減施氮肥配接種固氮菌劑對烤煙生長和土壤特性的影響

滕秋梅　張德楠　余麗敏　何成新　張中峰　徐廣平

摘要：目前多數經濟作物種植過程中存在氮肥用量過多成效甚微的問題。為探討減少氮肥用量且施加固氮菌劑對烤煙生長及土壤特性的影響，設置減半氮肥（對照CK）、施全量氮肥（T2）、減半氮肥配接種固氮菌劑（T3）共3個處理，通過盆栽試驗，分析減氮配施固氮菌對不同品種烤煙農藝性狀、生物量、葉片養分含量、土壤化學性質和土壤微生物的影響。結果表明，T2、T3處理下烤煙的株高、莖粗、葉長、葉生物量、總生物量差異不顯著。葉片全氮、全磷、全鉀含量均表現為T2＞T3；土壤全磷、全鉀、速效磷和堿解氮含量在T2和T3處理間沒有顯著差異。土壤細菌、放線菌數量均表現為T3＞T2，真菌數量則表現為T2＞T3，其中NC102、KRK26在T3處理下細菌數量比T2分別多44.77%、22.65%；放線菌的數量分別多33.81%、31.77%；真菌數量比T2分別少19.28%、15.54%。經過主成分分析得出，土壤有機碳、全氮、全磷、細菌與葉片全鉀、全氮、全磷、株高、葉長、葉寬、莖生物量等均顯著正相關，說明不同烤煙在不同處理下的農藝性狀、生物量、葉片養分含量、土壤化學性質、土壤微生物數量之間具有顯著的相關關系。可見，減氮配施固氮菌菌劑對不同品種烤煙的影響與全量施氮相似，減氮配施固氮劑可顯著改善烤煙生長的土壤微環境。

關鍵詞：減氮；固氮菌劑；烤煙；生長；土壤特性

中圖分類號：S143.1；S572.06文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）21-0072-07

目前我國在大多數作物種植過程中普遍存在氮肥使用量高、利用率低的問題［1］?；视绕涫堑实倪^量施用會導致土壤板結酸化、氮淋失、水土流失、土壤微生物生物量下降和潛在的大氣污染等環境問題和生態危機［2-3］。針對當前化肥超量使用在農業生產中的現狀，有機肥替代化肥是改善措施之一。施用大豆和海藻等有機肥，可以改善作物土壤的理化性質，并能影響土壤細菌群落結構以及作物生長發育［4］。除用有機肥代替化肥外，Tao等聚焦于將微生物菌劑應用于提高肥料利用效率和促進農作物生長［5］。微生物菌劑的施用可提高土壤營養成分含量，增加微生物的多樣性；它所產生的某些代謝產物可以刺激植株根系生長，幫助植株更好地攝取養分，從而促進作物生長［5-7］；同時可以在一定程度上減少氮肥的用量，避免對環境的污染［8］。林麗云等認為，化肥配施微生物菌劑對作物的生長有顯著的影響［9］。李鳳霞等認為，氮肥減量30%配施微生物菌劑可使土花椰菜產量明顯增加［10］。其中固氮菌作為一種有機營養型細菌，在作物增產、土壤環境改善、生物固氮等問題上具有重要作用［11-13］。胡夢媛等認為，固氮菌與化肥配施可以使作物產量增加20％以上［14］。賈雨雷等認為，化肥菌草固氮菌肥+75%化肥在一定程度上可以促進巨菌草生長，改善其營養品質和土壤理化性質［15］。以上結果均表明，有機肥和微生物菌劑的合理配置在促進作物生長和提高產量以及減少化肥用量上表現出巨大的潛力和良好的應用前景?？緹熓且环N以質量為主兼顧產量的特殊葉用經濟作物。烤煙在栽培過程中對氮素營養非常敏感，氮含量直接影響植株的生長發育、干物質積累等重要生理生化過程，對煙株體內重要的有機物如蛋白質、葉綠素、煙堿等的含量也有顯著影響，進而影響烤煙的品質［16-18］。有關施用有機肥、不同水平氮肥或接種微生物菌劑配施化肥對烤煙生長、產質量、抗病性以及植煙土壤理化性質等影響的研究較多［4，19-22］。但針對氮肥與固氮菌劑的聯合使用對不同品種烤煙生長狀況、葉片營養含量、土壤化學性質及土壤微生物特性等方面的系統研究仍處在初級階段。本研究利用盆栽試驗，使用固氮菌（巨大芽孢桿菌）接種烤煙，探討以有機肥為底肥，氮肥減量配接種固氮菌劑條件下對烤煙的生長、葉片營養含量、土壤化學性質及土壤微生物的影響，討論在減少氮肥用量的條件下固氮菌和有機肥替代化肥能否滿足烤煙對氮素的營養需求，旨在為化肥減量施用、固氮菌劑在農業中的應用與推廣以及農業可持續發展提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙有NC102和KRK26共2個品種，來自廣西中煙工業有限責任公司邵陽煙葉基地。供試的固氮菌為巨大芽孢桿菌，從廣西壯族自治區平果市果化鎮石漠化地區植物根際土壤中分離篩選所得，具體篩選方法參照曹彥強等的做法［23］。供試肥料：氮肥為硝酸銨；磷鉀肥為磷酸二氫鉀（執行標準：HG/T 2321—2016《肥料級磷酸二氫鉀》；P2O5≥51.5%、K2O≥34%）；有機肥即草炭灰（有機質含量>50%，氮含量2%）。供試盆栽土壤采自中國科學院廣西植物研究所試驗田，土壤pH值、有機碳含量、全氮含量、全磷含量、全鉀含量、速效磷含量、速效鉀含量、交換性鈣含量、交換性鎂含量、堿解氮含量分別為5.27、32.99 g/kg、1.30 g/kg、0.60 g/kg、9.62 g/kg、1.23 mg/kg、5.07 mg/kg、209.59 mg/kg、18.60 mg/kg、83.81 mg/kg。

