光果金櫻子三萜類化合物的分離鑒定與抗SARSCoV-2 活性評價

敖卓儀, 關曉嫻, 吳杰偉

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006)

金櫻子(Rosalaevigata)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬植物，廣泛分布于江蘇、湖南、廣東、廣西等地[1]。目前從薔薇屬植物中分離得到的化學成分主要有黃酮類、三萜類、鞣質等, 其中黃酮類與三萜類化合物是該屬植物的主要活性成分[2]。金櫻子是我國較常用的中藥，《本草綱目》記載 “性酸、澀、平、無毒；主治脾瀉下痢、止小便利、澀精氣, 久服, 令人耐寒輕身, 補血益精, 有奇效”[3]。光果金櫻子(R.laevigatavar.leiocapus)是金櫻子變種，其性狀、顯色特征、多糖含量相似，但光果金櫻子的葉稍薄, 果光滑無刺[4–5]，如能作為金櫻子的來源,在采收加工時無需去刺，可以提高生產效率，節省人工成本，發展前景十分廣闊。

本課題對光果金櫻子的三萜類化學成分進行研究，分離出15 個三萜化合物，用增強型2019-nCoV Mpro/3CLpro抑制劑篩選試劑盒對化合物抑制嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)活性進行評價，為后續光果金櫻子化學成分的提取分離及新的抗SARS-CoV-2 藥物的開發研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

Bruker AV-400 MHz 核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；Waters 2695 LC 偶聯Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS 液質聯用儀；XHRE-2000A 旋轉蒸發儀(上海霄漢實業發展公司)；Agilent 1100 制備型高效液相(美國安捷倫公司)；Waters Sunfire?RP C18 制備型色譜柱(5μm, 30 mm×150 mm)；多功能酶標儀(PerkinElmer 公司)；柱層析硅膠：200～300 和300～400 目(青島海洋化工有限公司)；葡聚糖凝膠LH-20 (美國Pharmacia 公司)；實驗所用有機試劑均屬分析純級別。

植物材料于2020 年11 月采自廣東省河源市紫金縣龍窩鎮，由廣州中醫藥大學中藥學院吳杰偉副研究員鑒定為薔薇屬植物光果金櫻子(Rosalaevigatavar.leiocapus)的果實。

1.2 提取和分離

光果金櫻子果實15 kg，陰干，切碎，用95%乙醇常溫滲濾提取3 次(每次7 d)，過濾后合并3 次滲濾液，減壓濃縮得到總提取物浸膏。后將獲得的總浸膏首先用純凈水懸浮，乙酸乙酯連續萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯部位浸膏(130.6 g)。首先，乙酸乙酯部位浸膏使用硅膠柱層析進行處理，石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑，進行梯度洗脫(10/1～2/1,V/V)，并利用TLC 檢測合并得到組分Fr.1 (4.5 g)、Fr.2 (15.4 g)、Fr.3 (7.9 g)、Fr.4 (10.4 g)和Fr.5 (3.3 g)。Fr.2 經Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離(甲醇作洗脫劑)，分別得到4 個亞組分Fr. 2A～Fr. 2D。組分Fr. 2B 經制備型HPLC 純化，以乙腈/水為流動相，流速20 mL/min，制得化合物2 (23.2 mg)、10 (19.1 mg)和15 (7.5 mg)。Fr. 2C 經制備型高效液相(乙腈-水=5:95～50:95，20 mL/min，0～120 min)純化，分別得到化合物3 (22.4 mg)、6 (2.4 mg)和7(6.4 mg)。Fr. 3 經硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷/甲醇[50/1～10/1,V/V]梯度洗脫，進一步經Sephadex LH-20、制備HPLC 純化，分離得到化合物11 (14.2 mg)、14 (4.5 mg)和9 (8.6 mg)。其余洗脫組分再經制備HPLC 純化，以乙腈-水為流動相，流速20 mL/min，制得化合物13 (21.3 mg) 和12 (9.5 mg)。Fr. 4 通過反復硅膠柱層析和C18柱制備得到化合物1 (8.4 mg)、4 (9.6 mg)、5 (18.7 mg)和8 (10.8 mg)。

