心通口服液治療急性心肌梗死的代謝組學研究

陶舒悅,梁萬徽,汪 杰,張云靜,3,方 玲,彭 燦,3,5,6

(1.安徽中醫藥大學藥學院,安徽 合肥 230012;2.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;3.中藥復方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;4.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科,安徽 合肥 230012;5.安徽省中醫藥研究院中藥資源保護與開發研究所,安徽 合肥 230012;6.省部共建安徽道地中藥材品質提升協同創新中心,安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠狀動脈粥樣硬化導致血管堵塞,從而引起的以心肌細胞缺血低氧為主要特征的一類心血管疾病[1-2]。研究[3]表明,AMI是全球死亡、殘疾和痛苦的一大原因,給人類帶來極大的健康危害和社會經濟負擔。現代醫學主要采用藥物干預和手術治療的方法,使阻塞的冠狀動脈血管恢復供血[4],但這也對患者造成再灌注損傷和微循環障礙等新的問題[5-6]。因此,在當前全球心血管類疾病危害依舊居高不下的情況下,人們迫切需要發現新的治療方法。

中醫藥作為中華民族的瑰寶,對治療AMI具有作用多靶點和整體性治療的優勢,更符合心血管疾病長期用藥的特點。中醫認為AMI屬于“胸痹”“心痛”的范疇,主要治則為活血化瘀、理氣止痛[7]。心通口服液是一種傳統中藥復方制劑,由黃芪、黨參、麥冬、何首烏、丹參、當歸、葛根等多種中藥組成。臨床應用發現,心通口服液具有活血化瘀、化痰通絡的作用,能夠明顯改善患者心功能,起到保護心臟的作用[8]。然而,由于心通口服液化學成分多且復雜,目前對于其治療AMI的作用機制并不明確。

代謝組學作為一個從具象到整體的研究手段,能夠敏銳聚焦到小分子化合物的代謝產物變化,從而分析機體的整個調節機制,這與中醫的整體觀、系統觀不謀而合,目前在中醫藥領域中的應用也很成熟[9-10]。因此,本研究利用代謝組學手段,篩選得到心通口服液治療AMI的差異代謝物,預測發揮治療作用的關鍵成分以及可能的代謝通路,探索其治療機制,為后續研究提供思路。

1 材料

1.1 藥品與試劑 乙腈(質譜純,批號 F0RQRRQS)、甲醇(質譜純,批號 T3R8RRXS):安耐吉化學;心通口服液(批號 317210032):魯南厚普制藥有限公司;0.5%～1%伊紅乙醇溶液(批號 0496202201)、蘇木精染液(批號 0648202110):凱基生物;羧甲基纖維素鈉(批號 20210601):天津市大茂化學試劑。

1.2 實驗儀器與軟件 Vanquish UPLC超高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 120四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀、Compound Discoverer 3.1化合物分析鑒定軟件、H3-18KR高速冷凍離心機:美國Thermo Fisher Scientific Corporation;East Laboratory Epic C18(1.8 μm,120 A,100 mm×2.1 mm)色譜柱:北京東方朗銳科技有限公司;MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca);AB135-S型十萬分之一電子天平:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;Cascada超純水儀:美國PALL公司;Vortex4渦旋儀:德國IKA;MPA200生物信號分析系統:成都泰盟軟件有限公司。

1.3 實驗動物 SPF級雄性Wistar健康大鼠40只,體質量200～220 g,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(魯)2019-0003,動物自由飲食,適應性飼養1周,并保證飼養環境12 h明暗循環,在確保動物狀態良好時進行分組給藥實驗。動物實驗方案由安徽中醫藥大學倫理委員會審定,符合國家實驗動物福利倫理的相關規定,審批號為AHUCM-rats-2021105。

2 方法

2.1 AMI大鼠模型的復制 采用冠狀動脈結扎法復制AMI大鼠模型。正常大鼠適應性飼養7 d后,使用20%的烏拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠仰臥固定于手術板上,剃除大鼠胸口的毛后使用碘伏和75%乙醇進行無菌操作,然后剪開大鼠胸口皮膚,于左側第4、5肋間的切口撕開心包,使心臟暴露,用手輕壓大鼠胸廓擠出心臟。用6-0號帶線縫合針(心臟用)立即結扎冠狀動脈左前降支。結扎完成后迅速將心臟送回胸腔,同時把胸腔中存在的血液和氣體擠出,可避免血液在胸腔中凝固,影響肺功能,以保證胸腔的負壓狀態。最后迅速關閉胸腔,使用4-0號非吸收性縫合線縫合大鼠皮膚。縫合后使用碘伏對傷口再次進行無菌操作。實行假手術的大鼠只開胸不結扎[11]。模型復制后6 h,采用MPA200生物信號分析系統對每只大鼠進行心電圖測定,觀察心電圖ST段是否抬高,以評價模型復制是否成功。

