高效液相色譜-高分辨質譜法快速篩查動物源性藥食同源產品中32 種抗生素獸藥殘留

周雪莼，胡婷婷，王佳慧，白 靜，楊 穎，侯 宇，張 哲*，張 勛*

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，長春 130117；2.長春海關技術中心，長春 130062；3.吉林省吉測檢測技術有限公司，長春 130117）

“藥食同源”產品是以國家頒布的藥食同源目錄生產的保健食品[1-2]，介于保健品與藥品之間，既有藥品的治療又有食品的安全穩定性[3-5]。吉林省動物源性藥食同源特色產品包括：鹿胎膏、蜂蜜、鹿茸等產品。近年，“藥食同源”產品的需求日益增多，但這些產品很多在生產、儲存、運輸過程中抗生素類獸藥殘留嚴重[6-7]，這對食用這些產品的人們健康造成巨大危害[8-11]，并且缺乏可靠的快速檢測技術手段。建立一種獸藥抗生素藥物殘留的分析方法是非常必要的。

目前，動物源性藥食同源產品中殘留抗生素類獸藥常用的檢測技術主要有微生物抑制檢測法[12]、免疫分析法[13-14]、高效液相色譜法[15]、傳感器檢測法[16]、薄層色譜法[17]、近紅外光譜法[18]、液相色譜-質譜法等[19-22]。但是上述方法依然存在操作復雜、耗時長、假陽性率高等問題，限制了其在快速檢測中的發展和應用[23-26]，高分辨質譜具備靈敏度高、準確度高、檢測速度快及假陽性率低等特點[27-29]，彌補了上述方法的劣勢，填補了動物源性藥食同源產品中抗生素類獸藥快速篩查數據庫的空白，尤其在無標準品的情況下能同時對大量樣品中的多種或多類別待測物質進行高通量非靶向篩查確證，為動物源性藥食同源產品中抗生素類獸藥的快速篩查提供了新方法。本研究選取了吉林省生產經營過程中使用頻率較高的β-內酰胺類、林可酰胺類、大環內脂類、硝基咪唑類、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類7 類共32 種抗生素獸藥進行研究，并建立了對具有吉林省特色的鹿胎膏、蜂蜜和鹿茸樣品基質為代表的動物源性藥食同源特色產品32 種抗生素類獸藥殘留的快速前處理技術、基于高效液相色譜-高分辨質譜法高效篩查庫，在缺乏標準品的條件下，快速準確篩查抗生素類獸藥殘留，為動物源性藥食同源產品的質量控制和監管提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑 Dionex Ultimate 3 000 RSLC-Q-Exactive型靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、Hypersile Gold C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、Trace Finder 2.5 軟件系統；Syncore 型天平（0.01 g，瑞士Precisa 公司）；TurboVap II 型氮氣濃縮儀（美國Organomation公司）；AS10200-10L型超聲波清洗器（天津，奧特賽恩斯儀器有限公司）；Allegra X-22R 型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）。

鹿茸、鹿胎膏和蜂蜜均來自于長春海關技術中心的待檢測樣品。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（質譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；PRiME HLB 固相萃取柱（美國Waters 公司）； 氨芐青霉素、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢匹林、林可霉素、克林霉素、紅霉素、交沙霉素、螺旋霉素、甲硝唑、氟甲喹、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、洛美沙星、麻保沙星、丹諾沙星、雙氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星、環丙沙星、苯甲?；前?、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、氟苯尼考32 種獸藥標準品（純度均≥95%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。實驗用水為Millipore 系統制造的高純水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 標準溶液的配置 用甲醇對32 種抗生素獸藥的混合標準溶液進行稀釋，配置濃度為10 ug/mL、20 ug/mL、100 ug/mL 的混合標準溶液，避光保存。作為建立標準譜庫及方法學考察的標準工作液。

1.3 樣品的制備與保存 鹿茸：將樣品（不少于200 g）置于高速粉碎機中研磨粉碎后過80 目篩，混合均勻后標記，置于常溫下密封保存。蜂蜜和鹿胎膏：置于常溫下密封保存。

