丁香酚對褐菖鲉的麻醉效果

陳欣怡，王好學，徐開達，李鵬飛，周永東

（1.浙江海洋大學海洋與漁業研究所/2.浙江省海洋水產研究所，農村農業部重點漁場漁業資源科學觀測實驗站，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大學水產學院，浙江 舟山 316022）

褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes）鲉科（Scorpaenidae）菖鲉屬（Sebastiscus），俗稱石頭鱸、石九公等[1]，其營養價值豐富，是沿海重要的經濟魚種[2-3]。近年來由于人類過度捕撈，褐菖鲉資源衰退嚴重，為補充其資源量，相關部門已連續多年開展增殖放流活動[4]，有研究表明增殖放流過程中標志、運輸等環節可能引發魚體應激造成損耗[5]，且褐菖鲉受到外部刺激時背部硬鰭條會豎起展開，容易使操作人員受傷，不利于相關生產活動和實驗操作開展。楊州等[6-7]指出合理使用麻醉劑可以抑制麻醉對象中樞神經，使其在一定時間內進入低消耗休眠狀態，從而在受外界刺激時減少應激反應，降低損傷及致死危害，有利于提高魚苗放流的成活率。因此，研究麻醉劑對褐菖鲉的麻醉效果有重要實際意義。

目前魚用麻醉劑有包括丁香酚、MS-222、苯唑卡因等十幾種[8-9]，其中丁香酚不僅價廉易得，而且麻醉效率較高，其代謝物能夠快速從血液和組織中排出，不會對海洋生物和人體造成毒害影響[10]，在牙科醫學鎮痛及水產動物麻醉方面應用廣泛[11-12]。丁香酚用于各類魚種的麻醉研究已見諸多報道，包括大黃魚（Larimichthys crocea）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、大口黑鱸（Micropterus salmoides）、刀鱭（Coilia nasus）、暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）等30 多種[13-23]，上述研究發現麻醉不同魚種適用的丁香酚質量濃度存在較大差異，且丁香酚對褐菖鲉的麻醉效果未見報道，因此本研究開展褐菖鲉在不同濃度丁香酚作用下的麻醉復蘇實驗以及麻醉后不同空氣暴露時長的影響實驗，以期為進一步優化褐菖鲉標志放流技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

使用樣品為浙江省舟山市西軒漁業科技島培育的褐菖鲉苗種，體長（88.12 ± 4.87）mm，體質量（19.58 ± 3.30）g，實驗用魚達到標志放流標準規格[24]，魚體健康，體質強健。實驗前15 d分別暫養于15 個200 L 白色圓形養殖桶，每日上午8 點及下午5 點喂食，實驗前2 d停止投喂。實驗所用為自然海水，海水溫度為（15.7 ± 0.5）℃，經過濾處理引入養殖桶。麻醉劑為常熟尚齒齒科材料有限公司生產的質量分數96%丁香酚，淡黃色油狀液體，難溶于水，需無水乙醇助溶。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻醉劑配制 以丁香酚、無水乙醇按體積比1∶9 的配制母液，隨配隨用。實驗時根據所需濃度在20 L的潔凈塑料盆中用海水稀釋母液。

1.2.2 麻醉/復蘇階段及行為特征 褐菖鲉麻醉及復蘇過程參考彭寧東等[25]和劉長琳等[26-27]研究結果，將麻醉階段分為Ⅰ-Ⅵ期（表1），復蘇階段分為Ⅰ-Ⅳ期（表2）。在不同質量濃度丁香酚溶液中分別浸浴2 尾實驗魚，選擇麻醉行為分期較明顯的質量濃度50 mg/L 進行褐菖鲉行為特征觀察，實驗魚每組6尾，設3組平行，一半觀察至Ⅵ期麻醉（魚體死亡），一半達到Ⅳ期麻醉后立即從丁香酚溶液轉移至自然海水復蘇，重復3 次，觀察并對褐菖鲉麻醉/復蘇各階段進行行為特征描述（表1、表2），并以此作為后續實驗判斷麻醉與復蘇階段的標準。

表1 褐菖鲉麻醉過程分期及行為特征Table 1 Anesthesia stage and behavior characteristics of Sebastiscus marmoratus

