巨桉擴展蛋白EgrEXPA8 和EgrEXPA10 基因的克隆和表達特性分析

羅萍, 王曉萍, 張昊楠,2, 范春節, 王玉嬌, 徐建民*

(1. 中國林業科學研究院熱帶林業研究所，國家林業和草原局熱帶林木培育重點實驗室，廣州 510520；2. 東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

擴展蛋白(expansin, EXP)是植物中重要的蛋白之一，最早在黃瓜(Cucumissativus)的根尖細胞壁中被發現[1]，是一類能夠使植物細胞壁松弛的活性蛋白，在植物生長發育和逆境抗性過程中發揮著重要的作用[2]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和毛果楊(Populustrichocarpa)中各有36 個EXP 成員[3–4]，葡萄(Vitisvinifera)中有29 個[5]，水稻(Oryzasativa)中有58 個[3]。根據結構的差異，擴展蛋白可分為4 個亞家族，分別為擴展蛋白A、B 亞家族(EXPA、EXPB)和類擴展蛋白A、B 亞家族(EXLA、EXLB)[6]。其中EXPA 主要參與植物的根毛發生與伸長[7]、種子萌發[8–9]、果實軟化[10–11]、木質部的形成[12]、纖維發育[13]、莖和節間的伸長[14]、葉片發育[15]等重要發育過程，同時也參與響應植物非生物脅迫的過程,如耐鹽性[16]、抗旱性[17]、抗重金屬[18]等；EXPB 則主要參與花粉管伸長[19–22]等。

桉樹(Eucalyptus)是世界三大速生樹種之一，具有生長速度快、輪伐周期短、適應性強以及木材質量較好等優點，廣泛應用于制漿造紙、木材加工、醫療和香料等產業，因此具有十分重要的經濟價值以及生態價值[23]。其大量優良基因的功能尚待挖掘，巨桉(E.grandis)基因組測序的完成為開展相關研究提供了基礎[24]，目前在巨桉中共發現35 個EXP 家族成員[25]，其中EXPA 亞家族成員24 個，但其在桉樹生長發育或者響應脅迫中的具體功能尚未見報道。

前期對桉樹不同節間進行轉錄組測序，在初生生長到次生生長的轉換過程中EgrEXPA8和EgrEXPA10存在差異表達，尤其是在次生生長階段表達量顯著下降，說明其可能參與到桉樹的次生生長或者木質部發育的負調控。本研究以巨桉無性系GL1 為材料,克隆了2 個擴展蛋白基因EgrEXPA8和EgrEXPA10，對其基因結構及編碼的蛋白結構和理化性質等進行了分析，采用qRT-PCR 技術分析它們的組織表達模式及對不同脅迫的響應，并初步對EgrEXPA8和EgrEXPA10基因功能進行分析，為其功能挖掘和分子調控機制研究提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

使用巨桉(Eucalyptusgrandis)無性系GL1 組培苗為材料，選取生長健壯的生根苗移植到中國林業科學研究院熱帶林業研究所溫室培養，6 個月后苗木生長至約1.5 m，分別取根、莖尖、木質部、韌皮部、幼葉、成熟葉，同時選取從頂端起第1、3、5、7、9、11 節間作為初生生長到次生生長轉換的材料。

生根的組培苗移植至溫室后，經改良霍格蘭營養液水培生長至約20 cm 高，選取生長健壯、根系良好的水培苗，分別用0.1 mmol/L 茉莉酸甲酯(MeJA)、0.1 mmol/L 水楊酸(SA)進行噴施、200 mmol/L NaCl溶液灌根，并在處理后0、1、6、24 和168 h 收集葉片。將水培苗轉移至去除磷(磷酸二氫鉀)或硼元素(硼酸)的改良霍格蘭營養液中培養，分別在6、24、48、96 和21 d 后收集葉片。每處理5 株苗，每處理3 個重復，取樣統一采集頂端向下第4～6 片葉片。所有樣品采集后迅速置于液氮中速凍，隨后立即轉入超低溫冰箱-80 ℃保存，用于RNA 提取。

