富DHA-磷脂酰膽堿對雙酚S致小鼠肝損傷的影響

董佳昱，田姍姍，錢 麗，姜 蘇，唐云平

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.上海歐睿生物科技有限公司，上海 201101）

雙酚A（Bisphenol A，BPA）是一種工業廣泛使用的化合物，通常用于合成聚碳酸酯塑料、環氧樹脂和其他聚合物材料[1,2]，其可導致多種生殖毒性、肝腎損傷、糖尿病、血脂異常等毒性效應[2,3]。作為BPA的主要替代品之一，雙酚S（BPS）其結構更穩定且更不易被生物降解[4]，近年來其被廣泛用于塑料、奶瓶、牙科材料、品罐內涂層和包裝等產品中[5,6]。然而，近年來同樣發現，BPS 能從各種產品中浸出，可進入水體、土壤、空氣等并最終導致人體暴露[6]。BPS 暴露可引起內分泌紊亂、氧化應激和肝損傷等毒性效應[7,8]。

富二十二碳六烯酸-磷脂酰膽堿（DHA-PC）是一種富含DHA 的特殊海洋磷脂，其結構特征是sn-3位置結合磷脂酰膽堿，sn-2 位置結合的多不飽和脂肪酸以DHA 和二十碳五烯酸EPA 為主，具有緩解氧化應激損傷、降脂、護肝、護腎、調節腸道菌群等生物學功效[9-11]。馬琴等[12]發現DHA-PC 對小鼠血清和肝臟中的膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量有明顯降低效果，同時能夠提高肝臟及大腦中DHA含量。Zhang 等[13]發現DHA-PC 可通過調節脂質水平異常、線粒體和內質網膜結構形態和功能變化來改善高脂高果糖飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝（NAFLD）。筆者前期研究發現，大西洋鯡（Clupea harengus）魚籽的DHA-PC 可通過調節“腸-肝軸”來緩解高脂飲食導致的小鼠NAFLD[14]。然而，DHAPC 是否可緩解BPS 導致的氧化應激和肝損傷的研究目前尚未見報道。

本研究擬通過通過邊造模邊給藥的方式，于小鼠飲用水中加入5 mg·(kg·d)-1的BPS，同時灌胃80 mg·(kg·d)-1的DHA-PC，飼喂10 周，后通過肝臟病理切片、氧化應激、炎癥和脂質等指標綜合評價DHA-PC對BPS導致的小鼠氧化應激和肝損傷的緩解作用，以期提供一種緩解雙酚S 導致的氧化應激和肝損傷的可能策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA-PC 是由本課題組從大西洋鯡（C.harengus）魚籽中提取，其中DHA 質量分數為242 mg·g-1、EPA 質量分數為88 mg·g-1、PC 質量分數為461 mg·g-1[14]。所用的雄性C57BL/6 小鼠[n=24，5～6 周，（18±2）g]購自杭州子源實驗動物科技有限公司（中國杭州）。在SPF 級環境[12 h/12 h 明暗循環，（23±2）℃]飼養。

谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒和蘇木精-伊紅（H&E）染色試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所。白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α測定試劑盒購自于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；切片機（上海徠卡儀器有限公司）；手持均質儀（北京蘭杰柯科技有限公司）；超聲波細胞破碎儀（美國SONICS公司）；光學顯微鏡CX31（日本Olympus）。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計 動物實驗獲得浙江海洋大學科研倫理與誠信委員動物倫理委員會批準（許可證No.2021038）。適應性喂養1 周后，將小鼠隨機分為3 組（n=8），即對照組（CON）、模型組BPS 組[5 mg· (kg·d)-1BPS] 和給藥組DHA-PC 組[5 mg·(kg·d)-1BPS+80 mg·(kg·d)-1DHA-PC]。配制50 mg/mL BPS乙醇溶液，取50 μL加入到100 mL飲用水中（0.25 mg/mL），按照每只20 g 小鼠每天飲水4 mL的劑量喂養，使模型組和實驗組小鼠BPS攝入量約為5 mg·(kg·d)-1，后期按照小鼠體質量及時調整BPS 的加入量。同時，對照組的飲用水（100 mL）中加入50 μL乙醇。給藥組小鼠除攝入含有BPS 的飲用水外，每天灌胃80 mg/kg DHA-PC。連續喂養10周，記錄小鼠每天的飲水量和食物攝入量，根據能量攝入量=食物攝入量×飼料含能量得出數據。末次處理后，小鼠禁食（不禁水）24 h，稱其質量并記錄，用體積分數10%水合氯醛麻醉后對小鼠進行眼球取血并進行解剖，完整取出肝臟、附睪脂肪并稱其質量。完整摘除肝臟并保存于-80 ℃冰箱用于后續的生化檢測和病理實驗。臟器指數=器官質量/體質量。