1.3 結構鑒定

本研究從光果金櫻子的果實中分離得到15 個三萜類化合物(圖1)，包括6 個齊墩果烷型三萜(化合物2、4、5、6、11、15)、7 個烏蘇烷型三萜(化合物3、7、9、10、12、13、14)、2 個羽扇豆烷型三萜(化合物1、8)，其中化合物1 為裂環羽扇豆烷型，化合物12 為烏蘇烷型降三萜。

圖1 三萜化合物1～15 的化學結構式Fig. 1 Structures of triterpenes 1–15

化合物1無色針晶; 分子式C30H48O4, ESIMSm/z: 473 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH2.09 (1H, dd,J= 15.0, 10.0 Hz, H-1a), 1.35 (1H,dd,J= 15.0, 10.0 Hz, H-1b), 0.93 (1H, m, H-5), 0.81(3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-24), 1.05 (6H, overlapped, H-25/H-26), 1.00 (3H, s, H-27), 4.57 (1H, s,H-29a), 4.68 (1H, s, H-29b), 1.67 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC45.9 (C-1), 94.9 (C-2),71.6 (C-3), 39.9 (C-4), 61.7 (C-5), 21.8 (C-6), 35.6(C-7), 42.6 (C-8), 49.0 (C-9), 42.0 (C-10), 23.6 (C-11),27.4 (C-12), 39.9 (C-13), 43.9 (C-14), 30.7 (C-15),33.4 (C-16), 57.6 (C-17), 50.3 (C-18), 48.7 (C-19),151.9 (C-20), 31.7 (C-21), 38.2 (C-22), 28.3 (C-23),21.4 (C-24), 15.0 (C-25), 17.6 (C-26), 14.9 (C-27),180.5 (C-28), 110.2 (C-29), 19.6 (C-30)。以上數據與文獻[6]報道一致, 故鑒定為laevigaterpene A。

化合物2白色粉末; 分子式C30H48O5, ESIMSm/z: 487 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.88 (1H, m, H-2), 3.41 (1H, m, H-3), 5.26 (1H, t,J=3.2 Hz, H-12), 3.40 (1H, d,J= 10.8 Hz, H-23a), 3.53(1H, d,J= 10.8 Hz, H-23b), 0.79 (3H, s, H-24), 1.02(3H, s, H-25), 0.82 (3H, s, H-26), 1.19 (3H, s, H-27),0.91 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-30);13C NMR(100 MHz, CD3OD):δC47.2 (C-1), 67.2 (C-2), 78.7(C-3), 40.6 (C-4), 49.9 (C-5), 19.0 (C-6), 33.8 (C-7),42.0 (C-8), 44.2 (C-9), 39.2 (C-10), 24.0 (C-11), 123.5(C-12), 145.3 (C-13), 42.7 (C-14), 28.7 (C-15), 24.6(C-16), 47.6 (C-17), 43.0 (C-18), 42.5 (C-19), 31.6(C-20), 34.9 (C-21), 33.5 (C-22), 71.3 (C-23), 17.8(C-24), 17.3 (C-25), 17.6 (C-26), 26.5 (C-27), 181.9(C-28), 33.6 (C-29), 24.0 (C-30)。以上數據與文獻[7]報道一致，故鑒定為2α,23-二羥基齊墩果酸。

化合物3白色粉末; 分子式C30H48O6, ESIMSm/z: 527 [M + Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD):δH3.41 (1H, d,J=3.2 Hz, H-1), 3.64 (1H,dd,J= 9.7, 3.2 Hz, H-2), 3.46 (1H, d,J= 9.7 Hz, H-3),1.48 (1H, m, H-5), 2.17 (1H, m, H-9), 5.29 (1H, m,H-12), 2.49 (1H, s, H-18), 0.97 (3H, s, H-23), 0.88(3H, s, H-24), 1.02 (3H, s, H-25), 0.80 (3H, s, H-26),1.35 (3H, s, H-27), 1.20 (3H, s, H-29), 0.93 (3H, d,J=6.7 Hz, H-30);13C NMR(100 MHz, CD3OD):δC81.3(C-1), 71.8 (C-2), 80.7 (C-3), 41.8 (C-4), 49.1 (C-5),19.4 (C-6), 34.2 (C-7), 43.0 (C-8), 48.9 (C-9), 38.9(C-10), 26.6 (C-11), 130.6 (C-12), 138.8 (C-13), 44.3(C-14), 29.6 (C-15), 29.1 (C-16), 49.0 (C-17), 54.9(C-18), 73.6 (C-19), 42.5 (C-20), 27.3 (C-21), 39.0(C-22), 28.3 (C-23), 22.4 (C-24), 13.0 (C-25), 17.7(C-26), 24.9 (C-27), 182.4 (C-28), 27.1 (C-29), 16.6(C-30)。以上數據與文獻[8]報道一致, 故鑒定為1β-羥基薔薇酸。