為模擬自然狀態下的接種環境，試驗土壤不進行滅菌。盆栽試驗所用容器為塑料花盆（規格為 28 cm×32 cm）。

1.2 試驗設計

試驗于2020年4月在中國科學院廣西植物研究所進行。該地區年平均相對濕度73%～79%，日照時長1 670 h、溫度19.3 ℃。試驗采用完全隨機設計，共包括3個處理，分別為施50%大田推薦劑量即7.5 g氮肥的對照處理（CK），施全量大田推薦劑量15 g氮肥（T2），施50%大田推薦劑量即7.5 g氮肥配合100 mL固氮菌劑（T3）［24］。每個處理設置5個重復，2種烤煙共計30盆。

試驗花盆使用0.5% KMnO4溶液浸泡3～5 min 消毒，而后清洗干凈，待自然風干后裝填由 1 kg 土（上層）、1.5 kg草木灰（中層）、1 kg土（底層）組成的培養基質（基質高約為花盆高度的3/4），以80%最大田間持水量為標準加水至培養基質中，平衡1 d后每個花盆移植1株烤煙進行適應性生長。待烤煙長至有5～6張真葉時，在苗根際打孔，接種菌劑（將篩選純化的巨大芽孢桿菌菌株接種至 LB 液體培養基中，搖床培養（30 ℃、180 r/min）至對數期。用注射器進行灌根接種，接種量為100 mL，使最終濃度達到106 CFU/g。接種10 d 后，在植物根部以澆灌的方式施加肥料?？刂品柿媳壤秊?N ∶P ∶K=1 ∶1 ∶2.5［24］，T2處理組施加氮肥15 g、磷酸二氫鉀30 g。T1、T3處理對應的減氮（1/2氮）處理的施氮量為7.5 g/株，各處理磷、鉀肥用量一致，即每株磷酸二氫鉀均為30 g，分3～4次施加。