1.3.2 肝功能指標測定 稱取0.1 g的小鼠肝臟，加入0.9 mL質量分數0.9%的生理鹽水，用手持均質儀均質，即得質量分數10%的肝組織勻漿液。肝勻漿中的AST和ALT含量按照試劑盒中的說明進行測定。

1.3.3 肝臟組織病理學分析 將肝臟組織修剪至1 cm×1 cm 大小，置于質量分數4%的多聚甲醛中固定24 h。之后進行脫水、包埋及切片。按照試劑盒說明書進行H&E 染色，并在光學顯微鏡CX31 下拍攝觀察切片染色狀況。

1.3.4 肝臟組織炎癥因子、脂質、抗氧化指標等含量測定 按照1.2.2節方法制備質量分數10%的肝臟組織勻漿液。肝勻漿中的IL-6、IL-1β、TNF-α 水平及TC、TG、NEFA、T-AOC、CAT、GSH-Px、SOD 活性和MDA濃度均按照對應的試劑盒說明書進行測定。

1.3.5 數據處理 每個指標平行測定三次。數據采用Origin 2021 和IMB SPSS statistics 27.0 軟件進行統計分析，結果以均數±標準差表示。采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD事后檢驗分析組間差異，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 小鼠體質量、臟器指數、附睪脂肪指數、食物和能量攝入量變化

各組小鼠體質量變化趨勢如圖1(A)所示。實驗初始，各組小鼠平均體質量為（19.38±0.86）g，各組間無明顯差異（P＞0.05）。在第4 周，體質量開始出現顯著變化。第10 周結束，BPS 組小鼠最終平均體質量（27.55±0.14）g 比CON 組（25.77±0.22）g 高6.91%（P＜0.05）。而經DHA-PC 處理后，DHA-PC組小鼠最終平均體質量（27.07 ± 0.16）g，比BPS 組降低了1.74%（P＜0.05）。

圖1 不同處理對小鼠體質量、臟器指數、附睪脂肪指數、食物和能量攝入量的影響Fig.1 Effects of different treatments on mice body mass,organs index,epididymal fat index,food intake,and calorie intake

臟器指數可初步反映藥物對器官所造成的影響，其值的升高能夠間接體現組織的異常改變[14]。經BPS 處理后（圖1(C)），BPS 組小鼠肝臟指數明顯高于CON 組（P＜0.05），而給藥組小鼠肝臟指數與BPS 組相比，顯著降低了6.76%（P＜0.05）。此外，與CON 組相比，BPS 組小鼠附睪脂肪指數增加了30.91%（P＜0.05），而給藥組小鼠較BPS 組減少了19.44%（P＜0.05）（圖1(D)）。這表明BPS 會導致小鼠肝臟的損傷，DHA-PC則能逆轉這一趨勢。

圖1(E、F)可知，各組小鼠的食物和能量攝入量無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 DHA-PC對BPS誘導小鼠肝功能指標的影響

AST 和ALT 是肝組織損傷的一個重要指標，通常肝細胞受損后AST 和ALT 含量會急劇升高[15]。如圖2 所示，BPS 導致小鼠肝臟AST 和ALT 活性顯著升高（P＜0.05），這表明BPS的攝入會引起小鼠的肝功能異常。經DHA-PC 處理后，與模型組相比，給藥組小鼠AST 活性[（137.19 ± 9.06）vs（191.76 ±6.79）U/g]和ALT 活性[（135.62 ± 2.78）vs（146.53 ±1.71）U/g]則顯著降低（P＜0.05），這表明DHA-PC可改善BPS誘導的小鼠肝功能損傷。

圖2 不同處理對小鼠肝臟谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶水平的影響Fig.2 Effects of different treatments on ALT and AST levels of murine liver

