包膜丁酸鈉對大規格刺參生長性能、消化、抗氧化和相關基因表達的影響

王成強 ,李寶山 ,孫永智 ,王曉艷 ,郝甜甜 ,相智巍 ,劉財禮,王佩鋒,王際英

（1.山東省海洋資源與環境研究院/山東省海水漁用飼料工程技術研究中心/水生動物營養與飼料研發創新示范平臺/山東省海洋生態修復重點實驗室/煙臺市海珍品質量安全控制與精深加工重點實驗室，山東 煙臺 264006;2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

近年來，隨著刺參(Apostichopus japonicus)養殖朝集約化方向不斷發展，病害問題也頻繁發生，嚴重制約了產業發展，同時在飼料禁抗大環境下，尋求能夠提高刺參免疫能力和抗病力的適宜添加劑顯得尤為重要。其中，丁酸鈉(Sodium butyrate)是丁酸的鈉鹽，有效成分為丁酸，是腸道微生物發酵形成的短鏈脂肪酸，能夠為腸上皮細胞提供能量，抑制腸炎發生，同時在提高生長性能和營養利用方面均具有積極作用，己成為目前備受關注的抗生素替代品之一[1-2]。

丁酸鈉作為綠色替抗產品對水生動物的生理功能具有重要調節作用，在小規格刺參(3.20 g)[3]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[4]、草魚(Ctenopharyngodon idella)[5]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[7]、鯽(Carassius auratus)[8]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[9]等研究中均表明，其在促生長、改善腸道健康和提高消化吸收能力方面具有不錯表現。另外，丁酸鈉還可以緩解機體氧化應激，提高魚體抗應激能力，抑制炎癥因子生成，減輕腸道炎癥反應[10-12]。Liu等[3]對大菱鲆的研究表明，飼料丁酸鈉通過抑制其腸道內核因子-κB (NF-κB)信號通路和降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因表達來減輕飼料中添加豆粕帶來的腸道疾病。然而，在較大規格刺參中關于丁酸鈉是否能夠對其生長、飼料利用、消化和免疫能力產生積極影響尚未見相關報道。因此，本實驗選取大規格刺參為研究對象，通過在飼料中添加不同水平的包膜丁酸鈉，旨在探究丁酸鈉對大規格刺參生長性能、消化能力和免疫能力的影響，以期為丁酸鈉在刺參養成階段生產中的合理利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以魚粉和谷朊粉為主要蛋白源，大豆卵磷脂為主要脂肪源，配制粗蛋白質質量分數約為16%、粗脂肪質量分數約為2%的基礎飼料。通過在基礎飼料中分別添加0、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60% 的包膜丁酸鈉(購自青島根源生物技術有限公司，丁酸鈉有效質量分數≥75%)，制成6 組等氮等脂的實驗飼料，其中未添加組為實驗對照組。首先將所有原料粉碎過篩，之后將各種原料按逐級擴大法均勻混合，然后加入適量的水，制成面團，再用自動制粒機制粒，制好的飼料放置于45～50 ℃左右烘箱中烘干，保存于陰涼干燥處，備用。實驗飼料組成及營養水平見表1。

表1 不同包膜丁酸鈉水平實驗飼料的配方和營養組成質量分數Table 1 Formulation and nutrient compositions mass fraction of different coated sodium butyrate levels the experimental diets %

1.2 養殖管理

實驗用刺參購自山東安源種業科技有限公司，實驗地點是山東省海洋資源與環境研究院東營實驗基地，養殖周期為8 周，養殖方式為循環水養殖。正式實驗開始前，用基礎飼料暫養2周，使其適應實驗飼料與養殖環境。暫養結束后，停飼24 h，挑選參刺堅挺粗壯、大小均一的刺參[初始體質量為(55.96± 0.20) g]隨機分到18 個養殖桶(直徑75 cm，深度80 cm)中，每個養殖桶放置25 頭刺參，每個實驗組3 個重復，每個桶內放置1 個布滿波紋板的海參專用筐，控制水深為60 cm。每天在規定時間(16:00)投喂，投喂量為刺參初始體質量的3%，具體投喂量要根據刺參攝食情況進行調整。實驗期間，每3 d換水1 次，換水量為1/2，換水時用虹吸管將殘餌和糞便吸出。同時，水溫控制在15～18 ℃，鹽度為25～27，溶解質量濃度＞6.5 mg/L，氨氮和亞硝酸氮質量濃度均＜0.05 mg/L。