化合物4白色粉末; 分子式C39H54O5, ESIMSm/z: 625 [M + Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD):δH1.44 (2H, m, H-1), 1.53 (2H, m, H-2),4.58 (1H, t,J= 7.5 Hz, H-3), 1.14 (2H, m, H-6), 1.23(2H, m, H-7), 5.26 (1H, brs, H-12), 2.80 (1H, dd,J=13.8, 4.6 Hz, H-18), 0.90 (3H, s, H-23), 1.18 (3H, s,H-24), 1.02 (3H, s, H-25), 0.94 (3H, s, H-26), 0.87(3H, s, H-29), 0.82 (3H, s, H-30), 5.85 (1H, d,J=16.0 Hz, H-2′), 6.89 (1H, d,J= 16.0 Hz, H-3′), 7.65(2H, d,J= 7.8 Hz, H-6′, H-8′), 6.74 (2H, d,J= 7.8 Hz,H-5′, H-9′);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC40.4(C-1), 24.1 (C-2), 85.3 (C-3), 39.4 (C-4), 56.5 (C-5),19.4 (C-6), 33.6 (C-7), 40.6 (C-8), 47.7 (C-9), 39.3(C-10), 24.0 (C-11), 123.3 (C-12), 144.8 (C-13), 42.9(C-14), 29.0 (C-15), 24.6 (C-16), 47.3 (C-17), 42.8(C-18), 46.1 (C-19), 31.6 (C-20), 34.9 (C-21), 33.8(C-22), 29.2 (C-23), 17.7 (C-24), 17.0 (C-25), 18.2(C-26), 28.8 (C-27), 177.6 (C-28), 26.4 (C-29), 33.8(C-30), 168.6 (C-1′), 116.8 (C-2′), 145.5 (C-3′), 127.8(C-4′), 133.6 (C-5′/C-9′), 159.8 (C-7′), 115.8 (C-6′/C-8′)。以上數據與文獻[9]報道一致, 故鑒定為3β-(p-hydroxy-trans-cinnamoyloxy)-olean-12-en-28-oicacid。

化合物5白色針晶; 分子式C39H54O6, ESIMSm/z: 617 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.87 (1H, m, H-2), 4.68 (1H, m, H-3), 5.24 (1H, m,H-12), 0.88 (3H, s, H-23), 0.93 (6H, s, H-30/H-24),1.04 (3H, s, H-25), 0.81 (3H, s, H-26), 1.17 (3H, s,H-27), 0.89 (3H, s, H-29), 6.37 (1H, d,J= 16.1 Hz,H-2′), 7.61 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-3′), 7.45 (2H, d,J=8.7 Hz, H-2″, H-6″), 6.80 (2H, d,J= 9.9 Hz, H-3″,H-5″);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC47.2 (C-1/C-17), 67.6 (C-2), 85.6 (C-3), 40.6 (C-4), 56.5 (C-5),19.5 (C-6 ), 31.6 (C-7/C-29), 39.3 (C-8), 47.7 (C-9),34.9 (C-10), 24.0 (C-11/C-30), 123.3 (C-12), 145.4(C-13), 42.7 (C-14), 28.8 (C-15), 24.0 (C-16), 40.6(C-18), 43.0 (C-19), 29.2 (C-20), 33.6 (C-21), 33.8(C-22), 26.4 (C-23), 18.3 (C-24), 17.1 (C-25), 17.7(C-26), 24.6 (C-27), 182.1 (C-28), 169.7 (C-1′), 115.8(C-2′), 146.3 (C-3′), 127.3 (C-1″), 116.9 (C-2″/C-6″),131.1 (C-3″/C-5″), 161.1 (C-4″)。以上數據與文獻[10]報道一致, 故鑒定為3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸。

