基于指紋圖譜結合化學模式識別對接骨草的質量評價

文 陽，海來約布，蔡曉霞，地久此呷，蘭建龍，曲別軍長，馬 權，劉 圓,3,4，李文兵,3,4*

1. 西南民族大學，四川 成都 610041

2. 四川中醫藥高等專科學校，四川 綿陽 621000

3. 四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225

4. 青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225

5. 新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830054

接骨草又名陸英，為忍冬科接骨木屬植物接骨草SambucusjavanicaBlume.的干燥全草，具有疏肝健脾、活血化瘀、利尿消腫的功效，用于急性病毒性肝炎，腎炎水腫，跌撲損傷，骨折[1]。接骨草最早以陸英之名在《神農本草經》中記載：“主骨問諸痹，四肢拘攣疼酸，膝寒痛”[2]。說明其最早用于治療骨科疾病，與現代羌醫臨床用于治療骨傷骨病一致。其資源非常豐富，廣泛分布于我國各地山坡、林下、溝邊和草叢中[3]。

近年來，國內外學者對接骨草開展了較為廣泛的研究，但多集中在化學成分和藥理活性，對于其質量評價研究較少。現代研究表明，接骨草化學成分主要有黃酮類、苯丙素類、甾體類、酚酸類及揮發油類成分[4-8]。《衛生部藥品標準中藥材第一冊》（1992 年版）收載接骨草標準（陸英），但僅有簡單的性狀描述，缺乏含量測定項，難以全面控制和評價藥材的質量。本研究以不同產地17 批接骨草為研究對象，通過HPLC 指紋圖譜對接骨草主要化學成分進行宏觀整體表征，并結合化學模式識別譜對指紋圖譜中提取共有峰的面積進行分析，從而得到影響不同產地質量的特征化學成分并進行含量測定，擬為接骨草質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），ME-104/02 型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），ME-55/02 型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），XP26 型百萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司），KQ300DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），1810D 型摩爾超純水器（重慶摩爾水處理設備有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸（批號MUST-21070910，質量分數≥99.60%）、新綠原酸（批號MUST-21030108，質量分數≥99.67%）、隱綠原酸（批號MUST-21082610，質量分數≥99.88%），均購于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

17 批接骨草藥材分別采自于四川省成都市、阿壩州和西藏自治區林芝市，經西南民族大學青藏高原研究院劉圓教授鑒定為忍冬科接骨木屬植物接骨草S.javanicaBlume.的干燥全草，信息見表1。

表1 接骨草樣品來源信息Table 1 Sample information of S. javanica

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent C18（150 mm×4.6 mm，4 μm）色譜柱，流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～11 min，90%～82% B；11～30 min，82%～80%B；30～35 min，80%～90% B；檢測波長為327 nm，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μm。

2.2 供試品溶液的制備

取接骨草粉末（過三號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，回流提取30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別取新綠原酸5.09 mg、綠原酸5.04 mg、隱綠原酸5.30 mg 對照品，精密稱定，置于5 mL 量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，得混合對照品母液，質量濃度分別為1.018、1.008、1.060 mg/mL；再精密量取母液1 mL，置于5 mL 量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，制得含新綠原酸0.203 6 mg/mL、綠原酸0.201 6 mg/mL、隱綠原酸0.212 0 mg/mL 的混合對照品。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察 取同一接骨草供試品（S1），按“2.2”項下方法制備供試品溶液一份，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，以綠原酸（3 號峰）為參照峰（S），計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積。各特征峰的相對保留時間RSD 值分別為0.06%、0.05%、0.08%、0.10%、0.07%、0.09%、0.12%、0.07%，各特征峰的相對保留峰面積分別為0.25%、0.96%、0.32%，1.43%、1.23%、0.79%、1.86%、0.88%均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性考察 取同一接骨草供試品（S1），按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，以綠原酸（3 號峰）為參照峰（S），計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積。各特征峰的相對保留時間RSD 值分別為0.09%、0.07%、0.03%、0.06%、0.08%、0.08%、0.09%、0.10%，各特征峰的相對峰面積RSD 值分別為0.35%、0.89%、0.11%、0.81%、1.01%、1.89%、1.42%、1.43%均小于2%，表明重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一接骨草供試品（S1），按“2.2”項下方法制備供試品一份，按“2.1”項下色譜條件分別于配制后0、4、10、14、24 h 進樣，以綠原酸（3 號峰）為參照峰（S），計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積。各特征峰的相對保留時間RSD 值分別為0.06%、0.06%、0.03%、0.03%、0.03%、0.04%、0.04%、0.04%，各特征峰相對峰面積RSD 值分別為0.88%、1.14%、1.19%、0.69%、1.11%、1.26%、1.36%、1.85%，均小于2%，表明穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

