福建閩南地區與廣西北海地區波紋巴非蛤的形態差異與遺傳多樣性分析

周治東,張麗艷,霍云龍,李海平,何雪蒨,張躍平*

(1.福建海洋研究所,福建 廈門 361013; 2.福建省海島與海岸帶管理技術研究重點實驗室,福建 廈門 361013;3.福建省海陸界面生態環境聯合重點實驗室,福建 廈門 361005;4.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門 361005)

波紋巴非蛤(Paratapesundulatas,舊稱:Paphiaundulatas)是我國東南沿海地區一種重要的經濟貝類,多棲息于低潮區至水深10 m左右的泥砂底質中,俗稱“花甲”、“油蛤”等[1]。在我國,波紋巴非蛤自然分布于浙江南部、福建、廣東、海南和廣西沿岸海域[2-3],其滋味鮮美,營養豐富,紋理清晰,色澤明艷,深受廣大消費者喜愛[4-6]。近年來,隨著市場需求量的增加,波紋巴非蛤的采捕壓力過大,波紋巴非蛤自然資源遭受了毀滅性的破壞[7]。因此,我國已在福建、廣西等東南沿海地區大力發展波紋巴非蛤養殖產業[8-9]。然而,近年來福建閩南沿海波紋巴非蛤的淺海增養殖大量采用廣西外來苗種,種群結構受人為活動的干擾嚴重,這種非自然的交流導致不同種群間進行基因交流,致使本地波紋巴非蛤的種質資源遭受破壞,遺傳多樣性保護迫在眉睫[10]。

迄今為止,國內有關波紋巴非蛤形態學[7,10]、分子遺傳學[10]的研究較少,而有關微衛星分子標記的研究多集中在微衛星引物開發方面[11]。本研究對采集于福建閩南地區及廣西北海地區的波紋巴非蛤種群樣品進行形態學和分子遺傳學研究,探討不同群體間的形態差異和遺傳分化程度,以期為波紋巴非蛤遺傳特性研究、種質資源的保護及養殖繁育提供理論和方法依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

波紋巴非蛤樣品于2020年12月至2021年12月采自福建閩南地區(廈門同安灣海域、云霄東山灣海域、惠安大港灣海域)及廣西北海(北部灣海域),以下簡稱廈門群體、云霄群體、惠安群體、北海群體,每個群體樣品數量不少于30枚(圖1)。隨機選取外殼完好的波紋巴非蛤個體進行形態測量,測量完畢后每個群體隨機挑選24枚取其斧足及閉殼肌用95%的酒精固定,以備后續分子遺傳學研究。

圖1 4個群體波紋巴非蛤樣品外殼形態Fig. 1 Shell shape of four Paratapes undulatas populations

1.2 形態學測量方法

采用精度為0.01 mm的游標卡尺對波紋巴非蛤的形態特征參數進行測量:分別獲得殼長(Ls)、殼高(Hs)、殼寬(Ws)、韌帶長(Lh)、前腹緣距(Af)、后腹緣距 (Ab)6個形態學參數(圖2);用精確至0.001 g的電子天平稱取殼質量(Ms),共計847個測量數據。

圖2 波紋巴非蛤形態學測量參數示意圖Fig. 2 Diagram of morphological measurement parameters of Paratapes undulatas

1.3 分子遺傳學實驗方法

采用天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA,基因組DNA于4 ℃保存。本研究從已發表的波紋巴非蛤微衛星引物中篩選出10對擴增結果穩定且多態性較好的引物[10-12](表1),用于后續分析。

PCR反應體系為25 μL,包括17.15 μL雙蒸水、2.5 μL 10×PCR Buffer、1 μL模板DNA(50 ng/μL)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL反向引物、1 μL熒光標記的M13-R、0.1 μL含有M13-R的正向引物、0.25 μL Taq酶。PCR反應程序:95 ℃變性5 min;95 ℃ 45 s;退火(54～64 ℃)45 s;72 ℃ 45 s;循環30次;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。反應結束后,將PCR產物送青島派森諾基因科技有限公司進行基因分型[13-16]。