1.2 菌株與質粒

克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector 購于全式金生物技術(北京)有限公司，DH5α大腸桿菌感受態細胞購自擎科生物科技(北京)有限公司，植物RNA 提取試劑盒購于艾德萊生物科技(北京)有限公司，DNA 回收試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，反轉錄試劑購于美國英杰生命技術有限公司(Invitrogen)，熒光定量PCR 試劑TB Green?Premix Ex TaqTM 購于大連寶日醫生物技術有限公司(TaKaRa)。

1.3 RNA 的提取與cDNA 的合成

按照Aidlab EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的說明書進行RNA 提取，然后經過DNase I 消化基因組DNA，得到純化的總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳以及NanoDrop one (購于美國賽默飛世爾科技公司)檢測RNA 質量和濃度，分別取1μg 檢測合格的總RNA，采用SuperscriptIII 反轉錄試劑盒進行cDNA 合成。

1.4 基因克隆與測序

從Phytozome 13 (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)數據庫中分別下載EgrEXPA8和EgrEXPA10基因序列。利用Primer 5.0 軟件設計巨桉EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的特異性克隆引物(表1)，由擎科生物科技(北京)有限公司合成。以稀釋10 倍的cDNA 為模板，采用Q5 High-Fidelity PCR Kit (NEB)進行PCR 反應，采用20μL 反應體系，反應程序為：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，68 ℃/70 ℃(EgrEXPA8/EgrEXPA10)退火20 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環；72 ℃延伸2 min。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，并使用天根(北京)膠回收試劑盒回收位置正確且條帶明亮的產物，隨后連接到pEASY?-T1CloningKit 載體上并轉入DH5α感受態細胞，在抗性平板上挑取平滑的菌落搖菌進行菌液PCR 驗證，選取正確的樣本菌液送睿博興科生物技術(北京)有限公司進行測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 生物信息學分析

利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列的理化性質，包括理論等電點、氨基酸長度以及蛋白分子量等；利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線工具分析蛋白質的疏水性和親水性；利用SOPMA (https://npsapra bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.exp asy.org/interactive)在線工具進行蛋白質二級結構和三級結構分析；利用NCBI 的Conserved domains database (CDD)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stru cture/cdd/wrpsb.cgi)對蛋白進行結構域預測；在擬南芥信息數據庫(https://www.Arabidopsis.org/index.jsp)中檢索并下載了所有EXPA 蛋白的氨基酸序列，利用Clustal 程序對桉樹擴展蛋白EgrEXPA8、EgrEXPA10與擬南芥擴展蛋白EXPA 亞家族所有成員進行多序列比對分析，使用MEGA 6.0 軟件，采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構建系統進化樹；同時利用NCBI BlASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線查找在擬南芥、楊樹、水稻、葡萄、大豆(Glycinemax)和黃瓜中的同源序列，并通過PFAM和SMART 對不同植物的同源序列進行驗證，下載各成員的蛋白序列，并利用DNAMAN 軟件進行蛋白質同源序列分析，利用MEGA 6.0 內置的Clustal W 程序進行多重序列比對，并采用鄰接法構建系統進化樹。

1.6 EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的差異表達分析

將巨桉RNA 樣品進行反轉錄，以稀釋10 倍的cDNA 樣品為模板，根據克隆的EgrEXPA8和Egr-EXPA10測序結果，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計特異性定量引物，由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)，以EgrEF2為內參基因。使用Roche公司的Light Cycler 96 熒光定量分析儀以及大連寶日醫生物技術有限公司(TaKaRa)的SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒。實時定量PCR 的反應體系為20μL，包括1μL cDNA、10μL SYBR Green Ⅰ Master、10μmol/L 的正反向引物各0.8 和7.4μL，用ddH2O 補足。反應程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40 個循環。溶解曲線分析程序采用95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品3 次生物學重復以及3 次技術重復，根據2–ΔΔCT 法[26]計算目的基因的相對表達量。