2.3 DHA-PC對BPS誘導小鼠肝臟組織病理學的影響

H&E 染色結果（圖3）顯示，DHA-PC 對于BPS引起的肝臟損傷有一定的修復作用。對照組小鼠的肝小葉結構清晰，肝索呈放射狀，未發現實驗飼喂乙醇劑量對小鼠的肝臟造成明顯損傷。與CON組相比，BPS 組小鼠的肝小葉結構被破壞，肝索消失，無明顯中央靜脈，可見偌大空泡，顯示肝臟發生局灶性脂肪病變。經DHA-PC 處理后，小鼠的肝小葉結構清晰，肝索結構為放射狀，顯示DHA-PC 對BPS導致的肝臟損傷具有一定的改善作用。

圖3 不同處理對小鼠肝臟組織結構的影響Fig.3 Effects of different treatments on murine liver histopathology

2.4 DHA-PC對BPS誘導小鼠炎癥因子水平的影響

如圖4 所示，與對照組相比，BPS 暴露導致小鼠肝臟組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 質量濃度的顯著升高（P＜0.05），提示BPS 可引起小鼠的肝臟炎癥。在經DHA-PC 處理后，與BPS 組相比，IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.05），與CON 組相比，IL-1β 和TNF-α 含量降低，但無顯著差異（P＞0.05）。該結果表明，DHA-PC 可通過抑制炎癥反應來改善BPS誘導的小鼠肝損傷。

圖4 不同處理對小鼠肝臟組織中炎癥因子（白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α）含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on inflammatory factors(IL-1β,IL-6,TNF-α)of liver in mice

2.5 DHA-PC對BPS誘導小鼠脂質水平的影響

TG、TC 和NEFA 是脂質水平紊亂的常見生物標志物[14]。如圖5 所示，與對照組相比，BPS 導致小鼠肝臟TG、TC、NEFA 和LDL-C 質量摩爾濃度顯著升高（P＜0.05），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）。在DHA-PC 干預后，與BPS 組相比，給藥組小鼠肝臟TG、TC、NEFA 和LDL-C 水平均有效降低（P＜0.05），而HDL-C 水平顯著升高（P＜0.05）；與CON組相比，TG 質量摩爾濃度顯著降低（P＜0.05），NEFA、LDL-C 質量摩爾濃度未表現出顯著差異（P＞0.05）。該結果表明，DHA-PC 可有效改善BPS導致的小鼠肝臟脂質紊亂。

圖5 不同處理對小鼠肝臟脂質水平的影響Fig.5 Effects of different treatments on lipid levels in mouse liver

2.6 DHA-PC對BPS誘導小鼠氧化應激水平的影響

如圖6 所示，與對照組相比，BPS 組MDA 質量摩爾濃度顯著升高（P＜0.05），CAT、GSH-Px、SOD和T-AOC 活性顯著降低（P＜0.05）。與BPS 組MDA 質量摩爾濃度（2.48 ± 0.02）nmol/mg 相比，DHA-PC 組[（3.28 ± 0.02）nmol/mg]顯著降低（P＜0.05），CAT活性[（9.83±0.13）vs（15.02±1.32）U/mg]、GSH-Px 活性[（265.19 ± 32.48）vs（752.23 ± 30.19）U/mg]、T-AOC 活性[（0.03±0.001）vs（0.06±0.0004）U/mg]和SOD 活 性[（247.22 ± 8.88）vs（277.67 ±1.93）U/mg]活性顯著升高（P＜0.05），且接近正常水平。

圖6 不同處理對小鼠肝臟氧化應激的影響Fig.6 Effects of different treatments on oxidative stress in mice

3 討論

DHA-PC 具有緩解氧化應激損傷、降脂和護肝等生物學功效[9,11]。本研究建立了BPS 誘導的小鼠肝損傷模型并評價DHA-PC 對其的改善作用。有研究表明，慢性暴露于BPS 會增強高脂飲食誘導的肥胖，且能誘導小鼠3T3-L1 前脂肪細胞生成，誘導更高的脂肪積累、上調脂肪生成標志物的基因表達[16]。BPS 暴露導致線粒體含量降低，改變代謝穩態和線粒體的能量代謝，引起顯著的體質量增加[17]，這與本研究結果一致。在本研究中，DHA-PC 可降低BPS 引起的肝臟指數升高、附睪脂肪指數升高，且能維持小鼠體質量穩定。經5 mg·(kg·d)-1BPS處理10周后，BPS組小鼠的AST和ALT活性顯著高于CON 組，提示BPS導致小鼠肝功能損傷。肝臟組織病理學結果也進一步證實5 mg·(kg·d)-1BPS處理后會導致小鼠肝臟形態缺陷，并伴有肝細胞局灶脂肪病變。而經DHA-PC 處理后，AST 和ALT 活性較模型組顯著下降，表明DHA-PC 可有效改善BPS 誘導的小鼠肝損傷。

