副溶血性弧菌的3種分子分型方法研究

李 雪,孫婷婷,魏彤竹,王偉杰,刁文麗

副溶血性弧菌可引發人類與海產品相關的腸胃炎,是一種嗜鹽性革蘭氏陰性細菌。近5年來,由副溶血性弧菌引起的食物中毒病例增多,甚至出現死亡病例,已引起相關部門的重視[1]。

副溶血性弧菌由藤野在1950年首次分離,菌種鑒定主要依據血清分型、生化反應、噬鹽性試驗、神奈川現象、動物實驗等。鑒定項目多,培養基消耗大,實驗操作繁瑣,檢驗耗時長,給實際工作帶來不便。

血清分型是副溶血性弧菌分型的常用方法,副溶血性弧菌一般有13個血清O群和71個K型抗原,但很多VP分離株不能用現有的抗原分型,當出現新的血清型時就可能給食源性疾病流行病學調查和溯源帶來困難,因此作為流行病學研究工具,血清分型是很受限制的[2-3]。血清分型于副溶血性弧菌亞型的區分和流行病學調查相對不敏感。這就需要更具辨別能力的分子分型方法對副溶血性弧菌進行亞型分析和溯源。細致的分子分型研究及副溶血性弧菌菌株間親緣關系的探討可為副溶血性弧菌的預防、控制、流行病學調查、協助追蹤感染源等工作提供重要理論依據[4-7]。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)具有分辨力高、重復性好的優點,已經應用在很多食源性致病菌的分子分型研究中。PFGE的原理在于凝膠中應用交錯電場,使DNA的運動方向變化,從而使大分子量DNA可以被更好的分離,研究者根據條帶來進行鑒定與溯源等工作。

REP-PCR和ERIC-PCR技術是利用細菌基因組中廣泛分布的短重復序列為引物的靶序列進行PCR擴增,通過對PCR產物電泳結果的比較,即可分析菌株間基因組存在的差異。這些重復序列在原核生物界廣泛存在,在一些細菌屬和種中是保守的。該技術對于大量或少量的菌株分型均適用,簡單易行。與其他分類技術相比,這種技術有更高的分辨力。

本研究對2020年遼寧省副溶血性弧菌進行3種分子分型方法研究,探討3種方法間的關聯性和菌株間的親緣關系,分析遼寧省副溶血性弧菌的流行趨勢及分布規律,為食源性疾病的防控提供可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 海產品采自2020年遼寧省14個市的農貿市場。糞便樣品來源于2020年遼寧省內食源性疾病監測醫院食物中毒病人。

采集海產品和糞便樣品進行VP增菌、分離和鑒定,得到食品分離株22株和臨床分離株22株,44株菌全部由省疾控中心用全自動微生物生化鑒定儀鑒定為VP。ATCC 17802(來源于遼寧省疾控中心),PFGE實驗分子量標準菌株SalmonellaBraenderupH9812來自于國家食品安全風險評估中心。

1.2 主要儀器與試劑 脈沖場凝膠電泳系統(美國伯樂CHEFMAPPER-XA)、凝膠成像系統(美國伯樂GelDocXR+)、培養箱(中國海河HHB11-22)、PCR儀(美國伯樂S1000)、全自動微生物生化鑒定儀和比濁儀(法國梅里埃VITEK2)。儀器均通過計量檢定或校準。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水-3%APW(北京陸橋批號20210326)、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂(北京陸橋批號20210428)、弧菌顯色培養基(法國科馬嘉批號20201228)、弧菌血清(SSI 批號20200113)、NotI酶(Promega 批號20200806)、金膠(Promega 批號20201209)Q、REP-PCR和ERIC-PCR引物(沈陽匯佰公司合成)。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離鑒定 按照GB 4789.7—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[8]中方法進行菌的分離鑒定。樣品經過3% APW選擇性增菌后,劃線接種于弧菌顯色平板,挑取疑似單菌落37 ℃純培養后,經過VITEK2系統進行生化鑒定。VP分離株保存于-80 ℃冰箱中備用。44株分離菌株全部由省疾控中心用全自動微生物生化鑒定儀鑒定為VP。

1.3.2 血清分型 按照《GB4789.7-2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》[8]中玻片凝集法對VP分離株進行血清分型。