表2 褐菖鲉復蘇過程分期及行為特征Table 2 Stages and behavioral characteristics of recovery process of Sebastiscus marmoratus

1.2.3 最終麻醉程度 根據預實驗結果，設計10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150和180 mg/L 共12 個質量濃度梯度，各梯度實驗用魚5 尾，設置3 組平行組，因低質量濃度麻醉劑褐菖鲉入麻時間較長，由此設定最長浸浴時間為30 min，并在3、5、10、15、20 和30 min 時觀測記錄各質量濃度下褐菖鲉的麻醉程度。結果表明丁香酚質量濃度低于30 mg/L時褐菖鲉不能在3 min 內入麻，質量濃度在50～180 mg/L 時，30 min 內均出現不同程度的死亡情況。

1.2.4 麻醉、復蘇時間測定 預實驗得出各質量濃度組褐菖鲉全部麻醉至多需要4.4 min，全部復蘇至少需要6.9 min，綜合考慮褐菖鲉復蘇時間較其他魚種更長的特點，本實驗設定3 min 內麻醉，7 min 內蘇醒，麻醉15 min 后存活率100%為有效麻醉濃度。結合實驗1.2.3 的結果以及相關文獻[28]，選取30、40、50、60、70、80 mg/L 共6 個質量濃度的丁香酚溶液分別測定褐菖鲉入麻與復蘇所需的時間，各組實驗用魚12尾，設置3個平行組。

1.2.5 空氣暴露時長對褐菖鲉復蘇的影響 對比上述實驗中褐菖鲉的麻醉/復蘇時間，選定麻醉劑質量濃度為40 mg/L，以此設計空氣暴露實驗，預實驗得出致死空氣暴露時間為（49.9 ± 8.1）min，因此設最長空氣暴露時間為60 min，實驗魚在40 mg/L 丁香酚溶液中浸浴至Ⅳ期麻醉后撈出置于濕潤毛巾，再覆蓋一層濕毛巾僅使頭部暴露在空氣中。各實驗組分別暴露3、5、10、15、20、30、45、60 min 后放入自然海水觀察復蘇情況并記錄完全復蘇所需時間，另設置一組實驗魚在進入Ⅳ期麻醉后空氣暴露至無生命體征，記錄致死時間。復蘇時間以褐菖鲉出現復蘇特征（平衡恢復期）的時間判斷蘇醒狀況，實驗結果以平均值± 標準差表示，復蘇率為完全復蘇個體占實驗個體總數的比例。

1.2.6 數據處理 本實驗所得數據使用Microsoft Excel 2016、Origin Pro 2021 和SPSS 進行統計分析及多重比較，描述性統計結果用平均值±標準差來表示，顯著性水平α為0.05（差異顯著）和0.01（差異極顯著）。

2 結果與分析

2.1 30 min內不同質量濃度丁香酚溶液下褐菖鲉的最終麻醉程度

由圖1可知，浸浴時長為30 min時，所有組別均能達到Ⅳ期（麻醉狀態），10～40 mg/L 最終麻醉程度為Ⅴ期深度麻醉，50 mg/L 及以上質量濃度最終麻醉程度能達到Ⅵ期（魚體死亡）且均為部分實驗魚為Ⅴ期，部分實驗魚為Ⅵ期，其中10、20 mg/L 組部分實驗魚為Ⅳ期，部分實驗魚為Ⅴ期，30 和40 mg/L 組全部實驗魚為Ⅴ期深度麻醉，麻醉程度高的實驗魚占比基本隨麻醉劑濃度升高而增大。

一定質量濃度的丁香酚溶液中，浸浴時間越久麻醉程度越高，致死概率越大。麻醉5 min 內僅有180 mg/L 組出現少部分死亡，麻醉30 min 時50～180 mg/L均出現不同程度死亡，其中120～180 mg/L丁香酚溶液中浸浴30 min 死亡率高達90%。由結果得出，若需在短時間內麻醉褐菖鲉可選擇40～150 mg/L 的丁香酚溶液；若需褐菖鲉較長時間保持麻醉狀態可選擇10～40 mg/L 的丁香酚溶液，麻醉時間控制在30 min之內較為合適。