1.4 樣品的前處理

1.4.1 樣品的提取 選用不同比例的乙腈-水和甲醇-水混合溶液對樣品進行提取，每組設定3個平行試驗，其提取步驟如下：用天平分別準確稱取待測樣品2.00 g，加入1 mL 純水浸潤樣品（蜂蜜、鹿胎膏用溫水攪拌至完全化開），分別加入10 mL 乙腈、75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水溶液、甲醇、75%甲醇-水、45%甲醇-水溶液后，旋渦震蕩1 min，超聲波清洗器萃取20 min，10 000 r/min 離心5 min 后，待凈化。

1.4.2 樣品的萃取 設定不同超聲萃取時間對樣品進行萃取，每組設定3 個平行試驗，步驟如下：準確稱取2.00 g 鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜樣品，分別向其中添加0.01 mg/kg 的32 種獸藥的混合標準溶液，按照1.4 方法處理，并分別超聲提取5、10、20、30、40 min。

1.4.3 樣品的凈化 取超聲后上清液直接加載到PRiME HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL 或相當者）上，無需活化和平衡，保持每秒1 滴的流速，收集全部流出液。取5.00 mL 流出液氮吹至體積小于0.5 mL，氮吹期間溫度為40℃，將得到的液體用10%甲醇水溶液定容至1.00 mL，過0.22 μm 微孔濾膜（尼龍）后用于分析測定。

1.5 HPLC-MS 條件

1.5.1 色譜條件 采用Hypersile Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）； 流動相：水相（A）為含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸水溶液；有機相（B）為甲醇，其中進樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min，柱溫為30℃。色譜流動相的洗脫梯度表，見表1。

表1 色譜流動相的洗脫梯度表

1.5.2 質譜條件 質譜的離子源參數： 噴霧電壓（+）為3 200 V，離子傳輸管溫度為325℃，鞘氣為40 arb，輔助氣為10 arb，探針加熱器溫度為350℃，S-透鏡射頻水平為60 V。質譜掃描參數： 掃描模式為Full MS-ddMS2，全掃描范圍為80 ～1 000 m/z，分辨率為70 000，Full MS，17 500，MS/MS，自動增益控制為1e6，Full MS，2e5，MS/MS，循環次數： 6，MSX 計數：1，隔離寬度為2.0 m/z，碰撞能量分別為20、40、60 V，壓縮比率為1%，頂點觸發為2 ～6 s，動態排除為8 s。

1.6 標準分析數據庫篩查設置 采用高效液相色譜-靜電場軌道肼高分辨質譜對配制的32 種化合物的標準物質溶液（1 mg/L）在Full MS-ddMS2Scan 模式下對目標化合物進行一級質譜全掃描，通過高分辨質譜獲得32 種化合物的分子量、保留時間、碎片離子等信息建立一級標準譜庫。采用Trace Finder 2.5數據庫篩查方法，設置方法：1）加載數據庫（含32 個化合物，包含化合物名稱、分子式、分子量、保留時間、碎片離子等信息）。Method Development →Compound Database →打開“pesticides database”；2）加載篩查方法：Method Development →Method View →打開“pesticides screening”；3）在篩查方法pesticides screening 中勾選數據庫pesticides database，保存，建立batch，分析數據發現其母離子強度達到設定閾值（1×106）時，自動觸發二級質譜掃描，同時得到母離子的精確質量數以及二級質譜的全掃描信息。采用20 eV、40 eV、60 eV 三個碰撞能量對化合物進行碎裂，得到一張碎片離子信息豐富的加和圖。由于化合物峰形較窄，為避免出現二級離子打不到的情況，根據峰寬肩動態排除時間設置為3 s。獲得二級譜圖后利用軟件計算碎片離子的分子量，與相應抗生素類獸藥的相關信息關聯，最終完成32 種抗生素類獸藥的色譜庫和質譜圖的譜庫構建。