1.3.3 PFGE分型及聚類分析 按照國家食品安全風險評估中心下發的《2020年食源性疾病監測工作手冊》[9]操作。細菌懸液濃度4.5麥氏單位;Not I限制性內切酶40 U/膠塊;37 ℃酶切4 h;電泳19 h;膠塊GelRed染色30 min。應用BioNumerics7.6軟件對PFGE圖譜分析校準、聚類分析(非加權配對算術平均法,UPGMA)及同源性研究。

1.3.4 REP-PCR和ERIC-PCR分型及聚類分析 按文獻[10-11]方法利用REP和ERIC設計引物并按照其反應體系進行PCR實驗,擴增出不同DNA片段圖譜,引物序列見表1。應用SPSS 13.0軟件對圖譜聚類分析,用系統聚類分析法中的組內聚類法,對各菌株進行聚類分析,這種方法曾被Martin-Kearley等人描述過[10],最終使用Hunter和Gaston的方法計算出各種分型方法的區分能力即分辨力(DI)[11]。

表1 REP-PCR和ERIC-PCR引物序列

上述公式中,DI是分辨力,s是型別數,nj是j型菌株數,N是菌株總數。

2 結 果

2.1 血清分型結果 44株VP,其中有8株不能進行K分型,不可分型率為18.2%。其他菌株共分為15個血清型。食源性疾病22株分離株,主要血清群為O3,其次為O1,且分為4個血清型,O3∶K6(12)O1∶K5(6),O4∶K8(2)O3∶K29(2)。食品分離株22株,主要的血清群為O2,其次為O1和O3群。其中8株為O2群但不可進行K抗原分型,其他14株可分為11個血清型, O2∶K28(3),O2∶K3(1),O1∶K32(1),O1∶K19(1),O1∶K33(1),O4∶K42(1),O4∶K34(1),O3∶K45(2),O3∶K6(1),O5∶K17(1),O10∶K24(1)。44株VP血清型結果具體見表2。

表2 44株VP血清分型結果

2.2 PFGE聚類分析結果 PFGE的分辨力(DI)達到0.986。按相似度>85%,44株VP分離株可分成3組優勢帶型,主要分子型為A-C組。A組共16株全部來源于臨床分離株:202009(大連)、202010(大連)、202007(大連)、202011(大連)、202012(大連)、202015(沈陽)、202016(沈陽)、202017(沈陽)、202020(大連)、202001(沈陽)、202022(大連)、202014(盤錦)、202019(大連)、202013(大連)、202003(沈陽)。B組共4株全部來源于臨床分離株:202006(沈陽)、202008(大連)、202021(大連)、202002(沈陽)。C組共2株全部來源于鞍山市食品分離株:202036、202039。臨床分離株血清分型和PFGE分型結果一致。臨床分離株間相似度>85%,相似度高。食品分離株除個別株與臨床分離株相似度>95%,相似度高,其他食品分離株與臨床分離株間相似度均<85%,相似度低,食品分離株血清分型和PFGE分型結果一致。食品分離株間相似度<85%,相似度低。一些可生食的即食食品分離株與臨床分離株間相似度>95%,相似度高。主要分子型與血清占比分析情況見表3。表3可以看出,A組、B組和C組每組里均由血清群O3和O1菌株組成,O3和O1菌株相似度>85%,相似度高。

表3 VP主要分子型與血清群占比分析

2.4 REP-PCR和ERIC-PCR聚類分析結果 REP-PCR的分辨力(DI)達到0.947,ERIC-PCR的分辨力(DI)為0.935。REP-PCR按∑2 <5可以把44株菌分成4組優勢帶型A-D組,ERIC-PCR按∑2 <5可以把44株菌分成4組優勢帶型A-D組。PFGE聚類分析中分型的A-C組菌株,每組菌株均在REP-PCR和ERIC-PCR聚類分析中按∑2 <5而被分成相同的組,REP-PCR、ERIC-PCR分型結果和PFGE分型結果一致,但PFGE可以把REP-PCR和ERIC-PCR分型結果相同的菌株進一步分成不同亞型,例如菌株(9、10、7、11、12、15、16、17、20、1、22、14、19、13、3)(6、8、2、21),(34、35),(36、39)。

3 討 論

血清分型結果顯示,血清鑒定過程中,部分菌株不能分型,且部分菌株還需高壓處理后再次做凝集實驗,提示VP抗原不穩定易變異,現階段不能做到所有菌株都被分型,且VP血清型鑒定繁瑣復雜。22株食品分離株中8株不能分型,提示食品分離株較臨床分離株血清型更難區分[12-14]。臨床分離株血清分型較少,食品分離株血清分型較多。

