dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1介導的RNAi對煙草靶斑病的抑制作用

王 妍，郭 依，汪漢成，蔡劉體，安夢楠，張 崇，吳元華*

1.沈陽農業大學植物保護學院，沈陽市沈河區東陵路120號 110866

2.貴州省煙草科學研究院，貴陽市觀山湖區龍灘壩路29號 550081

煙草靶斑?。╰obacco target spot）是由立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniKühn）引起的一種真菌病害，染病煙株葉片有病斑，病斑淺褐色且形狀不規則，病斑壞死部分易脫落形成穿孔［1］。煙草靶斑病常發生在煙草旺長期至成熟期，潛育期短，流行性強，危害嚴重［1-2］。自2006年在我國遼寧丹東首次報道煙草靶斑病后，廣西、云南、貴州、四川、湖北、湖南、黑龍江和吉林等地區也陸續發生該病危害［3-9］。目前化學藥劑仍是防治煙草靶斑病的主要手段，但長期使用化學藥劑容易使病原菌產生抗藥性，造成農藥殘留和環境污染等問題［10］，故迫切需要一種環境友好的防治新方法。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物共有的一種由RNA介導的保守調節機制，由基因特異性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）觸發，隨后dsRNA被RNase Ⅲ樣核酸內切酶切割成21～24 nt 的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）。這些siRNA 以同源配對的形式靶向目標基因，達到在轉錄或轉錄后水平沉默或抑制目標基因表達的目的［11-13］。近年來，RNAi 技術在植物病蟲害防治方面得到廣泛應用［14］，噴霧誘導基因沉默（spray-induced gene silencing，SIGS）是實現RNAi的一種方法，該方法通過外源噴施dsRNA，誘導與病原菌生長發育和致病相關基因的沉默，從而降低病原菌的致病力［15］。Koch 等［16］通過在大麥葉片表面噴施靶向禾谷鐮孢菌麥角甾醇生物合成基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C） 的 長 dsRNA（CYP3-dsRNA），顯著降低該真菌CYP51A、CYP51B和CYP51C的表達量，減輕了對大麥的危害。Rao 等［17］研究發現，多聚半乳糖醛酸酶（Polygalaturonase，PG）的關鍵候選基因AG1IA_04727在水稻紋枯病感染期間顯著上調，靶向AG1IA_04727的dsRNA 在水稻中的穩定表達可有效沉默該基因，抑制水稻紋枯病的發生。RhizoctoniasolaniAG-3 融合群強致病力菌株YC-9 可產生內切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases，endoPGs），該酶能夠降解植物細胞壁果膠骨架結構，故endoPGs 被認為是煙草靶斑病的致病因子之一［18］。此外，促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP 激酶）是一類真核生物都具有的蛋白激酶，能夠參與基因表達及細胞的生長、發育、分裂、死亡等多種生理過程［19］。Tiwari 等［20］通過宿主傳遞的RNAi 有效沉默了RhizoctoniasolaniAG1-IA的致病性MAP激酶1同源物RPMK1-1和RPMK1-2，顯著抑制了該病原菌對水稻的侵染。然而，RNAi防治煙草靶斑病的研究還鮮見報道。因此，以RhizoctoniasolaniYC-9的endoPGs和MAP 激酶為靶點，通過體外轉錄的方式合成dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1，采用SIGS 方法對煙草離體葉片和大田煙株噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1，分析其對煙草靶斑病的防治效果，旨在為煙草靶斑病的綠色防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

普通煙草K326 幼苗培養于沈陽農業大學植物病毒研究室的溫室中，成苗后移栽至沈陽農業大學科研試驗基地。RhizoctoniasolaniYC-9 菌株由沈陽農業大學植物病毒研究室分離并培養在28 ℃恒溫培養箱（北京福意聯醫療設備有限公司）中的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上。Trans2K?DNA Marker 和Trans2K?Plus ⅡDNA Marker 購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8%（質量分數）井岡霉素可溶液劑購自沈陽紅旗林藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1endoPGs和RMK1的擴增