化合物6白色粉末; 分子式C30H48O4, ESIMSm/z: 473 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.56 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-2), 2.91 (1H, d,J=13.4 Hz, H-3), 5.26 (1H, m, H-12), 1.00 (3H, s, H-23),0.81 (3H, s, H-24), 1.03 (3H, s, H-25), 0.84 (3H, s,H-26), 1.16 (3H, s, H-27), 0.93 (3H, s, H-29), 0.96(3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC34.9(C-1), 67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 40.6 (C-4), 48.2 (C-5),19.0 (C-6), 34.0 (C-7), 39.5 (C-8), 47.3 (C-9), 39.4(C-10), 24.0 (C-11), 122.3 (C-12), 144.2 (C-13), 42.7(C-14), 28.8 (C-15), 24.6 (C-16), 46.1 (C-17), 42.1(C-18), 45.1 (C-19), 33.4 (C-20), 39.2 (C-21), 33.5(C-22), 31.6 (C-23), 22.4 (C-24), 16.6 (C-25), 17.2(C-26), 27.7 (C-27), 183.1 (C-28), 39.0 (C-29), 26.5(C-30)。以上數據與文獻[11]報道一致, 故鑒定為2α,3α-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸。

化合物7白色粉末; 分子式C30H48O4, ESIMSm/z: 471 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.64 (1H, m, H-3), 5.32 (1H, m, H-12), 2.20 (1H,m, H-15), 3.16 (1H, m, H-16), 3.00 (1H, s, H-18), 1.31(3H, s, H-23), 0.94 (3H, s, H-24), 0.81 (3H, s, H-25),0.88 (3H, s, H-26), 1.21 (3H, s, H-27), 1.35 (3H, s, H-29), 1.00 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC40.5 (C-1), 26.6 (C-2), 80.1 (C-3), 39.4 (C-4), 55.1(C-5), 19.3 (C-6), 33.1 (C-7), 42.7 (C-8), 47.9 (C-9),39.1 (C-10), 23.7 (C-11), 130.9 (C-12), 140.1 (C-13),43.1 (C-14), 28.1 (C-15), 26.9 (C-16), 48.1 (C-17),54.0 (C-18), 73.7 (C-19), 41.2 (C-20), 27.1 (C-21),39.5 (C-22), 29.2 (C-23), 16.9 (C-24), 16.6 (C-25),17.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.7 (C-28), 27.3 (C-29),15.5 (C-30)。以上數據與文獻[12]報道一致, 故鑒定為坡模酸。

化合物8白色粉末; 分子式C31H50O3, ESIMSm/z: 469 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.16 (1H, m, H-3), 0.95 (3H, s, H-23), 0.79 (3H, s,H-24), 0.86 (3H, s, H-25), 1.02 (3H, s, H-26), 1.00(3H, s, H-27), 4.73 (1H, s, H-29b), 4.62 (1H, s, H-29a), 1.13 (3H, brs, H-30), 3.66 (3H, s, OCH3);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC39.8 (C-1), 28.8 (C-2),84.4 (C-3), 40.4 (C-4), 57.9 (C-5), 19.5 (C-6), 35.4 (C-7), 41.9 (C-8), 56.8 (C-9), 37.9 (C-10), 22.2 (C-11), 26.8(C-12), 39.5 (C-13), 43.5 (C-14), 31.6 (C-15), 33.1(C-16), 69.7 (C-17), 50.6 (C-18), 40.5 (C-19), 151.8(C-20), 30.8 (C-21), 38.1 (C-22), 29.1 (C-23), 16.6(C-24), 17.2 (C-25), 17.9 (C-26), 16.0 (C-27), 178.2(C-28), 110.3 (C-29), 21.6 (C-30), 51.9 (OCH3)。上述數據與文獻[13]報道一致, 故鑒定為樺木酸甲酯。