2.2 麻醉、復蘇時間及有效質量濃度的確定

由圖2 可知，褐菖鲉麻醉所需時間隨丁香酚質量濃度上升基本呈減少趨勢，質量濃度在40 mg/L時麻醉所需時間明顯減少，30 mg/L組麻醉所需時間與其余組差異極顯著（P＜0.01），40 mg/L 組與60～80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05），50 mg/L 組與70～80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05）；丁香酚質量濃度在30～40 mg/L 時，褐菖鲉復蘇所需時間隨丁香酚質量濃度上升基本呈減少趨勢，質量濃度40～70 mg/L 之間，復蘇時間基本呈增加趨勢，質量濃度在40 mg/L 和80 mg/L 時，復蘇時間明顯減少，分析得出：40 mg/L 組復蘇時間與60～80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05），50 mg/L 與80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05），70 mg/L 組復蘇時間與其余組差異極顯著（P＜0.01）。

30 mg/L 丁香酚溶液用于麻醉褐菖鲉濃度偏低，無法使其在1.2.4設定的有效麻醉濃度判定標準（3 min）內全部進入Ⅳ期麻醉，在30、60～80 mg/L丁香酚溶液中，褐菖鲉無法在7 min 內全部復蘇，且由2.1 可知，只有當丁香酚質量濃度小于60 mg/L時，褐菖鲉在麻醉劑中浸浴15 min 后沒有出現死亡，成活率達到100%，因此，丁香酚麻醉褐菖鲉的適宜濃度范圍為40～50 mg/L。

2.3 空氣暴露時長對褐菖鲉復蘇的影響

根據2.2 實驗結果選取40 mg/L 的麻醉濃度進行實驗，結果顯示，褐菖鲉在該質量濃度丁香酚溶液中浸浴（2.90 ± 0.46）min 均能進入Ⅳ期麻醉。由圖3 可知：褐菖鲉空氣暴露后復蘇率自20 min 起呈下降趨勢，空氣暴露30 min 時，復蘇率為87.5%；空氣暴露45 min 存活率為83.3%；空氣暴露60 min，實驗魚全部死亡。空氣暴露3～20 min 內，各組復蘇時間差異不顯著（P＞0.05），空氣暴露30 min 與5～20 min 組復蘇時間差異顯著（P＜0.05），空氣暴露45 min與其余組差異均顯著（P＜0.05）；空氣暴露時間在15 min以內，平均復蘇時間隨空氣暴露時間延長而縮短，最快入水3 s 即可正常游動；空氣暴露15～45 min 時，平均復蘇時間隨空氣暴露時間延長逐步增加，且復蘇率逐步降低，觀測到最長復蘇時間為13.54 min。根據平均復蘇時間變化趨勢推測，空氣暴露15 min 時褐菖鲉可將麻醉劑基本代謝從而逐漸復蘇，因此今后若需進行離水操作研究，建議將操作時間控制在15 min 以內，避免褐菖鲉應激造成損害。

圖3 空氣暴露時間對褐菖鲉復蘇時間及復蘇率的影響Fig.3 The effect of air exposure time on recovery time and recovery rate of Sebastiscus marmoratus

3 討論

3.1 丁香酚對褐菖鲉的麻醉效果

從實驗結果（圖1和圖2）可以看出，丁香酚質量濃度在50 mg/L 時，褐菖鲉最終麻醉程度能達到Ⅵ期麻醉，且麻醉時間隨麻醉劑質量濃度逐漸增加而逐漸縮短，復蘇時間基本隨麻醉劑質量濃度逐漸增加而逐漸增加，這與其他魚類研究結果相一致[29-30]。但出現質量濃度30 mg/L 組實驗魚復蘇時間長于40 mg/L組，70 mg/L組實驗魚復蘇時間長于80 mg/L組的情況。金元等[31]指出麻醉時間過長會導致魚體吸收麻醉劑含量超出可承受臨界值而出現毒性致死現象，而麻醉劑質量濃度過低時需耗費更長時間進入麻醉狀態使得更多麻醉劑進入魚體各組織，因此30 mg/L 質量濃度實驗魚需要耗費比40 mg/L 組更長時間代謝麻醉劑，同理80 mg/L 組由于濃度高，實驗魚進入麻醉耗費時間少，吸收的麻醉劑劑量少，因此恢復得更快。通常來說，麻醉時間越長麻醉濃度越大，魚體出現死亡可能性越大，但圖1中部分組別如10 min 時的80、90 mg/L 組，20 min 時的70、90、120 mg/L 組，30 min 時的60、90 mg/L 組出現死亡率低于相鄰濃度組，推測其原因為實驗魚個體差異，因此盡量選擇體格相似的同批魚苗以控制實驗變量。