1.3 樣品采集與分析

養殖實驗結束時，禁飼48 h，對每個養殖桶內刺參進行計數和稱質量。之后，從每個養殖桶中隨機取出10頭刺參，置于白色托盤中，測量體質量，之后進行解剖，分別取體腔液、腸道及體壁，測量腸道質量，用于計算腸體比。將腸道樣品及時保存于-80 ℃超低溫冰箱中，體壁保存于-20 ℃冰柜中，同時對體腔液進行離心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)，取上清液分裝在離心管中，之后也將其保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

另外，從每個養殖桶中隨機取出3頭刺參，在無菌條件下，進行解剖，取其腸道組織，放置于2 mL無RNase 的離心管中并迅速置于液氮中速凍，之后將樣品放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于腸道中相關基因的熒光定量分析。

1.4 樣品常規及生化分析

實驗飼料和刺參體壁的水分測定采用105 ℃烘干恒重法測定(GB/T6435—2014)，粗蛋白質采用凱氏定氮法測定(GB/T6432—2018)，粗脂肪采用索氏抽提法測定(GB/T6433—2006)，粗灰分采用馬弗爐550 ℃失重法測定(GB/T 6438—2007)。

腸道中淀粉酶(Amylase)、脂肪酶(Lipase)、蛋白酶(Protease)、總抗氧化能力酶(Total antioxidant capacity enzyme,T-AOC)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量均利用南京建成生物工程研究所生產的相應試劑盒測得，各種酶活性單位參照試劑盒說明書表示。

1.5 實時定量PCR(RT-PCR)

采用實時定量PCR 檢測刺參腸道中Rel、P105和lysozyme基因相對表達量的變化。

1.5.1 總RAN 的提取 采用Trizol(Takara,日本)法提取刺參腸道中總RNA，具體操作流程參考王成強等[13]實驗方法

1.5.2 RNA 反轉錄 首先使用超微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000，美國)檢測RNA 濃度和純度，反轉錄時要求反應體系中總RNA 量不超過1 μg。再使用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara，日本)進行反轉錄合成cDNA，具體步驟參照試劑盒說明書，合成的cDNA保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.5.3 引物設計 選用刺參β-actin基因作為管家基因，并根據NCBI 數據庫中基因序列，利用Primer Premier 5設計引物，以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本實驗所用基因及引物序列詳情見表2。

表2 實時定量PCR引物序列Table 2 The primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.5.4 實時定量PCR 步驟 定量儀器為實時定量PCR 儀(Roche LightCycler?480Ⅱ,瑞士)。定量反應體系為20 μL，其中包括10 μL SYBR?Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus) (2×) (Takara,日本)、0.8 μL上游引物(10 μmol/L)、0.8 μL 下游引物(10 umol/L)、2 μL cDNA 模板和6.4 μL 的無菌水。反應程序為95 ℃持續30 s，循環數為1；95 ℃持續5 s，56～60 ℃持續20 s，共進行40 個循環；溶解曲線按照已經默認程序進行。首先進行目的基因和內參基因(β-actin)擴增效率(E)一致性的驗證，擴增效率的計算公式為E=10×(-1/S)-1，其中S是以Cq值為縱坐標，lg (相對模板拷貝數)為橫坐標得到的斜率。在驗證目的基因與內參基因擴增效率一致后，采用2-ΔΔCq方法測定目的基因的相對表達量，其中ΔΔCq=實驗組(Cq 目的基因-Cq 管家基因) -對照組(Cq目的基因-Cq管家基因)。

1.6 計算公式及統計分析

存活率=終末數量/初始數量；

在警察高校的教學體系中，理論教學是實驗教學的前提和基礎，實驗教學則是培養和提高學生綜合實踐應用能力的主渠道。多數情況下，理論教學與實驗教學同等重要。而對一些實踐性、應用性極強的警察專業課程而言，實驗教學則應明顯重于理論教學。一直以來，警察高校對理論教學與實驗教學的辯證關系問題，并沒有深入思考和探究，更沒有真正得以解決，在一定程度上成為了阻礙應用型人才培養目標實現的主要原因之一。

增重率=(終末體質量-初始體質量)/初始體質量；

特定生長率=ln (終末體質量) -ln(初始體質量)]/實驗時間（d）；

飼料效率=(終末體質量-初始體質量)/攝食飼料干質量；

腸體比=腸道質量/刺參體質量。

所得實驗數據用平均值± 標準誤差(Mean ±SE)來表示，用SPSS19.0 分析軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，另外用Duncan's 法進行多重比較，當P＜0.05時差異顯著。