化合物9白色粉末; 分子式C30H48O6, ESIMSm/z: 505 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.88 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-2), 5.31 (1H, m, H-12),3.54 (1H, d,J= 11.0 Hz, H-23a), 3.39 (1H, d,J= 11.0 Hz,H-23b), 0.94 (3H, s, H-24), 0.79 (3H, s, H-25), 1.17(3H, s, H-26), 1.32 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-29),0.90 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz,CD3OD):δC42.7 (C-1), 67.2 (C-2), 78.7 (C-3), 43.0(C-4), 44.2 (C-5), 19.1 (C-6), 33.7 (C-7), 41.1 (C-8),48.5 (C-9), 39.1 (C-10), 24.7 (C-11), 129.2 (C-12),140.1 (C-13), 42.5 (C-14), 29.5 (C-15), 26.6 (C-16),48.9 (C-17), 55.0 (C-18), 73.6 (C-19), 42.2 (C-20),27.1 (C-21), 39.0 (C-22), 71.3 (C-23), 17.3 (C-24),17.6 (C-25), 17.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.5 (C-28),27.3 (C-29), 16.6 (C-30)。以上數據與文獻[14]報道一致, 故鑒定為2α,3α,19α,23-四羥基-12-烯-烏蘇酸。

化合物10白色粉末; 分子式C33H52O5, ESIMSm/z: 529 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.95 (1H, dd,J= 12.9, 5.0 Hz, H-11), 5.30 (1H, m,H-12), 1.28 (3H, s, H-23), 0.97 (3H, s, H-25), 1.03(3H, s, H-26), 1.19 (3H, brs, H-27), 0.79 (3H, s, H-28),0.88 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, d,J= 9.0 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC36.0 (C-1), 25.1 (C-2),73.6 (C-3), 45.2 (C-4), 46.7 (C-5), 19.4 (C-6), 34.0(C-7), 43.1 (C-8), 47.8 (C-9), 38.9 (C-10), 77.8 (C-11),124.6 (C-12), 144.7 (C-13), 43.5 (C-14), 27.1 (C-15),27.3 (C-16), 34.2 (C-17), 56.4 (C-18), 39.1 (C-19),39.0 (C-20), 33.6 (C-21), 40.7 (C-22), 26.6 (C-23),182.4 (C-24), 16.6 (C-25), 17.7 (C-26), 24.9 (C-27),28.7 (C-28), 17.4 (C-29), 22.4 (C-30), 172.7 (CO),54.9 (CH3O), 20.8 (CH3CO)。以上數據與文獻[15]報道一致，故鑒定為乙酰基-11α-甲氧基-β-乳香酸。

化合物11白色粉末; 分子式C30H48O5, ESIMSm/z: 489 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.63 (1H, m, H-2), 2.92 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-3),5.33 (1H, m, H-12), 1.01 (3H, s, H-23), 0.94 (3H, s,H-24), 0.82 (3H, s, H-25), 0.77 (3H, s, H-26), 1.30(3H, s, H-27), 1.00 (3H, s, H-29), 0.96 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC48.0 (C-1), 69.5(C-2), 84.5 (C-3), 39.4 (C-4), 56.8 (C-5), 19.7 (C-6),33.9 (C-7), 40.8 (C-8), 49.9 (C-9), 40.5 (C-10), 24.9(C-11), 124.7 (C-12), 144.8 (C-13), 42.6 (C-14), 29.4(C-15), 28.1 (C-16), 46.7 (C-17), 45.2 (C-18), 82.5(C-19), 36.0 (C-20), 29.3 (C-21), 34.1 (C-22), 29.5(C-23), 17.8 (C-24), 16.9 (C-25), 17.4 (C-26), 25.1(C-27), 180.7 (C-28), 28.7 (C-29), 25.1 (C-30)。以上數據與文獻[16]報道一致，故鑒定為阿江欖仁尼酸。

化合物12白色粉末; 分子式C29H48O3, ESIMSm/z: 445 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.93 (1H, m, H-2), 3.31 (1H, m, H-3), 5.30 (1H, m,H-12), 0.95 (3H, s, H-23), 0.87 (3H, s, H-24), 0.99(6H, s, H-25), 0.79 (3H, s, H-26), 1.36 (3H, s, H-27),1.20 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC42.7 (C-1), 67.2 (C-2),80.1 (C-3), 39.5 (C-4), 49.6 (C-5), 19.3 (C-6), 34.1(C-7), 41.3 (C-8), 49.1 (C-9), 39.0 (C-10), 24.7 (C-11),129.3 (C-12), 140.0 (C-13), 43.1 (C-14), 29.6 (C-15),27.1 (C-16), 39.4 (C-17), 55.1 (C-18), 73.6 (C-19),43.1 (C-20), 27.3 (C-21), 26.9 (C-22), 29.2 (C-23),22.4 (C-24), 17.5 (C-25), 17.8 (C-26), 24.9 (C-27),30.7 (C-29), 19.3 (C-30)。以上數據與文獻[17]報道一致，故鑒定為2α,3α,19α-Trihydroxy-28-norurs-12-ene。

