以COL4A5基因突變為主Alport綜合征臨床分析

劉益男 張永桃 余韶衛 羅立榮 黃逸輝 于生友 于力

1暨南大學附屬廣州紅十字會醫院兒科（廣州 510220）；2廣州市第一人民醫院兒科（廣州 510180）

Alport綜合征（Alport syndrome AS）是以血尿和（或）蛋白尿起病，伴隨腎功能進行性減退聯合感音神經性耳聾和視網膜異常等腎外損害，極少數患者可伴有平滑肌瘤為主要臨床表現的基因病，又稱遺傳性腎炎［1］。該疾病以合成Ⅳ型膠原鏈上的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變為主，其中COL4A5基因突變通常稱為X連鎖顯性遺傳性腎炎（X-linked Alport syndrome，XLAS），該突變類型占AS患者的85%，其臨床、病理表現及其預后均較COL4A3、COL4A4基因突變更為嚴重。研究表明COL4A5的致病變異體越來越多地出現在有蛋白尿（腎病綜合征腎炎型、激素耐藥型腎病綜合征）或有腎活檢發現的局灶性節段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）的個體中［2］。該病起病隱匿，臨床表現多樣，病理表現不典型因此臨床上易出現漏診、誤診等現象，目前AS的治療尚無特異性治療藥物，若未及時診斷及干預，臨床結局通常以臨床終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）結束［1，3］，最終以血液透析、腎移植治療，早期診斷并及時干預AS有很大的益處。本研究經二代基因測序檢測為COL4A5基因突變患兒臨床表型與基因之間的關系進行相關分析，探討臨床表型和基因突變類型的特點，以提高對COL4A5基因突變的再認識。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2016年4月至2023年4月期間在醫院因血尿和（或）蛋白尿查因就診后經二代測序發現COL4A5基因突變最終確診為Alport綜合征的32例患兒臨床資料，根據入選標準及剔除標準對樣本進行篩選，入選標準：（1）年齡＜18歲；（2）患兒均符合AS診斷標準［3］；（3）行基因檢測后明確診斷為COL4A5突變XLAS患兒。排除標準：（1）年齡≥ 18歲；（2）合并嚴重多器官功能障礙患兒；（3）患者被診斷為常染色體隱性遺傳或缺乏XLAS診斷證據。（4）病史資料不全者。本研究經暨南大學附屬廣州紅十字會醫院倫理委員會批準（批件號：穗紅醫院倫審2023-115-01）和廣州市第一人民醫院倫理委員會批準（批件號：K-2020-064-01），所有患兒監護人均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料選擇COL4A5基因突變確診為Alport綜合征32例患兒的臨床資料，包括性別、年齡、起病年齡、起病方式、家族史、并發癥、就診時尿常規紅細胞（個/μL）、白蛋白（g/L）、24 h尿蛋白定量（mg/24 h）、血肌酐（umol/L）、尿素氮（mmol/L）、視力及裂隙燈散瞳眼底等檢查、聽力篩查、胡桃夾B超等檢查結果。

1.2.2 病理資料收集并整理COL4A5基因突變患兒腎臟活檢組織光鏡（HE、PAS、PASM、Masson染色）、免疫熒光（IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q、HBsAg）、電鏡結果，其中21例在B超引導下行經皮穿刺腎活檢術，11例未完善該檢查。

1.2.3 基因檢測征得患兒或父母知情同意后，采取患兒及父母的外周血2 mL，提取DNA，運用二代測序技術（廣州嘉檢驗中心）進行基因檢測。提取患兒及父母DNA，并擴增建立含目標基因的全外顯文庫，利用液相捕獲目標基因，然后高通量測序，找出致病基因，用Sanger測序驗證患兒父母相應的突變，篩選出COL4A5基因突變陽性患兒32例，根據美國醫學遺傳學與基因組學會聯合美國分子病理學會指定的基因序列變異的解釋標準與指南進行致病性分析，包含參考序列、變異位點、變異對核酸序列及對編碼蛋白質的改變等，并用預測軟件（uniprot，https：//www.uniprot.org/）預測評估序列變異對基因功能的影響。