3.2 關于丁香酚麻醉褐菖鲉的有效質量濃度

丁香酚主要是通過鰓絲或體表被魚體吸收進入血液循環，通過抑制腦皮質的中樞神經系統致使其觸覺麻痹，再作用于基底神經節和小腦，最后作用于脊髓，使魚體全身麻醉[32-33]。有研究表明硬骨魚類的最適麻醉質量濃度基本在20～100 mg/L 之間[26]，本實驗得出丁香酚對于標志規格褐菖鲉的有效麻醉質量濃度范圍為40～50 mg/L，研究結論高于大黃魚5～10 mg/L[14]、錦鯉（Cyprinus carpio）15～20 mg/L[30]、斑馬魚（Danio rerio）20 mg/L[19]等，低于俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）80～100 mg/L[34]，推測由于不同魚種神經生理特性存在差異[35]，其機體內部交互信息傳遞有一定區別導致麻醉劑作用于各部位存在時間差，使得不同魚種對同種麻醉劑的敏感程度有所區別[36]。對不同質量濃度丁香酚作用下褐菖鲉的麻醉復蘇時間進行線性回歸分析發現，一定范圍內的丁香酚質量濃度會對麻醉所需時間產生極顯著負向影響關系（P＜0.01），對復蘇時間有極顯著正向影響關系（P＜0.01），因此需縮短麻醉時間時可適度增加丁香酚質量濃度。

此外，魚種、魚體規格、成熟度等都會影響適宜的麻醉質量濃度，其中魚體規格及成熟度影響最為顯著。通常大型魚需要的麻醉濃度高于小型魚，魚齡越大，需要的麻醉劑濃度更高但復蘇率低[37]。本實驗選取的實驗魚為標志放流規格的褐菖鲉幼魚，平均體長（88.22 ± 5.69）mm，日常增殖放流工作還包括更小規格的魚苗，因此可增加丁香酚對該魚種更多不同規格魚苗的麻醉實驗。

3.3 關于空氣暴露時間對褐菖鲉復蘇的影響

在進行標志取血、測量取樣等研究操作過程中需要魚體短暫離水，未經麻醉處理進行急性離水操作易造成不同程度的鰓組織永久性損傷、肌肉組織結構改變等[38]，麻醉后進行離水操作對其生理影響相對較小[39]。褐菖鲉經40 mg/L 的丁香酚麻醉后，隨空氣暴露時間延長，平均復蘇時間呈現先縮短后延長的趨勢：空氣暴露時間在3～15 min 時，實驗魚復蘇所需時間隨暴露時間延長而逐漸縮短；空氣暴露時間在15～45 min 時，實驗魚復蘇所需時間隨暴露時間延長而逐漸延長；空氣暴露60 min 時，實驗魚無法復蘇。由于許多硬骨魚類除鰓呼吸外還可通過皮膚呼吸進行部分代謝[40]，推測魚體在空氣中由皮膚代謝了一定量丁香酚使得體內麻醉濃度降低，從而逐漸復蘇，因此在15 min 以內，平均復蘇時間隨空氣暴露時間增加而縮短，15 min 之后由于魚體基本達到復蘇階段，但長時間離水導致缺氧或短暫休克，需要一定時間恢復正常生理活動，因此復蘇時間隨之延長。雖然麻醉后褐菖鲉在空氣中耐受時間較長，但考慮到缺氧會對魚體造成生理損害，且進入復蘇階段魚體逐漸活躍不易于進行各種操作，因此今后若進行需魚體長時間離水的實驗研究，建議麻醉后注意把握時間，盡量將離水過程控制在15 min以內。