1.7 數據統計分析

采用SPSS22 分析軟件對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較(P=0.05),然后利用GraphPad Prism 8 進行制圖。

2 結果和分析

2.1 EgrEXPA8 和EgrEXPA10 基因克隆

提取巨桉葉片的RNA，反轉錄為cDNA，以此為模板，根據擴展蛋白基因Eucgr.J00120.1 和Eucgr.I01954.1 序列設計引物(表1)，進行PCR 擴增，克隆目的基因。擴增產物經電泳檢測，2 個擴展蛋白片段長度均約為750 bp (圖1)。回收目的片段，連接到T 載體上并進行測序，其長度分別為750 和735 bp，編碼249 和244 個氨基酸，命名為EgrEXPA8(Eucgr.J00120.1)和EgrEXPA10(Eucgr.I01954.1)。

圖1 巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 基因的PCR 擴增電泳圖。M: DL 2000 DNA Marker; 1: EgrEXPA10; 2: EgrEXPA8。Fig. 1 PCR amplification of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 gene in Eucalyptus grandis. M: DL 2000 DNA Marker; 1: EgrEXPA10; 2: EgrEXPA8.

2.2 EgrEXPA8和EgrEXPA10蛋白的理化性質分析

采用ProtParam 對EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白理化性質進行分析。EgrEXPA8 蛋白的理論分子量為26.52 kD，等電點(pI)為7.53，脂溶性指數為61.20。EgrEXPA10 蛋白的理論分子量與EgrEXPA8 近似，為26.29 kD，等電點為9.1，脂溶性指數為69.10。此外，EgrEXPA8 蛋白不穩定性指數為31.20，而EgrEXPA10達40.32，表明其穩定性低于EgrEXPA8。這也表明這2 個蛋白可能具有不同的功能。

ProtScale 預測巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白為親水性蛋白。SOPMA 和SWISS-MODEL 工具同源建模法預測表明，EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白的二級和三級結構主要以延伸鏈和無規卷曲為主(圖2)。結構域預測表明EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白均含有2 個保守結構域DPBB_1 和Pollen_allerg_1。

圖2 巨桉EgrEXPA8 (A, C)和EgrEXPA10 (B, D)的二級(A, B)和三級(C, D)結構模型Fig. 2 Secondary (A, B) and tertiary (C, D) structures model of EgrEXPA8 (A, C) and EgrEXPA10 (B, D) of Eucalyptus grandis

2.3 同源分析和系統進化分析

根據Sampedro 等[27]的分類方法，27 個EXPA蛋白可分為10 個類群，EgrEXPA10 屬于第I 類群，與擬南芥的AtEXPA5 親緣關系最近，EgrEXPA8 屬于第III 類群，與擬南芥的AtEXPA8 親緣關系最近(圖3: A)。同源序列分析表明，EgrEXPA8 與其他植物擴展蛋白的同源性為73.83%～82.81%，其中與葡萄VvEXPA8 的同源性最高。從構建的進化樹可見，巨桉EgrEXPA8 與葡萄、大豆、楊樹、擬南芥聚在同一支上(圖3: B)，親緣關系較近。EgrEXPA10 與其他植物擴展蛋白的同源性為67.43%～82.38%，與葡萄VvEXPA10 的同源性最高，巨桉EgrEXPA10與黃瓜CsEXPA5 的親緣關系最近，且與葡萄、大豆、楊樹、擬南芥聚在同一支上(圖3: C)。

圖3 系統進化樹。A: EgrEXPA8、EgrEXPA10 和擬南芥α-expansins; B: EgrEXPA8 與其他植物α-expansins; C: EgrEXPA10 與其他植物α-expansins; Egr:巨桉; Pt: 毛果楊; Gm: 大豆; Vv: 葡萄; At: 擬南芥; Os: 水稻; Cs: 黃瓜。Fig. 3 Phylogenetic tree. A: EgrEXPA8 and EgrEXPA10 with α-expansins in Arabidopsis thaliana; B: EgrEXPA8 and α-expansins in other plants; C:EgrEXPA10 and α-expansins in other plants. Egr: Eucalyptus grandis; Pt: Populus trichocarpa; Vv: Vitis vinifera; At: Arabidopsis thaliana; Os: Oryza sativa;Cs: Cucumis sativus.