1.3 統計學方法使用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，正態分布計量資料采用均數±標準差表示，非正態分布資料以M（P25，P75）來表示，計數資料以例（%）表示。百分率比較采用χ2檢驗，如樣本量N＜40或χ2檢驗的結果在臨界狀態時采用Fisher's精確概率法，單向有序組間資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較32例患兒中男性患兒16例，女性患兒16例，男女比例為1∶1，患兒起病年齡為1～10歲，其中男性患兒平均起病年齡為（3.56 ±2.72）歲，女性患兒平均起病年齡為（3.81 ± 1.90）歲。確診XLAS的患兒年齡為（4.83 ± 2.12）歲，＜5歲者10例（31.25%），≥ 5歲且＜10歲者18例（56.25%），≥ 10歲者4例（12.5%）。按起病方式可分為：（1）以孤立性血尿起病12例（37.5%）；（2）以血尿＋蛋白尿起病8例（25%）；（3）以腎病綜合征腎炎型起病12例（37.5%）。患兒家族中直系親屬有尿常規或腎功能異常者有11例（34.4%），家族史陰性21例（65.6%）。患兒合并胡桃夾綜合征6例（18.75%），患兒初診時診斷為腎病綜合征腎炎型12例（37.5%）。腎外表現耳部病變的發生率高于眼部病變，眼部病變白內障3例（9.37%），耳部病變感音性神經性耳聾6例（18.75%），其中3例患兒（50%）發生腎衰，后期隨訪發現7例（21.87%）患兒已腎衰竭，7例患兒發展為ESRD的平均年齡為（15.66 ± 4.41）歲，其中女性患兒5例（71.42%），男性患兒2例（28.57%）。見表1。

表1 32例AS患兒臨床資料特點分析Tab.1 Characterization of clinical data of 32 children with AS 例（%）

2.2 腎臟病理光鏡：局灶節段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）2例（9.52%）；系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，Ms PGN）11例（52.38%）；微小病變（minimal change disease，MCD）8例（38.09%）。免疫熒光陰性17例（80.95%）；IgA沉積4例（19.04%）。電鏡：基底膜變薄（彌漫性或節段性）13例（61.9%）；基底膜厚薄不均8例（38.09%）。

2.3 基因檢測32例患兒均行第二代基因檢測，基因突變類型分為錯義突變12例（37.5%）、剪切位點突9例（28.12%）、無義突變6例（18.75%）、缺失突變3例（9.37%）、移碼突變2例（6.25%）。后期隨訪中發現7例（21.87%）腎衰竭患兒，錯義突變4例（57.14%），剪切位點突變2例（28.57%），無義突變1例（14.28%）；自發突變10例（27.02%），其中女性患兒8例（80%），男性患兒2例（20%）；遺傳突變22例（68.75%），其中19例（85%）遺傳于母親，男性患兒15例（76.47%），女性患兒4例（23.52%）；3例（9.37%）遺傳于父親，均為女性患兒，后期隨訪中發現其中2例女性患兒已進入ESRD階段。基因檢測結果，見表2。