肝臟是脂質代謝的重要器官，故脂質水平相關指標（如TC、TG、NEFA 等）異常升高常見于各種肝臟疾病[18,19]。經BPS 處理后，BPS 組小鼠肝臟組織中的TC、TG、NEFA 和LDL-C 水平較CON 組顯著增加。LDL-C 作為TC 的主要載體，故LDL-C 水平的升高也會直接導致TC水平的升高[20]，這說明BPS暴露造成小鼠肝臟中TC、TG、NEFA 和LDL-C 水平的積累，導致小鼠肝臟脂質代謝的紊亂，肝臟損傷[21]，這與Zeng 等[22]的結論一致。Higuchi[23]等發現，鯡魚魚籽中的脂質（包括DHA和EPA）可以顯著降低血清中TC、TG、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平。有研究表明，BPS 會通過刺激雄性斑馬魚（Danio rerio）肝臟的β-氧化來增加三酰甘油（TAG）的水平，TAG水平的升高會增加脂質積累[24]。n-3多不飽和脂肪酸（PUFA）通過降低肝臟脂肪生成酶的表達來減少嚙齒類動物肝臟中的TAG 合成[25]。在本研究中，小鼠經DHA-PC 處理后，其肝臟組織中的TC、TG、NEFA、HDL-C 和LDL-C 水平明顯降低，這表明DHA-PC 能顯著改善BPS 導致的小鼠肝臟脂質代謝紊亂。

多項研究表明，肝損傷與氧化應激和抗氧化防御系統的平衡有關[26]。BPS 會影響氧化-抗氧化平衡，誘導ROS 的產生，從而導致臟器毒性[27]。此外，脂質過氧化可激活過氧化氫生成，產生MDA等有毒化學物質，是氧化損傷的敏感指標。過量的MDA可引起細胞膜遷移性和通透性的改變，最終導致細胞結構和功能的破壞[28]。而SOD、CAT、GSH-Px 在ROS 代謝途徑的不同位點協同抑制自由基的產生，防止氧化損傷[29]。在本研究中，經5 mg·(kg·d)-1BPS連續處理10 周后，小鼠肝臟組織中的MDA 含量顯著升高，T-AOC、SOD、CAT 和GSH-Px 活性降低，表明小鼠的抗氧化防御系統受損，氧化-抗氧化平衡被打破，脂質過氧化增加。而DHA-PC 處理可顯著增加SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC 活性，降低MDA 含量，表明DHA-PC 可通過緩解氧化應激水平來改善BPS導致的小鼠肝臟毒性。

氧化應激導致生物分子的氧化損傷，引起機體內源性損傷相關分子模式產生和細胞因子釋放[30]。而細胞因子能激活模式識別受體下游的信號通路，如NF-κB、JAK 和MAPK 等，導致細胞因子和趨化因子釋放增加，招募和激活更多的炎性細胞，引起機體系統性的慢性炎癥反應[31]。在本研究中，經5 mg·(kg·d)-1BPS 連續處理10 周后，小鼠肝臟組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著的升高。在經DHA-PC 處理后，IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均顯著降低，表明DHA-PC 可通過抑制炎癥反應來改善BPS誘導的小鼠肝損傷。但本研究未對其分子作用機制進行深入研究，后續可通過轉錄組學、代謝組學和腸道菌群等對DHA-PC 改善BPS 導致小鼠肝損傷的作用機制進行深入研究。

4 結論

本研究結果表明，鯡魚魚籽源DHA-PC 干預可顯著小鼠肝組織病理情況，顯著降低小鼠平均體質量、肝臟指數和附睪脂肪指數，對食物攝入量和能量攝入量無影響，顯著降低肝功能指標（ALT、AST）、炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、脂質（TC、TG、NEFA、LDL-C）相關因子水平和MDA 含量，顯著提高HDL-C、T-AOC、SOD、GSH-Px 和CAT 含量（α=0.05），說明DHA-PC 可抑制炎癥、改善脂質代謝紊亂和氧化應激來改善BPS 導致的小鼠肝損傷。本研究結果將提供一種潛在的改善BPS 導致的肝損傷策略，同時也為緩解其他環境污染物導致的相關毒性提供借鑒意義。