遼寧省2020年VP分離株的流行血清型與遼寧省近5年VP分離株的流行血清型一致,臨床VP分離株流行血清型仍為O3∶K6,食品VP分離株流行血清群仍為O2[4,15-17]。

聚類分析結果顯示,臨床分離株親緣關系近,關聯性強,提示臨床分離株可能起源于相同的致病菌。食品分離株親緣關系遠,關聯性弱,提示食品分離株可能起源于不同菌株。個別食品分離株與臨床分離株親緣關系近,關聯性強,提示個別食品分離株可能起源于相同致病菌。絕大多數食品分離株與臨床分離株親緣關系遠,關聯性弱,提示絕大多數食品分離株可能不致病。一些可生食的即食食品分離株與臨床分離株親緣關系較近,關聯性強,提示可生食的即食海產品比烹飪后的海產品可能更易致病。

食品分離株沈陽市202005與大連市202018與臨床分離株在3種分型方法中相似度均較高,提示該食品分離株具有引起食源性疾病的風險,應給予關注。食品分離株202018來源是即食食品三文魚,且圖1顯示,即食食品血清型主要為O2和O1,由于即食食品的直接入口的特殊性,這株菌及血清型O2和O1均應重點關注。文獻顯示,80年代,我國臨床VP分離株血清型主要以O1、O4群為主[18-21]。近5年來,遼寧省和國外一些國家及國內其他一些省份流行血清型以O3、O1群為主[22],提示VP分離株流行血清型由O4群逐漸轉變為O3群。表3可以看出,O3和O1菌株相似度>85%,相似度高,親緣關系近,O3群和O1群菌株密切相關,因此推斷血清型O3群菌株很可能來源于O1群菌株。

神奈川現象是副溶血弧菌在我萋氏培養基上的溶血現象[3],此陽性反應是由耐熱直接溶血毒素(TDH)所造成的,日本學者認為神奈川現象和腸道致病性密切相關[3]。本研究發現,22株臨床分離株REP-PCR指紋圖譜都有600 bp這條帶,而ERIC-PCR指紋圖譜中都有1 000 bp這條帶,值得注意的是,這22株全部都是致病菌,通過鑒定它們都產生神奈川現象。600 bp、1 000 bp兩條共有擴增帶與毒力基因及其致病性的相關性有待進一步探討。

評價分型方法因素[2]:1) 分型力。即種內的細菌都能通過某種方法的使用得到分型的能力。2) 鑒別力(DI)。對兩個不相關菌株被區分為不同型的可能性進行定量。3) 可重復性。是指使用某一種方法對某一特定菌株重復測試時能產生相同結果的能力。4) 結果是否易于解釋。電泳帶型是否易于解釋成為評定一種分型方法實用性的一個因素。5) 同時還應考慮該技術是否經濟、操作是否簡便以及是否能快速地獲得結果等。

PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR方法對遼寧省VP分離株分型均是可行的,這3種分子分型方法滿足上述5種評價標準。PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR 3種方法擴增均基本穩定,每次試驗均能重復產生一定復雜程度的比較清晰且有不同程度多態性DNA主條帶。PFGE分型方法的分辨力更優于REP-PCR和ERIC-PCR分型方法,REP-PCR分辨力要優于ERIC-PCR。REP和ERIC重復基因序列在2020年遼寧省副溶血性弧菌分離株中普遍存在,此外,REP-PCR和ERIC-PCR方法操作簡便和快捷,所需的費用低時間短,但分型的分辨力卻很高,再現性好,因此利用REP-PCR和ERIC-PCR方法對副溶血性弧菌菌株分型具有可行性。大量的研究表明,雖然有時REP-PCR和ERIC-PCR分辨力和再現性比PFGE方法稍低,但與PFGE獲得的結果確有很好的關聯度。與PFGE方法相比,REP-PCR、ERIC-PCR分型操作簡單快捷,所需的費用非常低、不需要昂貴的專業儀器設備和分析軟件,實驗周期短,現階段遼寧省市、區(縣)級疾控實驗室普遍缺乏實驗經費和PFGE專業設備、軟件的情況下,可應用REP-PCR和ERIC-PCR方法對YE進行食源性疾病及食物中毒暴發流行的溯源研究。

綜上,3種方法分型結果一致,對于評估遼寧省副溶血性弧菌流行趨勢及分布規律是可行的,在副溶血性弧菌所引起食源性疾病暴發流行時,有條件的實驗室可以應用這3種方法對致病菌進行快速有效溯源。

利益沖突：無