化合物13白色粉末; 分子式C30H48O5, ESIMSm/z: 489 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.94 (1H, m, H-2), 3.35 (1H, m, H-3), 5.30 (1H, m,H-12), 2.51 (1H, s, H-18), 1.00 (6H, overlapped, H-23/H-24), 0.88 (3H, s, H-25), 0.80 (3H, s, H-26), 1.36(1H, s, H-27), 1.20 (3H, s, H-29), 0.94 (3H, d,J= 7.0 Hz,H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC42.5 (C-1),67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 41.3 (C-4), 49.3 (C-5), 24.9(C-6), 34.1 (C-7), 39.4 (C-8), 48.2 (C-9), 39.5 (C-10),27.3 (C-11), 129.4 (C-12), 140.1 (C-13), 42.7 (C-14),29.6 (C-15), 26.6 (C-16), 49.3 (C-17), 55.1 (C-18),73.6 (C-19), 43.1 (C-20), 19.3 (C-21), 39.0 (C-22),29.3 (C-23), 22.5 (C-24), 17.5 (C-25), 16.9 (C-26),27.1 (C-27), 182.3 (C-28), 16.6 (C-29), 24.7 (C-30)。以上數據與文獻[18]報道一致, 故鑒定為薔薇酸。

化合物14白色針晶; 分子式C30H46O5, ESIMSm/z: 487 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD),關鍵氫質子信號如下:δH4.59 (1H, m, H-2), 5.31 (1H,m, H-12), 2.52 (1H, s, H-18), 1.19 (3H, s, H-23), 0.86(3H, s, H-24), 1.12 (3H, s, H-25), 0.90 (3H, s, H-26),1.33 (3H, s, H-27), 1.29 (3H, s, H-29), 0.94 (3H, d,J=6.9 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC50.5(C-1), 70.4 (C-2), 217.1 (C-3), 49.0 (C-17/C-4), 58.9(C-5), 20.4 (C-6), 33.9 (C-7), 41.1 (C-8), 48.3 (C-9),38.9 (C-10), 24.8 (C-11), 129.0 (C-12), 140.2 (C-13),42.7 (C-14), 30.5 (C-15), 27.0 (C-16), 55.0 (C-18),73.6 (C-19), 43.0 (C-20), 26.6 (C-21), 39.0 (C-22),26.2 (C-23), 22.1 (C-24), 17.7 (C-25), 16.6 (C-26),25.4 (C-27), 182.2 (C-28), 27.3 (C-29), 16.4 (C-30)。以上數據與文獻[19]報道一致，故鑒定為2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid。

化合物15白色粉末; 分子式C30H48O3, ESIMSm/z: 457 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.14 (1H, dd,J= 3.9, 11.0 Hz, H-3), 0.77 (1H, brs,H-5), 5.24 (1H, m, H-12), 0.94 (3H, s, H-23), 0.82 (3H,s, H-24), 0.91 (3H, s, H-25), 0.93 (3H, s, H-26), 0.91(3H, s, H-27), 0.97 (3H, s, H-29), 1.16 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC39.8 (C-4/C-1),27.9 (C-2), 79.7 (C-3), 56.8 (C-5), 19.5 (C-6), 34.0(C-7), 40.5 (C-8), 48.4 (C-9), 38.2 (C-10), 24.5 (C-11),123.6 (C-12), 145.2 (C-13), 42.9 (C-14), 28.7 (C-15),24.0 (C-16), 47.6 (C-17), 42.7 (C-18), 47.3 (C-19),31.6 (C-20), 34.9 (C-21), 33.6 (C-22), 28.8 (C-23),16.3 (C-24), 15.9 (C-25), 17.7 (C-26), 26.4 (C-27),182.0 (C-28), 33.8 (C-29), 24.1 (C-30)。以上數據與文獻[20]報道一致, 故鑒定為齊墩果酸。