2 結果

2.1 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參生長性能的影響

表3 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參生長性能的影響Table 3 Effects of different coated sodium butyrate levels on growth performance of Apostichopus japonicus

2.2 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參體壁化學組成的影響

由表4 可知，當飼料中添加不同水平的包膜丁酸鈉時，各組刺參體壁的水分、粗蛋白質、粗脂肪以及粗灰分含量均無顯著影響(P＞0.05)，其中干質量條件下，刺參體壁中粗蛋白質含量為45.32%～45.77%，粗脂肪含量為3.56%～3.71%，粗脂肪灰分含量為31.06%～32.46%。

表4 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參體壁化學組成的影響（干質量）Table 4 Effects of different coated sodium butyrate levels on body wall chemical composition of Apostichopus japonicus（dry mass）

2.3 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道消化酶活性的影響

由表5 可知，飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道中蛋白酶和脂肪酶有顯著影響，其中添加量為0.20%～0.60%時，刺參腸道的蛋白酶活性和脂肪酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，且均在0.40%添加組達到最大值。當添加量為0.20%時，蛋白酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，與其他實驗組均無顯著性差異(P＞0.05)，而脂肪酶活性卻顯著低于0.40%和0.60%添加組(P＜0.05)，同0.05%和0.10%添加組無顯著差異(P＞0.05)。另外，結果顯示，刺參腸道中淀粉酶活性在不同實驗組間無顯著差異(P＞0.05)。

表5 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道消化酶活性的影響Table 5 Effects of different coated sodium butyrate levels on digestive enzymes in intestinal tract of Apostichopus japonicus

2.4 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道抗氧化能力的影響

表6 顯示，與對照組相比，飼料中添加0.10%～0.60%的包膜丁酸鈉均顯著提高刺參腸道中SOD、CAT 活性和T-AOC 水平，其中在添加量為0.40%和0.60%時，刺參腸道中SOD、CAT活性和T-AOC水平分別達到較高水平(P＜0.05)。另外，添加量為0.05%時，刺參腸道中SOD、CAT 活性和T-AOC 水平同對照組均無顯著差異(P＞0.05)。刺參腸道中MDA 含量呈現同SOD 活性相反的變化趨勢，在對照組和0.05%添加組處于較高水平，顯著高于0.20%、0.40%和0.60%添加組(P＜0.05)，同0.10%添加組無顯著差異(P＞0.05)。而在0.20%、0.40%和0.60%組刺參腸道中MDA含量無顯著差異(P＞0.05)。

表6 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道抗氧化能力的影響Table 6 Effects of different coated sodium butyrate levels on antioxidant capacity in intestinal tract of Apostichopus japonicus

2.4 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道Rel、P105和lysozyme相對表達量的影響

由圖1 可知，刺參腸道中Rel和lysozyme相對表達量均隨包膜丁酸鈉添加水平升高先顯著升高，隨后又下降，且最大值均出現在0.40%添加組，顯著高于對照組、0.05%和0.10%添加組(P＜0.05)。同時發現，0.40%添加組刺參腸道中lysozyme相對表達量顯著高于0.60%添加組(P＜0.05)，同0.20%添加組無顯著性差異(P＞0.05)。另外，丁酸鈉添加量在0.10%以上時，刺參腸道中P105相對表達量顯著低于對照組和0.05%組(P＜0.05)，其中0.40%添加組表達量最低，與0.20%添加組無顯著差異(P＞0.05)，而顯著低于0.60%添加組(P＜0.05)。

圖1 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道免疫相關基因相對表達量的影響Fig.1 Effects of dietary coated sodium butyrate level on relative mRNA expression of immunity-related genes in intestinal tract of Apostichopus japonicus

3 討論

3.1 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參生長性能的影響

近年來一系列研究指出，飼料中添加適量丁酸鈉對水生動物具有明顯促生長作用。魏朝青等[7]研究指出，飼料中添加質量分數0.15%的丁酸鈉能顯著提高大菱鲆幼魚的增重率和特定生長率，同時也提高了飼料效率。在斜帶石斑魚研究中發現，若以增重率為評價指標，丁酸鈉的適宜添加水平為0.20%[4]。Liu 等[14]研究發現，添加1 000 或2 000 mg/kg 丁 酸鈉的飼料均能顯著提高草魚的特定生長率。Silva等[15]在凡納濱對蝦研究中發現，飼喂適宜水平丁酸鹽顯著提高凡納濱對蝦產量，且丁酸鈉0.20%添加組凡納濱對蝦的增重率最高。張松琳等[16]研究發現，在飼料中添加質量分數0.10%丁酸鈉，美洲鰻鱺(Anguilla rostrata)的增重率提高37%，飼料系數降低26%。高永剛等[3]研究指出，飼料中添加質量分數0.20%和0.3%的包膜丁酸鈉可提高小規格刺參(3.20 g)的生長性能。本實驗結果也表明，當飼料中丁酸鈉添加量為0.40%時，大規格刺參(55.96 g)獲得最高的增重率和特定生長率，同時飼料效率也處于較高水平，這表明適宜丁酸鈉可以對大規格刺參的生長性能產生積極影響，與上述相關研究結果相似。產生這一積極影響的原因應該與丁酸鈉可影響腸道健康，調節腸道菌群，提高了刺參對營養物質的消化吸收有關[9,17]。