2.2 分組、給藥和樣品采集 從40只實驗大鼠中選取8只進行假手術操作,剩下的32只進行AMI模型復制,隨后將模型復制成功的16只大鼠分為模型組(n=8)和治療組(n=8),將經過假手術操作的大鼠作為假手術對照組(n=8)。心通口服液的臨床劑量為60 mL,以成年人60 kg體質量為參照,按照體表面積法計算得到大鼠給藥劑量為6.3 mL/kg。假手術對照組、模型組大鼠連續14 d給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,治療組連續14 d給予6.3 mL/kg心通口服液原液。20%烏拉坦腹腔注射麻醉后,用不含肝素鈉的一次性真空采血管腹主動脈取血,靜置1 h后,3 000 r/min 離心15 min,取上清液于-80 ℃儲存備用;取血后立即留取心臟樣品,放入4%多聚甲醛溶液固定。

2.3 樣品前處理 精密吸取血清樣品120 μL,加入300 μL乙腈,渦旋混勻5 min,12 000 r/min、4 ℃高速離心10 min,取上清液,37 ℃ 氮氣流下吹干,加入140 μL復溶液V(水)∶V(甲醇)=1∶3,渦旋混勻10 min,用注射器吸取處理好的溶液經0.22 μm有機濾膜過濾,濾液裝入進樣小瓶中,用于色譜質譜分析。將所有樣品各取10 μL混合作為質控(quality control,QC)樣品。

2.4 病理組織評價 取部分4%多聚甲醛溶液固定和石蠟包埋后的心臟左心室心肌進行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,將染色后的切片置于顯微鏡下觀察,拍照。

2.5 樣品測定

2.5.1 色譜條件 所有樣品均使用同一根色譜柱。柱溫保持在40 ℃,樣品室溫度保持在6 ℃。流動相由A相[純水(含0.1%甲酸,0.1%甲酸銨)]、B相(甲醇)組成。梯度洗脫程序:0～1.0 min,98% A;1.0～10.0 min,98%→5% A;10.0～16.0 min,5% A;16.0～16.1 min,5%→98% A;16.1～20 min,98% A。流速為0.2 mL/min,進樣容積為2 μL。

2.5.2 質譜條件 離子源:ESI源;噴霧電壓:3 800/3 200 V(+/-);離子化模式:ESI+、ESI-;鞘氣:40 arb;輔助氣:10 arb;毛細管溫度:360 ℃;掃面范圍:100～1 500m/z;分辨率:17 500 FWHW。所使用的各種氣路均為氮氣。

2.6 數據分析 將原始圖譜數據導入Compound Discoverer 3.1軟件,對代謝物進行初步鑒定,將結果導出為CSV格式,利用在線網站MetaboAnalyst 5.0構建主成分分析(principal component analysis,PCA),通過SIMCA 14.0構建正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)以及999次置換檢驗模型,鑒別并篩選出潛在的差異代謝物。將差異代謝物導入在線網站 MetaboAnalyst 5.0可以得到相關代謝通路。

3 結果

3.1 病理學評價 各組大鼠心臟組織病理切片如圖1所示,假手術對照組心肌細胞排列整齊緊密,并無病理性損傷。相較于假手術對照組,模型組心臟受損嚴重,出現不同程度的間質水腫、心肌纖維破壞、細胞核固縮等損傷,治療組能夠明顯看到梗死面積減少,心肌細胞受損較模型組有所逆轉。

圖1 各組大鼠心肌組織切片(HE染色,10×20倍)

3.2 PCA PCA圖可以很好地反映組間的分離趨勢。圖2為樣品正負離子PCA圖,由圖可以得出假手術對照組與模型組有明顯分離趨勢,說明構建AMI模型成功;模型組與治療組之間區分明顯,說明在心通口服液的作用下AMI大鼠的代謝輪廓發生了異常。圖中QC樣本聚集程度較高,說明檢測過程中儀器穩定,采集的數據質量較好。

注:A.假手術對照組;B.模型組;C.治療組;D.QC

注:A.假手術對照組;B.模型組;C.治療組

3.4 差異代謝物篩選 通過構建假手術對照組與模型組,以及模型組與治療組之間的OPLS-DA模型,設置變量投影重要性>1,結合獨立樣本t檢驗結果,對P<0.05的樣本認為差異有統計學意義,搜索相關數據庫及文獻,確定兩組模型的差異代謝物,最終取兩組差異代謝物的交集作為心通口服液治療AMI的差異代謝物,共有16個。其中模型組與假手術對照組相比,具有上調作用的代謝物有11個,具有下調作用的代謝物有5個;治療組與模型組相比,具有上調作用的代謝物有4個,具有下調作用的代謝物有12個。見表1。