1.4 數據分析

1.4.1 形態學數據計算分析

將各性狀測量值處理成5個比例數據(Hs/Ls、Ws/Ls、Lh/Ls、Ms/Ls、Af/Ab)作為校正值對各群體的形態學差異進行計算分析。采用SPSS 13.0軟件計算和分析,利用聚類分析、主成分分析和判別分析等方法對4個群體的形態學特征進行比較。其中聚類分析采用歐式距離的最長距離系統聚類法;主成分分析將5個比例性狀計算得到兩個綜合性指標,即兩個互不關聯的主成分;判別分析對所有樣本進行逐個判別,計算判別準確率及綜合判別率[17-20]。

1.4.2 分子遺傳學數據分析

使用GeneMarker 2.2.0對熒光PCR基因分型數據進行讀取,并輔以人工矯正。使用PopGene軟件統計每個微衛星位點的等位基因數、多態信息含量指數、觀測雜合度以及期望雜合度[21]。使用F-stat 2.9.3軟件計算每對群體間遺傳分化指數,同時進行1 000次置換檢驗分析其顯著性[22]。使用Population 1.2軟件計算群體之間的遺傳距離,并使用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)基于遺傳距離構建系統發育樹[23]。使用LEA包對進行Structure分析[24]。通過BOTTLENECK 1.2.02軟件采用無限等位基因模型(IAM)、逐步突變模型(SMM)和雙相模型(TPM)3種模型檢測各群體是否經歷過瓶頸效應[25]。若等位基因頻率分布為L型,說明所檢測的群體近期沒有經歷過瓶頸效應事件。

2 結果與分析

2.1 形態學研究結果

2.1.1 形態參數測量比較

4個波紋巴非蛤群體的表觀形態特征參數測量結果如表2所示。對測量數據進行F檢驗表明:各群體除殼長外的6個度量形態特征均與殼長呈顯著正相關(P<0.01);且群體間各個度量形態特征數據差異顯著(P<0.01)。

表2 4個波紋巴非蛤群體各參數測量結果Tab. 2 Summary of measurements of various parameters of four Paratapes undulatas populations

2.1.2 聚類分析

對4個群體樣本的5個形態特征校正值進行聚類分析結果表明,北海與惠安群體形態特征最為接近,二者首先聚類,后與云霄群體聚類,而廈門群體則自成一支(圖3)。

圖3 波紋巴非蛤4個群體形態特征的聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of four Paratapes undulatas populations

2.1.3 主成分分析

對4個群體樣本的5個比例性狀進行主成分分析,得到兩個主成分PCI和PC2,由表3可知,:PC1的貢獻率為36.134%,PC2的為21.443%,二者累積貢獻率僅為57.577%。在PC1中,Ms/Ls的貢獻最大,第二為Ws/Ls;在PC2中 ,Hs/Ls和Af/Ab貢獻最大。這兩個主成分的累計貢獻率未達到85.0%,說明波紋巴非蛤不同群體間的形態差異難以用幾個相互獨立的因子來解釋。

表3 波紋巴非蛤形態特征的主成分的負荷值和貢獻率Tab. 3 Contribution and load of principal components on morphological characteristics of Paratapes undulatas

PC1與PC2的散點圖如圖4所示。由圖4可見4個群體中北海與惠安群體有較多的重疊區域,說明二者在形態參數上較為接近,云霄群體與廈門群體均獨立分布,較少與其余樣品重疊,區分明顯。該結果與聚類分析結果基本一致。

圖4 4個波紋巴非蛤群體的第一、二主成分的散布圖Fig. 4 Scatter diagram for PC1 and PC2 of four Paratapes undulatas populations

2.1.4 判別分析

利用逐步判別分析法篩選出5個性狀比例的特征值,建立4個群體的判別函數,5個變量X1、X2、X3、X4、X5分別代表Hs/Ls、Ws/Ls、Lh/Ls、Ms/Ls與Af/Ab。表3為判別函數的各項系數及常數項。4個群體的判別公式如下:

Y廈門=1 134.881X1+899.281X2+373.775X3

-207.158X4+185.212X5-587.362

(1)

Y云霄=1 141.218X1+871.409X2+389.677X3

-27.383X4+165.181X5-585.651

(2)

Y惠安=1 119.267X1+880.459X2+393.719X3

+144.492X4+167.024X5-597.905

(3)

Y北海=1 148.237X1+882.468X2+393.311X3

-42.030X4+165.234X5-592.944

(4)

判別分析結果如表4所示:判別準確率P1為43.3%～93.5%;判別準確率P2為44.8%～88.0%;4個群體的綜合判別率為 66.1%。

表4 波紋巴非蛤4個群體的判別分析結果Tab. 4 Discriminant results of four populations of Paratapes undulatas

2.2 分子遺傳學研究結果

2.2.1 遺傳多樣性

本研究采用10對微衛星分子引物對4個波紋巴非蛤群體96個個體進行遺傳多樣性分析。由表5可以看出,4個群體的遺傳差異較小,平均等位基因數范圍為6.40～6.60對,平均有效等位基因數范圍為3.18～3.51對,平均多態信息含量范圍為1.29～1.40,平均觀測雜合度范圍為0.39～0.50,平均期望雜合度范圍為0.62～0.70。

表5 波紋巴非蛤4個群體的遺傳多樣性參數Tab. 5 Genetic diversity parameters of four Paratapes undulatas populations

綜合各遺傳多樣性指數來看,4個群體中惠安群體的遺傳多樣性最高(平均期望雜合度為0.68,平均多態信息含量指數為1.40),云霄群體的遺傳多樣性最低(平均期望雜合度為0.62,平均多態信息含量指數為1.29)。

2.2.2 遺傳結構

4個波紋巴非蛤群體間的遺傳分化指數范圍為0.00～0.03,均呈現較低的狀態,表明各群體的遺傳分化水平較弱。群體間遺傳距離范圍為0.08～0.11,云霄群體與其余3個群體間的遺傳距離均為最低(0.08),廈門群體與北海群體間的遺傳距離最大,為0.11,廈門群體與惠安群體間的遺傳距離為0.09(表6)。

表6 波紋巴非蛤4個群體間遺傳分化指數與遺傳距離Tab. 6 Genetic differentiation index and genetic distance among four populations of Paratapes undulatas

基于4個波紋巴非蛤群體之間的遺傳距離構建NJ系統發育樹(圖5),可知北海群體首先與惠安群體聚類,再與廈門和云霄群體聚類,未檢測到與地理位置相對應的譜系結構。

圖5 基于遺傳距離構建的四個波紋巴非蛤群體NJ系統發育樹Fig. 5 NJ phylogenetic tree of four Paratapes undulatas populations based on genetic distance

2.2.3 自由交配估計

運用Structure軟件,根據等位基因頻率不相關假設(allele frequencies independent assumption)[26],進一步確認波紋巴非蛤群體遺傳結構。首先假設自由交配組群(K)可能為1～9,對每個假設自由交配組群進行50次獨立重復運算,最后使用最小二乘法估算出最佳自由交配組群(最小交叉熵值)為K= 1(圖6)。

圖6 波紋巴非蛤四個群體的交叉熵值Fig. 6 Cross entropy of four Paratapes undulatas population

2.2.4 瓶頸效應檢測分析

利用BOTTLENECK軟件檢測波紋巴非蛤4個群體近期是否經歷過瓶頸效應事件(表7)。首先基于IAM、TPM和SMM 3種不同模型進行Wilcoxon檢驗。結果顯示在TPM模型下,所有波紋巴非蛤群體均未出現偏離突變-漂變平衡的現象,而在IAM模型下北海群體存在偏離現象,在SMM模型下廈門與云霄群體出現偏離現象。其次,Mode shift檢驗結果顯示,4個群體的等位基因分布頻率均呈正常的L型分布。TPM是介于IAM和SAM之間的模型,其突變大多為逐步突變,TPM和SMM模型描述的位點突變模式更接近微衛星的突變機理,因此TPM模型更適合微衛星數據的分析[27]。綜上所述,4個波紋巴非蛤群體近期未經歷過瓶頸效應事件。