表2 32 例XLAS患兒基因檢測結果Tab.2 Genetic testing results of 32 children with XLAS

3 討論

Alport綜合征是編碼膠原IVα3、α4、和α5鏈的基因COL4A3、COL4A4、COL4A5突變，導致這些鏈不能形成α3α4α5異源三聚體，不能構成腎小球、耳朵和眼睛基底膜的主要組成部分，當編碼這些鏈的3個基因中的任何一個發生突變時，α3α 4α5膠原網絡在腎小球基底膜（Glomerular basement membrane，GBM）中的正確折疊與組裝就會受損：它變得非常容易受到過濾壓力的影響，并最終受到不可逆的損傷，從而出現與GBM損傷相關的臨床特征［4］。Alport綜合征的遺傳方式對腎臟預后有很大影響，以COL4A5基因突變導致的X連鎖Alport綜合征發病率最高，約占85%，該基因突變為主的AS臨床癥狀及病理表現較以COL4A3、COL4A4突變為主的AS更為嚴重，研究表明這可能與以下因素相關：（1）COL4A5基因位于X染色體上，攜帶該致病基因，是診斷XLAS遺傳性腎炎的條件；（2）COL4A5編碼區域位于Ⅳ型膠原蛋白中心1/3處，中心區域具有重要的結構和功能，而COL4A3和COL4A4編碼區域位于兩端，即使突變對于Ⅳ型膠原蛋白合成影響相對較小；（3）COL4A5在腎小球的表達量比COL4A3和COL4A4更高，綜上機制可能會導致COL4A5突變后腎小球基底膜損傷更嚴重。1989年POCHET等的臨床研究首次表明常染色體顯性遺傳的男性患者的中位腎臟生存期比X連鎖染色體的患者長25年，GIBSON等［5］描述男性通常在30歲前出現腎功能衰竭，同時伴有聽力損失和眼部異常，女性具有更多樣的表型，通常受影響較小，在60歲時，高達20%的女性出現腎衰竭。2022年SAVIGE等［6］報道表明COL4A3和COL4A4雜合變異（常染色體顯性Alport綜合征）癥狀較輕，通常與終末期腎衰竭、聽力損失或眼部異常無關，2023年ZHOU等［7］納入126例中國AS患兒，表明COL4A5基因突變相較于COL4A3、COL4A4突變在臨床中的癥狀更重，預后更差，很快可出現腎外表現及進展至ESRD階段。臨床上對COL4A5基因突變引起的XLAS高度重視，根據2021版國外Alport綜合征的基因檢測和管理指南［8］明確提出所有男性XLAS患者確診時即啟動血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）治療，女性XLAS患者在出現微量蛋白尿、高血壓和腎功能減退時即啟動ACEI治療。

正常腎小球基底膜是完整連續的，厚度均勻一致，是構成腎小球濾過機械屏障的重要組成成分，診斷AS在基因檢測尚未普及時腎臟電鏡病理是非常重要的手段，根據我國2023最新版指南共識［1］。Alport綜合征的金標準是電鏡下腎小球基底膜極不規則、彌漫性變薄或增厚，或厚薄及密度不均、致密層撕裂分層、籃網狀改變。KAMENETSKY等［9］發現在AS的早期或輕度病例中，基底膜變薄可能是主要特征，本組資料中13例患兒電鏡結果表現為基底膜變薄或厚薄不均，這與該結論一致；在本研究中行腎臟穿刺的患兒中光鏡結果顯示通常表現為Ms PGN、微小病變、FSGS這3種病理形式，對于免疫熒光而言，沉積IgA的病例相對較多，該研究的電鏡表現可能與疾病診斷早，病理尚未進展至經典表現相關，因此對于診斷兒童AS，早期單靠腎穿刺活檢確診特異性不高，相較于腎臟穿刺，基于有創程度及特異性而言，基因檢測似乎是更好的選擇。