1.7 實際樣品的篩查測定 參考歐盟評分制方法指南篩查樣品中目標物質是否存在，同時進行數據庫驗證。準確稱量鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜3 種樣品，分別作為空白陰性樣品（不含有待測目標化合物）10 份、陽性添加樣品各20 份（對鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜樣品添加上述32種獸藥標準品的混合溶液，添加濃度為0.01 mg/kg），按照實驗方法篩查待測的32 種抗生素獸藥。假陽性率（%）、假陰性率（%）按照下面公式。1）假陽性率=（獲得篩查陽性結果的陰性樣品數/陰性樣品總數）×100%；2）假陰性率=（獲得篩查陰性結果的陽性樣品數/陽性樣品總數）×100%。

依據歐盟SANTE 11813/2017 法規要求，對目標物樣品進行一級全掃描，根據所建立的譜庫數據定性分析依據保留時間、母離子精確質量數和一個碎片離子精確質量數（或兩個母離子精確質量數）。在相同條件下，樣液中待測化合物保留時間與譜庫中保留時間的相對偏差≤±2.5%（且不超過0.5 min）或≤0.2 min，所監測定性離子的信噪比S/N ≥3，母離子精確質量數與理論質量數的相對偏差≤5 ppm（1×10-6），一個二級碎片離子精確質量數的相對偏差≤10 ppm，則可以初步判斷實驗中含有該種化合物。在空白樣品中添加篩查濃度標準溶液，作為質控樣品。樣品中目標化合物檢測濃度大于等于方法篩查限時判定為陽性結果。

2 結果

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 本研究分別對不同比例的乙腈-水和甲醇-水混合溶液進行了考察，使用甲醇為提取溶劑時，提取率不高僅為46%～58%，且提取液中含有較多雜質，用乙腈及乙腈-水混合溶液作為提取溶劑時，一方面能保證較高的待測物提取率，另一方面，乙腈極性大、穿透力強，可有效沉淀樣品中的大量蛋白質及其他非極性磷脂類干擾物，盡可能地減少在測定過程中的基質干擾，故最終選用乙腈作為提取溶劑。隨即對比100%乙腈、75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水溶液的提取效果，結果表明，使用75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水為提取溶劑時，提取率范圍約為54%～66%、46%～52%、35%～43%、26%～32.5%。并且隨著體系中水的占比不斷升高時，溶液在濃縮步驟處于比較難于懸至近干的狀態。當用100%乙腈進行提取時，待測物的提取率范圍為77%～84%，提取液較澄清且得到的色譜圖中未知物的雜峰數量有所減小，基本不影響32種待測物的檢測，故最終選用100%乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 超聲時間的選擇 超聲波具有極端的物理特性，其機械效應、空化效應及熱效應等能夠對物質能產生很強的破壞作用，能促使細胞組織破壁變形[30]，可有效提高提取效率。因此，本研究比較了超聲處理5、10、20、30、40 min 的提取效率。準確稱取一定量的鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜，分別向其中添加0.01 mg/kg水平的32 種獸藥的混合標準溶液，按照1.4 方法處理，并分別超聲提取5、10、20、30 和40 min。結果顯示，當超聲提取5 min、10 min 時，提取率范圍約為28%～39%和48%～62.5%，當超聲提取20 min 時，32 種獸藥的提取率均能夠達到最高，提取率范圍約為76%～85%，20 min 后，提取時間的延長對32 種獸藥的提取率的影響已不顯著，當超聲提取30 min、40 min時，提取率范圍約為77%～85%和78%～86.5%，故最終確定超聲提取時間為20 min。

2.2 HPLC-HRMS 條件的優化 本研究比較了2 組不同流動相的分離效果：流動相A 為純水和含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動相B 為甲醇、乙睛及含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸的水溶液。結果表明，在流動相中加入5 mmol/L 乙酸銨溶液可以流動相能夠保持一定的離子強度，以改善峰形，減少峰拖尾。使用甲醇為流動相B 時，待測物的響應強度更高，峰型更好，而且鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜中基質復雜，甲醇能更好地洗脫，減少污染，延長了儀器和色譜柱的使用壽命。雖然采用甲醇時柱壓較乙腈高，但對目標物響應值更高。

