尿病課題組就發現其有確切降糖作用,藥理研究已證實它能夠改善糖尿病胰島素抵抗。三白草清熱解毒、利水消腫。方中君、臣藥主要針對消渴病燥熱內盛的病理基礎。佐藥人參、女貞子益氣養陰、生津止渴,針對氣陰虧虛的病理基礎。全方共湊清熱生津、益氣養陰之效。是在辨證論治與專藥專方相結合的基礎上,正對糖尿病及前期——胰島素抵抗的主要病機特征。

KKAy小鼠是自發性2型糖尿病動物模型,因其具有與人類糖尿病類似的遺傳特征及發病過程,個體差異性較小[23],成模穩定,已在實踐過程中得到較好的論證,是研究該疾病理想的動物模型。

本研究結果證實,中藥糖耐康不僅能夠降低2型糖尿病小鼠的體質量趨勢及血糖水平,而且能夠下調炎癥介質IL-6及上調胰島素受體后通路中GluT4的水平,下調肝臟、肌肉組織中TLR4及IKKβ蛋白表達。說明其可能通過調節LPS介導的TLR4通路中關鍵炎癥介質的水平,減輕炎癥反應,在一定程度上抑制炎癥級聯效應,從而減輕胰島素抵抗狀態。當然,腸道菌群結構的改變也參與其中。該結論為進一步加強中醫藥防治糖尿作用機制的研究提供理論依據。

利益沖突聲明:無。