1.3 測定指標及方法

烤煙移栽后90 d，每個處理選擇生長狀況較一致的3株烤煙，用鋼卷尺和游標卡尺測定烤煙莖粗（莖基部直徑）、株高（莖基部至生長點上方的高度）、葉長（葉子為中成熟葉）和葉寬；采用收獲法測定生物量。于烤煙成熟期采取植株樣品，將采集的煙株按不同器官（根、莖、葉）分開，分別稱鮮質量后裝信封袋，置于烘箱內烘至恒質量，稱量各部位干質量，最后取3株烤煙的平均值。用粉碎機將烘干的樣品粉碎后過篩。植物全碳、全氮、全磷、全鉀含量的測定分別采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法、凱氏定氮法、鉬銻抗比色法、火焰光度法，全鈣和全鎂含量均采用絡合滴定法測定［25］。

采植物樣的同時采集花盆里的土壤（移栽后130 d）。清除地被物后用土鉆取0～10 cm的土 300 g，剔除石礫和植物殘根等雜物后迅速裝入滅菌的采樣袋中。帶回實驗室后過2 mm篩，一部分樣品立即進行土壤微生物數量測定；另一部分樣品自然風干后用于土壤養分的測定。土壤pH值采用pH計測定，土壤有機碳、全氮、全磷、速效磷、全鉀、速效鉀含量的測定分別用重鉻酸鉀氧化-外加熱法、用半微量凱式法、氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法、雙酸浸提法、氫氧化鈉堿熔-火焰光度法、用乙酸銨浸提-火焰光度法［25］。土壤微生物數量的測定參照許光輝等的方法進行［26］，通過稀釋平板計數法進行細菌、放線菌、真菌數量的測定，采用的培養基分別為牛肉膏蛋白胨培養基、改良高氏1號（苯酚 500 mg/L）培養基、馬丁（Martin）孟加拉紅-鏈霉素（鏈霉素30 mg/L）培養基。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0軟件統計分析，使用ANOVA單因素方差分析、Duncans檢驗和最小顯著性差異（LSD）法對同一品種烤煙不同處理間的植物和土壤化學性質進行顯著性分析與多重比較（α=0.05）；同一處理不同烤煙品種間的差異采用配對t檢驗進行分析。用Origin 2018作圖；圖和表中的數據為3個重復的平均值和標準誤差；以植物的農藝性狀、葉片營養物質含量、土壤化學性質和土壤微生物指標通過CANOCO 5.0軟件完成PCA分析。

2 結果與分析

2.1 接種固氮菌劑對烤煙農藝性狀的影響

由圖1可知，參試的2個品種烤煙，T2、T3處理下的農藝性狀均顯著大于CK（P<0.05）；而T2、T3處理間烤煙的農藝性狀的差異均沒有達到顯著水平（P>0.05）。不同烤煙品種在同一施肥處理下的株高、莖粗、葉長、葉寬均沒有顯著差異（P>0.05）。

2.2 接種固氮菌劑對烤煙生物量的影響

由圖2可知，同一處理下不同品種烤煙的生物量差異均不顯著（P>0.05）。2個烤煙品種的根、莖、葉生物量以及總生物量均表現為T2、T3>CK，差異均顯著（P<0.05）。T2處理下的根、莖生物量均顯著大于T3，而葉生物量和總生物量與T3均沒有顯著差異（P>0.05），說明減氮配施固氮菌劑不影響烤煙產量（以葉為主）。

2.3 接種固氮菌劑對烤煙葉片養分含量的影響

由表1可知，除全碳、全鎂外，不同烤煙品種CK與處理的葉片養分含量均差異顯著（P<0.05）。T2、T3處理下全氮、全磷、全鉀含量均顯著大于CK，全碳含量與CK的差異沒有達到顯著水平（P>0.05）。T2處理的全氮、全鉀含量均顯著大于T3，NC102的T2處理全氮、全鉀含量比T3分別增加17.20%、24.52%，KRK26的T2處理全氮、全鉀含量比T3分別增加11.20%、7.40%。NC102的T2處理全鈣、全鎂含量與T3處理存在顯著差異。KRK26的T2處理全磷含量與T3存在顯著差異。