2.3 篩查數據庫的建立 配制混合標準溶液，依據建立好的色譜條件（1.5.1）和質譜條件（1.5.2）進樣，準確輸入32 種抗生素獸藥的英文、CAS 號、中文名稱及化學式，由高分辨質譜數據庫構建軟件Trace Finder 2.5 計算得到每種化合物的理論質量數。而后在采用數據依賴性二級質譜掃描（ddms2）的同時使用動態排除模式，當列表中的母離子響應強度達到設定閾值，自動采集二級數據；在三個碰撞能量下（20/40/60eV）對目標物進行碰撞，加和獲得二級譜圖，利用軟件計算主要二級碎片精確分子量，與相應化合物的保留時間、精確質量數測定值、中英文名稱、CAS 號、分子式等信息相關聯，最終完成32種抗生素類獸藥的譜庫構建，見表2。

表2 32 種抗生素類獸藥的分子式、保留時間、母離子和特征碎片離子質量

2.4 定性方法 按照歐盟SANTE 11813/2017 法規，定性分析依據化合物的保留時間、母離子精確質量數和一個碎片離子精確質量數（或2個母離子精確質量數）。在相同條件下，樣液中待測化合物保留時間與譜庫中保留時間的相對偏差≤±2.5%（且不超過0.5 min）或≤0.2 min，所監測定性離子的信噪比S/N ≥3，母離子精確質量數與理論質量數的相對偏差≤5 ppm（1×10-6），一個二級碎片離子精確質量數的相對偏差≤10 ppm，則可以初步判斷實驗中含有該種化合物。在空白樣品中添加篩查濃度（0.01 mg/kg）混合物標準溶液作為質控樣品。樣品中目標化合物檢測濃度大于等于方法篩查限時判定為陽性結果。利用Tract Finder 2.5 軟件對化合物定性篩查，符合設定范圍的樣品即為陽性樣品。實驗條件相同時，如果色譜峰的保留時間與數據庫相對應，扣除背景后的質譜圖所選擇的離子及其相對豐度與數據庫相對應，則可證明樣品中存在這種抗生素類獸藥或與之相關的其他化學物質。

2.5 實際樣品的測定驗證 鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜所有陰性樣品的假陽性率均為0，在檢測鹿胎膏中殘留的喹諾酮類藥物環丙沙星時，假陰性率為5%。經5 家單位技術人員進行驗證實驗，即對鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜樣品添加上述32 種獸藥標準品的混合溶液，添加濃度為0.01 mg/kg，經驗證結果表明，上述32 種抗生素獸藥在樣品中均被定性檢出，準確率為100%。說明本方法準確率高、靈敏度較好，適用于7 類共計32 種抗生素獸藥的同時快速篩查。

3 小結

本研究通過優化樣品的前處理方法及色譜和質譜條件，建立了同時檢測動物源性藥食同源產品（鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜）中32 種抗生素類獸藥殘留的快速篩查方法。通過簡便的樣品前處理方法，無需標準品即可實現7 類共32 種獸藥殘留的同時篩查，而且能夠滿足法規限量要求的靈敏度。假陽性率和假陰性率滿足《食用農產品化學物質殘留高通量篩查方法確認與檢測質量控制指南》中對于篩查方法的性能要求，實際樣品經5 家單位的實驗驗證后，準確率為100%，檢出限為0.01 mg/kg。這使得動物源性藥食同源產品的多殘留分析檢測效率邁向了新的臺階，對動物源性藥食同源產品的安全質量監管提供了重要的成熟篩查技術手段。若想更進一步研究動物源性藥食同源產品中的獸藥殘留，還需不斷補充獸藥種類，進而為動物源性藥食同源產品的安全保證提供有力支撐。