歐蒙免疫印跡法（ANA 譜3）模條本底顏色變深對結果影響2 例分析

章曉霞，李發爵，李湘成，陳民，蘇悅，付紅，彭麗平，梁小燕

（1.景德鎮市第三人民醫院檢驗科，江西 景德鎮 333000；2.南昌美康盛德醫學檢驗實驗室有限公司，江西 南昌 330000；3.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院檢驗科，浙江 杭州 310000）

歐蒙印跡法中所包被的抗原均為生化特性明確的純化抗原，因此具有良好的檢測敏感性[1]。 操作過程中，模條本底顏色變深、掃描不報警的現象時有發生；但本底顏色很深及掃描報警，顯示“不可用的”情況也偶有發生，表明實驗失敗，復查也如此，報告發不出。 2020 年12 月18 日和2021 年1 月1 日2 名住院患者ANA 譜3 模條 （15 項）顏色很深及掃描報警，顯示“不可用的”；經進一步分析為球蛋白增多，增加了模條的吸附所至。 血清經適當稀釋，減少球蛋白的含量，從而減少吸附達到可以掃描，不報警，實驗成功的目的；再加做間接免疫熒光 （IIF：HEp-2 細胞），ANA 譜3 報告就可以安心發出。 現報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2 病例均來自撫州市第一人民醫院住院病人，其中病例1，游某，男，51 歲，臨床診斷：肺部感染、乙型肝炎后肝硬化失代償期、低蛋白血癥、胸腔積液、脾大。 病例2，羅某，女，47 歲，臨床診斷：腎病綜合癥、狼瘡性腎炎、甲減、高血壓病等。

1.2 檢測方法 ANA 譜3 采用歐蒙免疫印跡法，在全自動EUROBlotMadter Ⅱ儀、 佳能CanoScan LiDE120 掃描儀及配套試劑上進行；IIF 采用歐蒙試劑及EUROStar ⅢPlus 熒光顯微鏡上進行。 結果見表1、圖1~圖8。

表1 2 病例實驗室檢查結果

圖1 第2 條模條為病例1 ANA 譜3 模條圖形，本底顏色很深，未見質控帶

2 討論

病例1，ANA 譜3 模條本底顏色很深，未見質控帶，掃描報警，提示“不可用的”，見圖1、圖2；說明實驗失敗，復查也如此，經與歐蒙工程師溝通，告知給病人退費。 筆者通過1:3 稀釋血清，模條顯示較清晰質控帶，經掃描后質控帶顯示1 個“+”，未出現報警（正常質控帶顯示黑色+～+++為合格），結果為ANA 譜3 所有項目陰性，見圖3、圖4。 再經IIF 的驗證：S＜1:100（參考值：＜1:100）、核型：陰性，見表1。最終報告該病人ANA 譜3 所有項目為陰性。

圖2 病例1 模條經掃描后（黃色區域）圖形，提示“不可用的”

圖3 黃線上模條為病例1 血清經1:3 稀釋后的ANA 譜3 模條圖形，見較清晰質控帶

圖4 病例1 血清經1:3 稀釋后的ANA 譜3 模條的掃描圖形（黃線上），未見報警，質控帶顯示1 個“+”。結果為全陰性

病例2，ANA 譜3 模條本底顏色較深，見模糊質控帶，掃描報警，提示“不可用的”，見圖5、圖6，說明實驗失敗。 通過1:2 稀釋血清，模條顯示較清晰質控帶，經掃描后質控帶顯示“++”，未出現報警，結果為抗SSA、Ro-52、ds-DNA、ANuA、Histone抗體分別為1 個“+”，見圖7、圖8。 因血清1:2 稀釋，所以該病人ANA 譜3 上述5 項抗體分別報告2 個“+”是較準確的。 IIF 結果S=1: 640、核型為均質；其它（ds-DNA（ELISA）633.34 IU/mL、熒光強陽性，也可說明這一點，見表1。

圖5 第2 條模條為病例2 ANA 譜3 模條圖形，本底顏色較深，見模糊質控帶

圖6 為病例2 模條經掃描后（黃色區域）圖形，提示“不可用的”

圖7 第2 條為病例2 血清經1:2 稀釋后的ANA 譜3 模條圖形，見較清晰質控帶

圖8 第2 條為病例2 血清經1:2 稀釋后的ANA 譜3 模條的掃描圖形，未見報警，質控帶顯示“++”。結果為抗SSA、Ro-52、ds-DNA、ANuA、Histone 抗體分別為1 個“+”

對于某些患者的特殊情況（例如臨床用藥、肝功能異常等）導致血清樣本中非特異蛋白質、膽紅素或血脂等含量增加， 上述物質可能會被吸附到膜片上，最終導致非特異性背景顏色的增強[1]。 病例1 乙型肝炎后肝硬化失代償，腎功能輕度異常，肝纖4 項升高，除輕度黃疸（TBil21.7 umol/L）外、血脂偏低，球蛋白升高明顯（64.3 g/L）；病例2 腎病綜合癥、狼瘡性腎炎，膽紅素、血脂正常，IgG 達到2 580 mg/dL（參考值：751~1 560 mg/dL），TP63.6g/L、ALB26 g/L、GLB37.6 g/L，也就是球蛋白升高。 所以筆者認為模條顏色變深可能主要與病人球蛋白升高相關，球蛋白越高模條顏色越深，甚至導致掃描不成功，顯示“不可用的”，實驗失敗。 通過對血清的適當稀釋，減少球蛋白的含量，從而降低模條的吸附及本底顏色，以達到可以掃描，不報警，實驗成功的目的。 掃描結果×稀釋倍數即為最終報告結果；加做IIF 報告可進一步增加可信度，因為HEp-2 細胞中包含100~150 種自身抗原，美國風濕病學會（ACR）已將間接免疫熒光檢測推薦為檢測ANA的“金標準”[2]，中國免疫學會臨床免疫分會、歐洲自身免疫標準化促進會（EASI） 將其推薦為ANA檢測的“參考方法”[3-5]。 值得注意的是，熒光顯微鏡的質量和熒光光源強度及濾光器的配置要好，否則會影響結果判斷的準確性[6]。

有些研究中，在深色背景下，只要能觀察到特異性抗原位置條帶陽性，均可視為明確陽性；若背景顏色過深而嚴重影響到結果判讀， 則樣本不適用于該檢測體系，可考慮采用其他的檢測方法（如ELISA）進行檢測。 但本研究中血清稀釋法再加上IIF 作為補充也不失為一種簡便易行的方法。 由于觀察樣本例數有限， 在今后的工作中增加觀察例數及與臨床的結合， 以對此類問題有一個比較全面的了解。