表7 基于3種模型的波紋巴非蛤4個群體的瓶頸效應檢測Tab. 7 Bottleneck effect detection of four Paratapes undulates populations based on three models

3 討論

3.1 4個自然種群波紋巴非蛤形態差異比較分析

貝類養殖已成為海洋經濟產業中重要的一環,其遺傳學相關研究也越來越受到生物學家的重視[28]。研究表明,在基因交流阻隔的情況下,同一種類生物的不同地理群體也會出現較明顯的遺傳差異[29]。我們分析了福建閩南地區及廣西北海地區的波紋巴非蛤地理群體的多種形態學參數,可知惠安與北海群體的形態差異最小,且與云霄、廈門群體之間均存在著一定的形態差異。這種差異一方面可能是由地理因素、環境條件決定的,但聚類分析與主成分分析結果均表明惠安地區與北海地區的差異遠比云霄和廈門小。造成這一結果的原因可能是惠安大港灣近岸海域近年來大量引進北海地區波紋巴非蛤種苗,從事水產增養增殖活動。這些人為商業活動可能使群體間種質交叉增多,向當地自然海區釋放,從而大大增加了群體間基因雜交的概率[30]。另外,形態差異除了種質本身的特性外,與餌料種類、水文水質、底質類型等因素也有較大關系[31-32]。

3.2 4個自然種群波紋巴非蛤分子遺傳學比較分析

傳統的貝類遺傳學研究集中在其形態指標上,但形態參數可能存在誤差,并不能完全準確地反映物種的群體特性,因此需要結合分子生物學方法,獲得更加真實穩定的遺傳學研究結果[33]。我們用分子生物學手段調查了福建閩南地區及廣西北海的波紋巴非蛤群體樣本,其遺傳多樣性均呈現較高的水平(多態信息含量指數>0.5),與駱軒等的研究結果[10]基本持平,說明波紋巴非蛤群體仍具有較高的環境適應能力和進化潛力。波紋巴非蛤能維持如此高的遺傳多樣性,除了與其有大量的有效補充群體外,還與其未經歷過瓶頸效應有關。3種突變模式對波紋巴非蛤的瓶頸效應檢驗均未發現雜合過?，F象,等位基因頻率均呈正常的L型分布,在群體擴張的過程中等位基因丟失的概率較小,較多的遺傳突變得以保存[34]。隨著波紋巴非蛤資源的不斷破壞和國內外需求的不斷增加,養殖無法僅依靠海區捕撈的天然苗種得到滿足,人工繁育大量興起[35]。在后期養殖過程中,波紋巴非蛤作為主要的海水養殖貝類在不同養殖區間被頻繁的人為引種、貿易及增殖放流。而在形態學和分子遺傳學聚類分析時,發現廈門群體均獨立形成一支,遺傳分化指數和遺傳距離廈門群體也略高于其他群體,這可能與廈門海域有不少國家級自然保護區,禁止捕撈和灘涂養殖,該群體可能保留了更多的原始遺傳信息有關。

4 結論

本研究中4個波紋巴非蛤群體間遺傳分化微弱,自由交配估計檢驗也顯示所有群體為1個自由交配組群;NJ系統發育樹聚類結果未檢測到與地理位置相對應的譜系結構。相較于沿岸流輸送波紋巴非蛤浮游期幼蟲進行群體間的基因交流,不同地區間的人為引種、貿易及增殖放流等活動可能是造成波紋巴非蛤不同種群間基因頻繁交流的主要原因,其中廈門群體則保留了更多的原始遺傳信息。綜合形態學和分子遺傳學結果來看,在滿足養殖需求的前提下,仍需要保護本地波紋巴非蛤的種質資源,防止外來群體的“生態入侵”。