2.4 EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達模式

利用實時熒光定量PCR 技術檢測EgrEXPA8和EgrEXPA10在不同組織和不同節間的表達模式。結果表明，EgrEXPA8和EgrEXPA10在根、莖尖、木質部、韌皮部、幼葉、成熟葉中呈現相似的表達特征，均在幼葉和莖尖表達量最高，而在木質部和韌皮部中相對較低(圖4: A)。EgrEXPA8和EgrEXPA10均在莖的9 和11 節間的表達量顯著降低，說明Egr-EXPA8和EgrEXPA10可能參與桉樹初生生長階段細胞壁的維持，也可能參與桉樹負調控次生生長。同時，EgrEXPA8和EgrEXPA10在莖節間的表達略微不同,隨著節間的次生發育越來越成熟,EgrEXPA8均被抑制表達，EgrEXPA10在中間節間上調表達，而在未木質化或者木質化程度較高的兩端節間被抑制表達，其中在莖的節間7 表達量最高(圖4: B)。

圖4 巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達模式。R: 根; A: 莖尖; XY: 木質部; P: 韌皮部; YL: 幼葉; ML: 成熟葉。Fig. 4 Expression patterns of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 in Eucalyptus grandis. R: Root; A: Apical; XY: Xylem; P: Phloem; YL: Young leaf; ML: Mature leaf.

EgrEXPA8能快速響應鹽脅迫，鹽處理1 h 的表達量急劇下降，隨處理時間的延長，表達量繼續下降。EgrEXPA10的表達量在鹽處理后也呈下降的趨勢，與EgrEXPA8不同的是，其在處理6 h 才出現顯著降低，處理168 h 的表達量呈上升趨勢(圖5: A)。EgrEXP8和EgrEXPA10的表達對茉莉酸甲酯表現出相似的響應方式，均被抑制表達(圖5: B)。在水楊酸處理下，EgrEXPA8和EgrEXPA10的表達呈現出不同的趨勢，EgrEXPA8的表達量迅速顯著提高, 且長期噴施處理仍保持著較高水平,EgrEXPA10只在處理168 h時比對照顯著提高(圖5: C)。長期缺硼條件下,Egr-EXPA8和EgrEXPA10的表達量均顯著提高，均在處理504 h 后達最高，EgrEXPA8在處理48 h 內均被抑制表達，而EgrEXPA10在處理24 h 后逐漸上調表達(圖6: A)。缺磷條件下，EgrEXPA8的表達量呈下降-升高-下降的趨勢，在處理48 h后達到峰值, 約為對照的1.6 倍；EgrEXPA10的表達量在處理24 h后顯著提高，且在處理48 h 后達到峰值，約為對照的8～9 倍，隨后其表達量有所下調，但仍比對照提高(圖6: B)。

圖5 不同脅迫下巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達模式Fig. 5 Expression patterns of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 in Eucalyptus grandis under different stresses

圖6 缺硼和缺磷下巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達模式Fig. 6 Expression patterns of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 in Eucalyptus grandis under boron and phosphorus deficiency

這表明巨桉在不同的脅迫和激素處理下，Egr-EXPA8和EgrEXPA10的調控途徑及調控機制存在差異性，同時也說明EgrEXPA8和EgrEXPA10在巨桉響應逆境脅迫中具有重要的調控作用。