使用RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取RhizoctoniasolaniYC-9 總RNA。使用HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）反轉錄合成RhizoctoniasolaniYC-9 cDNA。使用引物對endoPGs_F：5'-CTCGCCCTTTTTGCTCTCCC-3'和endoPGs_R：5'- AAGCTTGGACATAACCAGCG-3'通過PCR 擴增endoPGs；使用引物對RMK1_F：5'-CGAGATCAAGCTACTCAGAC-3' 和RMK1_R：5'-GAATGTGAGCATGACCTCGG-3'通過PCR 擴增RMK1。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 次循環；72 ℃延伸10 min。通過1%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，隨后將獲得的PCR 產物分別與pMD19-T載體［寶生物工程（大連）有限公司］進行連接，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，在GenBank 中根據序列同源性進行BLAST比對。

1.2.2 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1的體外轉錄

使用5'端帶有T7啟動子的引物對T7-endoPGs_F：5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTCGCCCTTTTTGCTCTCCC-3'和endoPGs_R：5'-AAGCTTGGACATA ACCAGCG-3'，endoPGs_F：5'-CTCGCCCTTTTTGCTCTCCC-3'和T7-endoPGs_R：5'- TAATACGACTCAC TATAGG GAAGCTT GGACATAACCAGCG-3'分別擴增dsRNA-endoPGs的模板1 和模板2；使用T7-RMK1_F：5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA GATCAAGCTACTCAGAC-3'和RMK1_R：5'-GAATGTGAGCATGACCTCGG-3'，RMK1_F：5'-CGAGATCAAGCTACTCAGAC-3'和T7-RMK1_R：5'-TAATA CGACTCACTATAGGGGAATGTGAGCATGACCT CGG-3'分別擴增dsRNA-RMK1的模板1 和模板2。反應條件同1.2.1 節。使用T7 RNAi Transcription Kit 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將獲得的模板1 和模板2 合成dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1。通過2%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄產物。

1.2.3 dsRNA-endoPGs 和dsRNA-RMK1對離體葉片煙草靶斑病病斑的抑制效果測定

將溫室栽培7～8 葉期的普通煙草K326 離體葉片正面朝上平鋪在玻璃皿（30 cm×30 cm）上，葉片下方墊有用無菌水浸潤過的2層紗布，葉片莖部用無菌水浸潤過的棉花包裹進行保濕。試驗設置4個處理，分別向葉片表面噴施200 μg dsRNA-endoPGs（T1）、200 μg dsRNA-RMK1（T2）、200 μL 8%井岡霉素可溶液劑的500 倍稀釋液（T3）和200 μL 無菌水（對照，T4）。每個處理3 片煙草葉片，重復3 次。24 h 后在煙草葉片葉脈的兩側分別用無菌注射器針頭制造1個小傷口，將直徑為5 mm的RhizoctoniasolaniYC-9菌餅接種于葉片傷口處并于28 ℃的人工氣候溫室培養7 d，光處理周期為16 h光照/8 h黑暗。采用十字交叉法［21］測量病斑直徑，計算病斑抑制率，計算公式如下：

1.2.4 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的大田防治效果測定

dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1防治煙草靶斑病的大田試驗于沈陽農業大學科研試驗基地進行。試驗設置4 個處理，分別向葉片表面噴施20 μg/mL的dsRNA-endoPGs（T1）、20 μ g/mL 的dsRNA-RMK1（T2）、8%井岡霉素可溶液劑500 倍稀釋液（900 mL/hm2，T3）和無菌水（對照，T4）。每個處理5株煙株，重復3次。每個處理為1個小區，共12個小區，隨機區組排列。每7 d 施藥1 次，共施藥3 次。分別于首次施藥后7、14、21 d 對各處理煙草植株全株葉片進行調查，根據單株每個葉片病斑面積占單株每個葉片面積的百分比進行分級（葉片無病斑為0級；病斑面積占葉片面積的1%以下為1級；病斑面積占葉片面積的1%～10%以下為3 級；病斑面積占葉片面積的10%～30%為5級；病斑面積占葉片面積的31%～50%為7級；病斑面積占葉片面積的51%以上為9級）［22］，并記錄葉片總數和各級葉片數量，計算病情指數和相對防效，計算公式如下：