1.4 化合物抗SARS-CoV-2 活性評價

通過測試化合物對SARS-CoV-2 Mpro的劑量效應，來評估從光果金櫻子中分離得到的化合物抑制SARS-CoV-2 活性的能力。本實驗使用增強型2019-nCoV Mpro/3CLpro抑制劑篩選試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，按照說明書在黑色96 孔板中進行實驗。設置空白對照組、100%酶活性對照組、陽性抑制劑Ebselen (依布硒)對照組以及給藥組，各組設3個復孔。將待測溶液稀釋至最終濃度(100、50、25、12.5、6.25μmol/L)，按照說明書依次加入試劑和樣品后37℃孵育10 min。低溫下每孔快速加入4μL底物，混勻，37 ℃避光孵育5 min。使用多功能酶標儀在激發波長為325 nm，發射波長為393 nm 處進行熒光測定，記錄每個樣品孔及空白對照孔的熒光值，以半數抑制濃度(IC50)表示抑制率。抑制率(%)=(RFU100%酶活性對照-RFU樣品)/(RFU100%酶活性對照-RFU空白對照)×100%，式中，RFU 為相對熒光單位。

2 結果和討論

本研究從光果金櫻子中分離鑒定出15 個三萜類化合物，分別為：laevigaterpene A (1)、2α,23-二羥基齊墩果酸 (2)、1β-羥基薔薇酸 (3)、3β-(p-hydroxytranscinnamoyloxy)olean-12-en-28-oic acid (4)、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸 (5)、2α,3α-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸 (6)、坡模酸 (7)、樺木酸甲酯 (8)、2α,3α,19α,23-四羥基-12-烯-烏蘇酸(9)、乙酰基-11α-甲氧基-β-乳香酸 (10)、阿江欖仁尼酸 (11)、2α,3α,19α-trihydroxy-28-norurs-12-ene (12)、薔薇酸 (13)、2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid (14)和齊墩果酸 (15)。這15 個三萜類化合物均為首次從光果金櫻子中分離得到，此外化合物4、10、12 為首次從薔薇屬植物中分離得到。化合物2、4、8、12、15 均具有SARS-CoV-2 Mpro抑制活性，IC50值分別為(51.39±0.42)、(45.02±0.28)、(6.74±0.33)、(40.21±0.10)和(5.19±0.25)μmol/L，化合物8、15 比陽性藥依布硒[(1.63±0.17)μmol/L]的抑制作用強;化合物2、4、12 對SARS-CoV-2 Mpro表現出較弱的抑制活性，而其他化合物則顯示出微弱的抑制活性(IC50>100μmol/L)。初步的構效關系分析表明，當化合物C-2 位上的氫未被取代，C-3 位為β-OH 取代時，抑制SARS-CoV-2 Mpro活性得到增強；引入羥基的數目也會影響其抑制活性，如化合物8 和15只有1 個羥基，化合物2 和12 有3 個羥基，前者的SARS-CoV-2 Mpro抑制活性強于后者；另一方面, 具有SARS-CoV-2 Mpro抑制活性的5 個化合物中，有3 個是齊墩果烷型三萜，提示后續作用機制的研究以及抗SARS-CoV-2 藥物的開發可重點關注齊墩果烷型三萜化合物。

研究表明，三萜類化合物具有廣泛的藥理活性,主要表現在抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗HIV 和護肝等方面[21]。據報道，化合物15 具有降糖、降脂、抗癌、增強免疫力等多種藥理活性[22]，化合物11 可以通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)介導的內質網應激途徑誘導非小細胞肺癌(NSCLC)細胞凋亡，是一種有效的NSCLC 化療藥物[23]。此外，光果金櫻子與金櫻子植物親緣相近, 可能具有相似的化學成分和藥理作用,如能作為金櫻子的來源去開發利用，前景十分廣闊。本研究進一步豐富了光果金櫻子的化學成分，為其日后的研究與開發提供了科學依據，更為后續光果金櫻子抗SARS-CoV-2 藥物的開發研究奠定基礎。