2.4 接種固氮菌劑對烤煙土壤化學性質的影響

由表2可知，不同烤煙品種在不同處理下土壤的pH值均無顯著差異（P>0.05）。2種煙葉土壤T2、T3處理下全磷、全鉀、 速效磷、 堿解氮含量間沒有顯著差異，但均顯著大于CK；速效鉀含量則是CK處理最大。同一處理不同品種烤煙對土壤化學性質的影響有差異，如NC102中土壤有機碳含量顯著大于KRK26。

2.5 接種固氮菌劑對烤煙土壤微生物的影響

由圖3可知，2種烤煙在不同處理下土壤細菌（圖3-a）、放線菌（圖3-c）數量均表現為T3處理最大；相反，真菌數量（圖3-b）表現為T3處理最小。NC102、KRK26在T3處理下細菌數量比T2分別多44.77%、22.65%；放線菌數量比T2分別多33.81%、31.77%；真菌數量比T2分別少19.28%、15.54%。

2.6 烤煙的生長指標、葉片養分含量、土壤化學性質和土壤微生物之間的主成分分析

圖4為烤煙生長指標、葉片養分含量、土壤化學性質和土壤微生物數量間的主成分分析（PCA）結果。第一和第二主成分的累計貢獻率達到總方差的74.64%，表明排序結果可信，能夠較好地反映不同烤煙品種在不同處理下農藝性狀、葉片養分含量、土壤化學性質和微生物特性之間的關系。第一排序軸（解釋了45.23%）與株高、莖粗、葉生物量、根生物量、葉長、葉寬、葉片全鉀含量、葉片全氮含量、葉片全磷含量和細菌數量、速效磷含量、土壤有機碳含量、土壤全氮含量、土壤全磷含量、全鎂含量呈正相關（夾角＜90°，下同），與其他因子呈負相關。第二排序軸（解釋了29.41%）與葉片全鎂含量、葉片全鈣含量呈正相關，與其他因子呈負相關。NC102和KRK26分布在主成分兩軸的兩側，不同品種的不同處理均能各自聚為一類，說明不同品種和不同處理對烤煙各指標的影響顯著，但各個指標的響應存在顯著差異。如土壤有機碳含量、土壤全氮含量、土壤全磷含量、細菌數量均與葉片全鉀含量、株高、莖生物量、葉生物量、根生物量、葉長、葉寬、葉片全氮含量、葉片全磷含量顯著正相關，與葉片全碳含量、莖粗顯著負相關；速效磷含量與葉片全鎂、全鈣含量顯著正相關；葉片全碳含量、莖粗與土壤pH值、全鉀含量、堿解氮含量、放線菌數量顯著正相關。細菌數量與土壤pH值、速效磷含量呈正相關，放線菌數量與pH值、全氮含量、堿解氮含量正相關，真菌數量與pH值、堿解氮含量、速效鉀含量正相關。

3 討論與結論

固氮菌屬于有機營養型細菌，每年固定得到的氮肥達1億t以上，在解決氮素來源問題上具有巨大的潛力。固氮菌不僅可以提高土壤固氮量，有利于植物根系激素調節，增加植物抗病抗逆能力，促進植物更健康的生長，且固氮菌與化肥配施可以使作物產量增加20％以上［14］。本研究減氮配施固氮菌劑對烤煙的農藝性狀（株高、葉長、葉寬等）和葉生物量的影響相較于施全量氮肥處理的差異沒有達到顯著水平（圖1、表2），說明接種固氮菌劑可顯著減少氮肥用量且不影響作物的生長和產量，適量固氮菌劑在一定程度上具有氮肥促進植物生長的同等效應，可代替氮肥在農業生產上的使用。與此結果相似，葉文雨等認為，從巨菌草根中分離得到固氮菌能提高大麥（Hordeum vulgare）的葉長、根長、根質量等［27］；宋時麗等的研究也得出類似的結果［8-9］。這也說明微生物菌劑在實現化肥零增長和農業可持續發展等方面具有良好前景。