3 結論和討論

擴展蛋白是植物細胞壁的重要組成部分，主要參與細胞擴張以及一系列發生細胞壁修飾的發育過程以及植物抗病的重要生理過程[28]。本研究通過轉錄組數據篩選得到2 個在莖不同節間差異表達的基因，并克隆得到cDNA 序列，利用生物信息學分析發現這2 個基因均含有DPBB_1 結構域和Pollen_allerg_1 結構域，均為擴展蛋白基因且屬于EXPA 亞家族成員。采用qRT-PCR 技術分析EgrEXPA8和Egr-EXPA10基因在不同組織部位、不同節間以及不同脅迫條件下的表達模式，以期初步探索它們在桉樹生長調控、逆境脅迫過程中的作用。

由于植物擴展蛋白以酶的催化方式使細胞壁組分松弛、細胞伸展，因此不同的擴展蛋白基因在植物體內的發育階段具有不同的表達模式，且與細胞生長和組織分化一致[29]。qRT-PCR 結果表明,Egr-EXPA8和EgrEXPA10基因均在分生組織或者細胞分裂旺盛的部位如嫩葉和莖尖中表達量較高，推測其主要在細胞分裂中起重要作用。另外,EgrEXPA8和Egr-EXPA10在莖尖和初生生長占主要作用的上部節間表達量較高，而在次生生長占主導的下部節間表達量急劇降低，推斷其可能主要調控初生生長或者負調控次生生長，這與前期轉錄組的表達趨勢一致。已有研究表明外源噴施油菜素內酯(brassinosteroid, BR)可以提高擬南芥AtEXPA5的表達，且在det2-1和bri1-301突變體中AtEXPA5的表達量減少, 而在bzr1-1D功能獲得型突變體中表達量增強[30]。近期研究表明BR 在木本植物次生生長過程中主要通過促進纖維細胞的增加和減少木質素，同時促進木質部細胞的膨大起作用[31–33]。這表明EgrEXPA8和EgrEXPA10可能參與了BR 調控次生木質部發育過程。通過構建Egr-EXPA8和EgrEXPA10表達載體，以探索其在桉樹生長調控中的作用尤其是木材形成中的作用。

植物生長調節劑(如水楊酸等)是生物脅迫及非生物脅迫反應的重要信號分子，能誘導植物產生持續抗性，從而減緩植物對多種逆境脅迫的傷害。本研究結果表明，EgrEXPA8和EgrEXPA10基因對鹽脅迫、水楊酸與茉莉酸甲酯、缺磷、缺硼等逆境的響應方式類似，推測同一亞家族的擴展蛋白對相同脅迫或植物激素可能有相似的響應模式。在鹽處理下，巨桉葉片內EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的表達量均顯著降低，這與地黃(Rehmanniaglutinosa)擴展蛋白基因RgEXPA10的表達趨勢一致[34]。小麥(Triticumaestivum)擴展蛋白TaEXPB23在茉莉酸甲酯處理后的mRNA 水平提高[35]，而本研究中Egr-EXPA8和EgrEXPA10基因表達在茉莉酸甲酯處理下均被抑制，可能是由于EgrEXPA8和EgrEXPA10基因與TaEXPB23為不同的亞家族，其響應方式不同, 也可能是由于物種不同的原因。硼高效品種甘藍型油菜(Brassicanapus)在缺硼脅迫下根系中的BnaEXPA6、幼葉中的BnaEXPA5及老葉中的BnaEXPA3、Bna-EXPA5、BnaEXPA8和BnaEXPA16基因的表達水平均顯著高于硼低效品種[36]。巨桉EgrEXPA8和EgrEXPA10基因在長期缺硼脅迫下均顯著上調，且EgrEXPA10較EgrEXPA8響應更迅速，說明這2 個擴展蛋白可能在桉樹缺硼脅迫中發揮著重要作用,為將來研究桉樹中硼響應的機制研究奠定基礎。

本研究從巨桉中克隆了2 個擴展蛋白基因Egr-EXPA8和EgrEXPA10，可能參與桉樹初生細胞壁的維持及次生生長，在鹽脅迫、茉莉酸甲酯處理下均被抑制表達，在水楊酸處理、缺硼、缺磷處理下均被上調表達，在非生物脅迫響應中起調控作用。