上述相關研究結果表明，不同水生動物對于丁酸鈉需求量是不同的。而本研究中這一添加量高于上述其他研究，一方面可能是養殖種類、規格大小與養殖環境不同造成的；另一方面可能是因為刺參腸道中菌群豐度較魚蝦相對低，且對營養物質的利用不足導致的，具體原因有待進一步探究。另外，在本實驗中，當丁酸鈉添加量為0.60%時，刺參的增重率出現了一定的下降，這說明過量丁酸鈉可能會對刺參生長產生抑制作用，分析原因可能是因為攝入過多丁酸鈉會降低消化道內的pH，影響到相關消化酶活性，從而降低了腸道對營養物質利用[18]，具體原因在下面研究中會得到進一步闡述。

3.2 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參體壁化學組成的影響

本研究結果顯示，飼料中不同丁酸鈉添加水平對刺參體壁中粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著影響。這與翟秋玲等[19]在菊黃東方鲀(Takifugu flavidus)、魏朝青等[7]在大菱鲆、Liu 等[14]在草魚、黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)[20]上的研究結果一致。但在尼羅羅非魚和黃顙魚(Tachysurus fulvidraco)的研究中發現，魚體粗蛋白質含量會隨飼料丁酸鈉添加量增加顯著提高，這可能與丁酸鈉能夠促進上皮細胞的增殖和分化，改善腸道吸收功能有關[21]；也可能與丁酸鈉可以提高小肽轉運載體1 (PepT1)表達水平，促進小肽吸收，使得食物轉化為結構蛋白的效率更高有關[22]。

3.3 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道消化酶活性的影響

消化酶活性直接影響養殖對象對飼料營養成分消化、吸收和利用率，也是評價腸道健康的重要指標之一。在水生動物的研究中已表明，丁酸鈉可以提高腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，如在巨骨舌魚(Arapaima gigas)飼料中添加丁酸鈉，飼喂45 d，腸道的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性顯著增加[23]；在卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)的研究中表明，飼料中添加2.0、4.0 g/kg的丁酸鈉可提高腸道蛋白酶、淀粉酶、堿性磷酸酶和Na/K-ATP酶的活性[24]；在草魚研究中表明，飼料中添加0.10%丁酸鈉可顯著提高腸道胰蛋白酶和蛋白酶活性，對淀粉酶無顯著影響[17]；在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的研究中表明，添加丁酸鈉可提高蝦腸道脂肪酶、肝胰腺蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，從而提高蛋白質、多糖和脂質的消化率[25]。同時，本實驗結果也顯示，飼料中添加質量分數0.40%包膜丁酸鈉顯著提高腸道蛋白酶和脂肪酶活性。這也進一步說明丁酸鈉對陸生和水生動物的消化酶活性均有一定提高作用，這可能與丁酸鈉可以改善腸道組織形態，調整腸道菌群結構等原因有關。

3.4 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道抗氧化能力的影響

SOD、CAT 和T-AOC 可以清除機體內部活性氧(ROS)，以避免脂肪酸氧化的發生，減輕ROS的毒性作用，從而能夠保護生物免受氧化損傷，在機體抗氧化中起關鍵作用[26]。因此，SOD、CAT 活性和T-AOC 可以反映機體抵抗氧化應激的能力，并間接體現水生動物免疫力水平。本研究結果顯示，當飼料中添加超過質量分數0.10%的包膜丁酸鈉時，刺參的腸道SOD 和CAT 活性及T-AOC 均顯著高于對照組，且在添加量為0.40%時達到較高水平，較對照組分別提高了17%、43%和42%。