葉片能明顯反映養分的供應情況，在營養診斷中葉片的營養狀況是最重要的量化指標［17］。適量的磷、鉀營養還能促進脂肪代謝和香氣物質的合成。微生物菌劑可提高植物對氮、磷、鉀的吸收在許多作物上已有報道［9，16］。與前人的研究結果相似，本研究中減氮配施固氮菌劑處理的烤煙葉片全氮、全磷、全鉀含量均顯著大于對照，說明減氮配施固氮菌劑有利于增加烤煙對氮、磷、鉀素的吸收，改善煙葉的品質，同時可以提高煙葉的抗倒伏性能。此外，本研究還得出全量施氮后烤煙葉片全氮、全磷、全鉀含量高于減氮配施固氮菌劑處理?？赡苁且驗榈貐⑴c植物蛋白合成及光合作用等生長代謝及生命活動，全量施氮處理的氮肥使用量較減氮配施固氮菌劑處理多50%，施入充足的氮素更容易被烤煙吸收和利用，因此體內的全氮含量會增多［11］。植物葉片中的養分含量與土壤中養分含量的高低顯著相關。劉宇輝等認為，微生物肥和化肥配施有助于增強土壤養分的供貯能力，加強養分循環，并能使得土壤有機質保持平衡［12］。與此結果相對應，本研究得出減氮配施固氮菌后烤煙土壤全磷、全鉀、速效磷和堿解氮含量顯著高于對照處理（表3），表明接種固氮菌和施入全量氮肥均可以增加烤煙土壤中全磷、全鉀、速效磷和堿解氮含量。這與菌劑的生理活性有密切關系，烤煙土中含有許多礦物質成分，在土壤中添加菌劑后，通過菌株的固氮、溶磷、解鉀作用，提高土壤中烤煙可利用氮、磷、鉀元素［14］。而速效鉀含量均是減半施氮肥處理高于減氮配施固氮菌，可能是因為施入的氮肥或菌劑會加速鉀細菌對難溶態和固定態鉀的分解，且植物吸收的量較大，所以土壤的留存量較少。減氮配施固氮菌后土壤全磷、全鉀、速效磷和堿解氮含量與全量施氮肥間沒有顯著差異（表5）。說明接種的固氮菌對烤煙土壤全磷、全鉀、速效磷和堿解氮的貢獻效果可能與另一半氮肥相似。不同烤煙品種的全量施氮處理葉片全鈣、全鎂、全磷、全鉀與減氮配施固氮菌處理存在顯著差異?？赡芘c巨大芽孢桿菌菌劑中的有益微生物調控植物激素水平、解磷促鉀能力，以及提高土壤磷、鉀、鈣等生物有效性及利用率相關［13，15，28］。

土壤微生物屬于土壤生態系統的重要組成部分，它們能夠分解土壤中的有機質為作物吸收利用，放線菌還能分泌一些能夠抑制某些病原菌生長繁殖的物質，其活性與農作物生長發育的營養供應密切相關［29-30］。在多數情況下，固氮菌能與多種根際微生物共同作用，影響根際微生物的數量和優勢菌群的形成，從而促進植物的生長。本研究發現2種烤煙在減量配施固氮菌劑處理下可以顯著提高烤煙土壤細菌和放線菌的數量，降低真菌的數量（圖3），這與Zhou等的結論［31］相一致。減量配施固氮菌劑處理在施加50%氮肥的情況下添加固氮菌劑，土壤微生物活化土壤養分、氮素轉化速率提高［32］，同時減量配施固氮菌劑處理下固氮菌劑的微生物與植物體競爭氮素，使得固氮菌劑的固氮能力增強，微生物活動增強［33］；施加固氮菌劑后可促進植物根系營養元素的吸收利用與分泌物的形成，土壤中氮含量的增加給有益微生物菌群（如細菌和放線菌等）提高了競爭營養的動力［20］，在提高細菌、放線菌數量的同時對真菌產生拮抗作用，減少有害菌群（如真菌）的數量，使土壤向有益微生物菌群、“健康細菌型”方向發展［34］，這同時也與巨大芽孢桿菌調節土壤微生物多樣性的能力相關［28］；說明減氮配施固氮菌劑對烤煙根際土壤細菌、放線菌、真菌等微生物組成結構具有一定調節的作用，這與李鳳霞等的研究結果［10］一致。賈雨雷等認為，適宜比例肥料配合微生物菌劑的使用可以改善土壤微生物組成結構比例及區系環境，分解土壤養分供植物吸收，提高養分有效性，肥料與微生物菌劑相互影響，在促進作物生長方面形成協同效應［15］。該結果進一步說明固氮菌具有抗病抗逆能力，在固氮的同時能為植物提供更安全的生長環境。另外，接種固氮菌劑對土壤細菌和放線菌的增加效果顯著優于施全量氮素。原因之一可能是固氮菌劑的進入可以促進烤煙根際分泌物的增加，從而促進根際細菌和放線菌數量的增加，還可能是因為固氮菌的施入提高了土壤細菌和放線菌生境的養分含量以及增加養分來源，營養的改善有利于其數量的增加。