1.2.5 數據分析

使用Microsoft Excel 2021 和SPSS 26.0 軟件進行數據整理與分析，采用Duncan’s 新復極差法進行處理間的差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 endoPGs和RMK1的擴增結果

以RhizoctoniasolaniYC-9 的cDNA 為模板，使用特異性引物進行PCR 擴增，分別得到endoPGs（562 bp）和RMK1（412 bp）（圖1）。

圖1 endoPGs和RMK1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram for endoPGs and RMK1

2.2 dsRNA-endoPGs 和dsRNA-RMK1 的體外轉錄結果

使用T7 RNAi Transcription Kit 試劑盒構建體外轉錄dsRNA 體系，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄產物，分別得到dsRNA-endoPGs（562 bp）和dsRNA-RMK1（412 bp）（圖2）。

圖2 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoretogram for dsRNA-endoPGs and dsRNA-RMK1

2.3 dsRNA-endoPGs 和dsRNA-RMK1 對離體葉片煙草靶斑病病斑的抑制效果

將噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK124 h后接種RhizoctoniasolaniYC-9的煙草離體葉片培養于28 ℃的人工氣候溫室（16 h 光照/8 h 黑暗），接種后7 d 煙草離體葉片病斑見圖3。通過計算發現，dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的病斑抑制率分別為62.10%和60.00%（表1）。

表1 不同處理對離體葉片煙草靶斑病病斑抑制率①Tab.1 Inhibition rates of different treatments on tobacco target spot lesions for tobacco leaves in vitro

2.4 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的大田防治效果

dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的大田防治效果試驗結果表明，噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1均能有效抑制RhizoctoniasolaniYC-9對煙草的侵染。使用dsRNA-endoPGs3次對煙草靶斑病的相對防效分別為58.88%、53.11%和50.38%，使用dsRNA-RMK13 次對煙草靶斑病的相對防效分別為57.51%、53.85%和50.19%，雖均低于8%井岡霉素可溶液劑，但仍然顯示出較好的防治效果（表2）。

表2 不同處理對煙草靶斑病的大田防治效果Tab.2 Control efficacies of different treatments on tobacco target spot in field

3 討論

離體葉片煙草靶斑病病斑抑制效果試驗和煙草靶斑病大田防治效果試驗結果表明，向煙草葉片表面噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1可有效抑制RhizoctoniasolaniYC-9 對煙草的侵染，這與McLoughlin等［12］在葉片表面噴施dsRNA顯著抑制甘藍型油菜上核盤菌侵染的研究結果一致。dsRNAendoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的相對防效低于對照藥劑8%井岡霉素可溶液劑，可能是由于本研究中的dsRNA不夠穩定，在使用過程中被降解。納米載體介導的RNAi遞送系統具有高效、穩定、低劑量、緩釋等優點［23］，下一步可考慮根據周晨等［24］的研究結果，使用殼聚糖和CQD納米粒子與dsRNA進行混合，形成穩定的復合顆粒，還可根據王嘉琪等［25］的研究結果，將層狀雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）與dsRNA融合，進一步提高dsRNA-endoPGs和dsRNARMK1防治煙草靶斑病的效果。

4 結論

以endoPGs 和MAP 激酶作為RhizoctoniasolaniYC-9 的RNAi 靶點，合成了dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1。將dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1噴施于煙草葉片表面有效抑制了煙草靶斑病的發生。離體葉片煙草靶斑病病斑抑制效果試驗中，dsRNA-endoPGs和 dsRNA-RMK1對RhizoctoniasolaniYC-9的病斑抑制率分別達62.10%和60.00%；煙草靶斑病大田防治效果試驗中，使用dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK13次對煙草靶斑病的相對防效均高于50%。