COL4A5基因突變有多種類型，常見的分類形式為錯義突變及非錯義突變，錯義突變臨床表現較輕微，預后一般較好，而非錯義突變可分為移碼突變、缺失突變、無義突變、剪切位點突變等，本組資料中錯義突變12例，剪切位點突變9例，為常見突變類型，這和HERTZ等［10］、譚俊杰等［11］臨床報道結果相似，2019年NOZU等［12］研究表明發生腎功能衰竭的概率依次為移碼突變、缺失突變、剪切位點突變、錯義突變，其主要是依據這些突變形式會導致蛋白在轉錄及翻譯過程中降低信使核糖核酸水平，出現截短蛋白，導致Ⅳ膠原蛋白結構和不完整從而影響功能，因此非錯義突變的臨床表現及預后較錯義突變差，更容易導致腎移植結局［13］。這與本研究結論不一致，本研究中，7例患兒后期出現腎功能衰竭表現，但錯義突變比例明顯高于其他突變類型，且進入ESRD的年齡明顯偏小，這可能與總體樣本量偏少及錯義突變類型在本研究中占比例偏多有關，且XLAS的遠期臨床結局還受不同因素影響，比如突變位點的位置、突變位點所對應的蛋白質結構域、突變氨基酸的性質等因素相關，因此在解釋這些結果時需考慮這些因素，但無論如何在臨床中面對遺傳或臨床咨詢時我們應謹慎對待錯義突變類型，其預后也可能會更差。對于性別差異而言，TAN等［14］、BEKHEIRNIA等［15］的大樣本臨床研究均表明男性在該疾病中具有典型的臨床表現，并與基因型之間呈強相關性，證實其臨床表現、進展及預后男性均較女性嚴重，這不僅與雌激素可在一定程度上保護腎功能有關，而且與X染色體失活的不均勻模式（即偏斜的X染色體失能）相關［16］。JAIS等［17］發表了有關女性大樣本基因型-臨床表型相關性研究，納入了195個家系，結果表明盡管男性腎功能衰竭的進展是持續的，但女性的腎功能衰竭過程變化跨度更大，總體而言大多數女性臨床癥狀仍較輕，女性在40歲前患終末期腎病的概率為12%，而男性為90%。2022年GIBSON等［18］在PubMed和Scopus檢索了過去20年的文獻，提取了具有致病性雜合COL4A5變異體的366例女性的基因型和臨床數據，結果表明決定XLAS女性患兒預后及嚴重程度的因素有蛋白尿的發生和逐漸增加，以及聽力缺陷的發展。本研究有7例（21.87%）患兒疾病進展至ESRD，有5例（71.42%）是女性，其中4例（80%）患兒早期表現大量蛋白尿，本組資料進展至終末期腎病患兒的臨床資料也驗證了該因素，即在患有X連鎖Alport綜合征的女性患兒中，蛋白尿與更嚴重的基因型相關，是疾病嚴重程度和可能進展的指標［18］。

本組資料中患兒起病年齡小，病程短，早期缺乏特異性診斷依據，根據患兒臨床中出現一系列腎內表現，疾病早期易誤診為腎病綜合征腎炎型，后發現使用激素甚至加用免疫抑制劑進行治療效果仍欠佳，隨著病情進展，陸續出現腎外表現及腎功能進行性減退等表現，疑診AS。腎病綜合征腎炎型病理特點是免疫復合物可沉積于腎小球內，引起局部的免疫反應及損傷，而這種損傷會影響到COL4A5編碼的α5鏈的正常表達和功能，黨西強等［19］對313例患腎臟疾病兒童腎臟穿刺活檢進行了相關分析，發現腎病綜合征腎炎型的常見光鏡表現為FSGS、Ms PGN、IgA腎病，這與本研究中AS患兒光鏡表現相似。陳燕貞等［20］納入了91例AS患兒進行回顧性分析發現45例誤診為其他疾病，而其中腎病綜合征占比約40%，因此臨床中對于難治性腎病綜合征患兒必要時可完善基因檢測排除AS可能。血尿作為第一臨床表現，臨床上對于持續性變形性鏡下血尿及肉眼血尿的患兒，一定要引起足夠重視，盡量明確病因，后續定期隨訪監測患兒病情變化，蛋白尿作為疾病進展的重要標志，若患兒以腎病綜合征腎炎型起病且完善腎活檢結合病史診斷仍未明確，應建議及時完善基因檢測。

綜上所述，遺傳性腎炎COL4A5基因突變患兒起病時臨床表現嚴重程度差異性較大，疾病早期經典的病理表現及腎外表現均尚未出現，加上新發變異提供的家族史尚不能為臨床提供線索，給臨床診斷帶來一定難度，在初診時易被誤診為腎病綜合征腎炎型，予激素或免疫抑制劑進行治療，從而耽誤使用一線藥物治療的最佳時機，影響預后。因此建議積極完善基因檢測以明確診斷，一經確診應立即啟動一線ACEI類的藥物保守治療蛋白尿；該基因突變性別之間異質性明顯，男性臨床表現更為典型，女性患兒臨床表現跨度大，也需謹慎診治；完善基因檢測，注意突變類型，綜合多種因素去判斷預后，一旦確診合理藥物干預，延緩腎功能衰竭。