PCA分析得出土壤pH值、速效磷、速效鉀、堿解氮等與細菌、放線菌顯著相關，說明接種固氮菌劑后，土壤中有效養分的變化對土壤微生物數量產生了顯著的影響，此結果與Lin等的研究結果［33］類似。在本研究的不同處理間土壤pH值雖然沒有顯著差異，但也可能對某些微生物類群在土壤中的分布產生重要的影響［33］。微生物菌劑會在某種程度上保持和提升土壤pH值［35］。本研究種植煙葉后土壤pH值沒有顯著變化，給最適生長pH值為6～8非鹽堿土的固氮菌提供了非常適宜的生長環境，而土壤酸堿性影響微生物定殖，使得菌劑附著在植物根系的微生物達到較好的生長狀態［36］。另外，速磷、堿解氮等速效養分的提升可為細菌、放線菌群落提供充足的養分。適宜的生長環境加上充足的營養物質會加快微生物的繁殖速度，使土壤微生物數量提高。因此，烤煙土壤中三大微生物數量的變化可能也會加速土壤養分循環，增強烤煙的養分吸收，從而促進烤煙生長。

PCA分析還得出烤煙的農藝性狀、葉片養分含量、土壤化學性質和土壤微生物間具有顯著相關關系（圖4），說明固氮菌劑和氮肥處理下對烤煙生長的促進效果是受到多個因素的綜合影響。另外，不同烤煙品種之間在接菌處理下對土壤微生物數量（細菌、真菌、放線菌）、農藝性狀特別是葉生物量和總生物量的影響沒有顯著差異，這在一定程度上說明減半施氮配接種固氮菌劑適用于不同的烤煙品種。在今后的研究中可以將減氮配施固氮菌這一措施應用于其他品種的烤煙，以更一步佐證本研究的結論。至于在同一接種處理下不同種烤煙的葉片營養元素含量、土壤化學性質有異，可能與不同品種烤煙需要的營養元素含量不同有關［37］。因此，在使用氮肥與固氮菌劑調節植物生長時，需要考慮土壤碳、氮、磷、鉀等元素含量和其他環境限制因素，土壤性質對固氮菌劑附著在植物根際的微生物菌群的活性影響及其與土壤微生物的協同拮抗效應，模型擬合預測氮肥與固氮菌劑的最佳比例及體系效應，篩選高效、復合固氮菌達適地、適植、適菌、適量的良好綜合效果，進而推動高效固氮菌應用、作物增產及可持續發展。

綜上所述，減半施氮同時接種固氮菌沒有影響烤煙的農藝性狀、生物量和植物葉片營養積累量，但表現出能夠提高土壤中細菌和放線菌數量的作用，在烤煙種植上接種固氮菌劑，主要表現為改善土壤微環境。

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收稿日期：2023-01-09

基金項目：廣西重點研發計劃（編號：AB18126065）；廣西科學院創新團隊項目（編號：CQZ-E-1909）；廣西自然科學基金（編號：2020GXNSFBA297048）。

作者簡介：滕秋梅（1991—），女，廣西靈山人，碩士，助理研究員，主要從事喀斯特退化土壤修復和根際生態研究。E-mail：tqm1907@163com。

通信作者：張中峰，博士，研究員，主要從事退化土壤修復研究。E-mail：zfzhang@gxib.cn。