表1 差異代謝物鑒定結果

3.5 代謝通路分析 差異代謝物參與的代謝通路包括不飽和脂肪酸的生物合成,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甘油磷脂代謝,亞油酸代謝,α-亞麻酸代謝,類固醇激素生物合成,花生四烯酸代謝,脂肪酸伸長,脂肪酸降解,嘧啶代謝,脂肪酸生物合成,見表2。以代謝通路富集分析數據為基礎作代謝通路圖(見圖4),其中橫坐標為影響值,縱坐標為-lg(P),氣泡大小代表該通路的富集程度,由圖4可知,差異代謝物對甘油磷脂代謝和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路影響較大,且這些通路富集程度較高。

表2 代謝通路鑒定結果

圖4 代謝通路富集氣泡圖

4 討論

本研究采用超高效液相色譜—四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜代謝組學的方法,探討心通口服液治療AMI的治療機制。研究結果確定了心通口服液治療AMI的生物標志物,包括硬脂酸、棕櫚酸、膽堿、磷脂酰膽堿等16個代謝物,主要涉及不飽和脂肪酸的生物合成,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甘油磷脂代謝,亞油酸代謝等代謝通路,下面將對一些關鍵代謝物及代謝通路進行討論。

4.1 脂質代謝 脂肪酸作為心肌組織的主要能量提供單位,其主要的代謝途徑為β-氧化,主要在線粒體中進行,在低氧的情況下,脂肪酸的β-氧化減少,從而導致脂肪酸的積累[11-12]。與模型組比較,治療組血清硬脂酸、棕櫚酸等脂肪酸下調,因此可認為心通口服液通過增加脂肪酸的β-氧化從而減輕心肌缺血低氧[13-15]。硬脂酸、棕櫚酸為飽和脂肪酸,在體內分布較廣,在供能的同時也參與不飽和脂肪酸的生成,如亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、磷脂[16]。

亞油酸和α-亞麻酸為體內必需脂肪酸[17],亞油酸具有軟化血管的作用,AMI大鼠由于體內血瘀、動脈粥樣硬化等情況,機體會增加亞油酸的生成,從而起到疏通血管、抗血栓的作用[18]。亞油酸在體內可以轉化為α-亞麻酸,進而通過脂肪酸延長生成花生四烯酸[19],花生四烯酸代謝可以生成白三烯B4和前列腺素E2,具有抗炎的作用,對血管彈性、血小板活化等具有一定的調節作用[20-21]。本研究結果顯示,治療組亞油酸、α-亞麻酸相對于模型組都有一定的回調,說明心通口服液可以通過調節亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝以及花生四烯酸代謝達到治療AMI的作用。

二十碳五烯酸是α-亞麻酸的代謝產物,可以調節體內膽固醇及三酰甘油含量,二者通過降血脂、降低血管內血液黏度達到抗血栓,預防動脈粥樣硬化的作用[22]。磷脂酰膽堿是甘油磷脂的一種,主要參與細胞膜的組成,是心血管疾病的危險因素之一,可以在體內分解產生溶血磷脂酰膽堿,可參與調節體內神經傳遞、炎癥反應等生物過程[23]。

4.2 氨基酸代謝 研究結果表明:心通口服液通過調控膽堿和甜菜堿參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甜菜堿可由膽堿氧化生成,具有抗氧化和抗炎作用[24];膽堿可通過氧化和脫甲基生成甘氨酸,與炎癥反應有關[25]。體內甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸為生糖氨基酸,可通過乙酰輔酶A進入三羧酸循環,代謝可產生一碳單位,如膽堿。絲氨酸和蘇氨酸可以和甘氨酸相互轉化,蘇氨酸具有保護細胞膜、促進脂肪酸氧化的作用[26]。甘氨酸是抗氧化物谷胱甘肽的組成之一,同時抑制炎癥因子白細胞介素-6的生成[27]。而絲氨酸與免疫應答反應有關[28]。因此,心通口服液可通過參與調控炎癥反應和抗氧化作用經甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路對心臟起到保護作用。

綜上,本實驗利用代謝組學的研究方法,探究了心通口服液治療AMI的相關特征代謝物以及代謝通路。結果表明,心通口服液對脂肪酸代謝,花生四烯酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等代謝通路具有明顯的調節作用,表明其治療的關鍵在于脂質代謝和氨基酸代謝,為后續藥理機制的深入研究提供了一定方向。