包膜丁酸鈉的添加量為0.40%時，腸道MDA含量顯著降低，較對照組降低了20%。而MDA 是自由基引發脂質過氧化反應后得到的最終分解產物，其含量可能間接反映水生動物的損傷程度和抗氧化能力，其含量越高說明機體受到的損害越嚴重[27]。因此，上述抗氧化能力相關指標的研究結果說明丁酸鈉可以通過調節刺參機體的抗氧化能力，增強機體清除自由基的能力，減少組織和細胞損傷。這一結果同之前研究結果相似。Zhang 等[28]研究發現，飼料中添加1.0 g/kg 丁酸鈉可明顯提高美洲鰻鱺肝臟T-AOC、CAT 活性，降低MDA 含量；在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究中也表明，飼料中加入丁酸鈉顯著提高腸道抗氧化酶(如SOD、CAT 和GSH-Px)活性[29]；魏朝青等[7]在大菱鲆的研究中證實，飼料中添加質量分數0.3%丁酸鈉時，肝臟SOD和CAT活性及T-AOC均顯著高于為添加組，且丁酸鈉顯著降低了肝臟MDA 含量。另外，在奶牛[30]、肉雞[31]等陸生動物的研究中也得到了類似的結論。

3.5 飼料中添加包膜丁酸鈉對刺參腸道Rel、P105和lysozyme相對表達量的影響

眾多研究表明，丁酸鹽除了能夠為腸上皮細胞快速提供能量之外，還具有廣泛的抗炎作用。目前研究最多的丁酸鹽抗炎機制是丁酸鈉對信號分子NF-κB 的抑制。NF-κB 廣泛存在于動物細胞中，是進化上高度保守的信號模塊，控制著包括抗菌肽、細胞因子、活性氧生成酶等在內的許多免疫基因的表達，在機體的炎癥反應發生的過程中發揮著至關重要的作用[32]。汪婷婷[33]研究表明，在脂多糖刺激后，刺參體內NF-κB信號通路被激活，其中Rel呈先上升后下降，而P105呈顯著降低后上升的趨勢，而P50呈現同P105相反的變化趨勢，這可能與P50和Rel一旦和轉入核內，它們就會形成二聚體調控相關基因的表達有關。在草魚中的研究也表明，飼料中補充丁酸鈉顯著改善與NF-κB 和p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路相關的局部腸道免疫功能[17]。在歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)[34]、鯉(Cyprinus carpio)[35]等研究中均指出，飼料中添加丁酸鈉可通過下調促炎因子，上調抗炎因子達到緩解/抑制炎癥反應的目的。本研究發現，當包膜丁酸鈉添加量在0.20%～0.40%時，刺參腸道Rel相對表達量處于較高水平，顯著高于對照組，而此時P105相對表達量卻處于較低水平，顯著低于對照組。這說明在刺參中丁酸鈉也能夠通過調控NF-κB 信號通路來實現抗炎作用。此外，丁酸鈉作為一種去乙?；?HDAC)抑制劑，可能通過改變組蛋白的乙酰化程度來改變染色質結構，從而參與相關基因的調控，抑制炎癥反應過程[36]。而丁酸調控NF-κB的作用可能也與其潛在的抑制組蛋白去乙酰酶的作用相關。

溶菌酶作為天然免疫中重要的免疫因子，在刺參防御病原微生物方面具有重要作用，溶菌酶受信號通路的調控從而發揮抗菌作用，增強機體抗病力。研究表明，溶菌酶的表達直接受NF-κB 信號通路的調控[37]。本研究結果顯示，當包膜丁酸鈉添加量在0.20%～0.40%時，腸道lysozyme相對表達量顯著高于對照組，這說明在這一添加范圍內，溶菌酶表達得到較大提升。同時，張曉曉等[6]研究也指出，飼料中添加適量丁酸鈉可以提高凡納濱對蝦血清中溶菌酶活性，提高機體非特異性免疫能力。值得注意的是，本實驗中lysozyme相對表達量的變化趨勢同Rel相似，這也進一步驗證了上述丁酸可以通過調控NF-κB 產生抗炎作用的研究結論。因此，表明在刺參中丁酸鈉可以通過調控NF-κB 信號通路及相關轉錄因子，進而對溶菌酶產生積極影響，達到抗炎作用。

4 結論

綜上可知，在本研究條件下，飼料中適量包膜丁酸鈉(質量分數0.40%)對大規格刺參的生長性能、消化及抗氧化能力具有一定促進作用。丁酸鈉可以通過調節NF-κB 信號通路相關因子影響刺參的腸道抗炎水平，進而對機體的免疫能力產生積極影響，具體影響機制有待進一步深入研究。