取17 批不同產地接骨草藥材按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣并記錄色譜數據，將所得的17 批接骨草色譜圖以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.1 版本）”，設S6 為參照峰多點校正得到接骨草樣品的指紋圖譜（圖1），并進行相似度評價。17批接骨草指紋圖譜的共有峰有9 個，通過對照品圖譜對比，指認其中3 個色譜峰，見圖2，即1 號峰為新綠原酸、2 號峰為綠原酸及3 號峰為隱綠原酸。2 號峰峰面積較大，峰形與分離度較好，故選擇2 號峰（綠原酸）為參照峰（S），計算共有峰相對保留時間RSD%均小于0.5%，但共有峰相對峰面積為44.68%～136.11%，差異較大，表明17 批接骨草藥材中9 個化合物之間含量差異較大，相對峰面積結果見表2。以接骨草藥材指紋圖譜為對照，17 批接骨草藥材的相似度為0.926～0.998，相似度均大于0.9，說明不同接骨草藥材批次整體相似度較高，相似度評價見表3。

圖1 17 批接骨草藥材的HPLC 指紋圖譜Fig. 1 UPLC fingerprints of 17 batches of S. javanica

圖2 混合對照品 (A) 和樣品 (B) HPLC 色譜圖Fig. 2 HPLC of reference substance (A) and samples (B)

表3 17 批接骨草藥材相似度評價結果Table 3 Results of similarity evaluation of 17 batches of S.javanica fingerprints

2.6 基于化學模式識別對接骨草藥材的分析

2.6.1 聚類分析（cluster analysis，CA） 利用SPSS.26.0 軟件以接骨草指紋圖譜標定的9 個共有峰的峰面積為變量，對17 批接骨草藥材數據進行聚類分析，采用最遠鄰元素的聚類方法，以平方歐式距離為樣品間距離進行聚類分析，結果見圖3。當分類距離15 時，顯示17 批樣品共聚為3 類，其中來自成都市雙流區黃甲鎮產地的S10 單獨聚為一類為，S6（汶川縣臥龍鎮三圣溝）、S9（汶川縣臥龍鎮三家寨）、S13（黑水縣達古冰川）聚為一類，其余成都產地、汶川產地、黑水產地、全部茂縣產地和西藏產地聚為一類。

圖3 17 批接骨草藥材聚類分析樹狀圖Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis of 17 batches of S.javanica

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SPSS.26.0 軟件對17 批接骨草的9 個共有峰峰面積進行降維標準化處理，計算相關系數載荷矩陣、特征值和累積方差貢獻率，結果顯示KMO 值為0.533＞0.5，代表各變量相關性較好，以主成分特征值＞1 為提取標準，提取得到3 個主成分（L1、L2 和L3），主成分累積方差貢獻率為77.643%，結果見表4，能基本反映樣品共有峰的信息，以主成分因子變量繪制公因子碎石圖，結果顯示特征值較高的3 個主成分因子的斜率更大，說明所提取的3 個主成分可以最大程度地代表接骨草藥材的整體質量特征。因此可將這3 個主成分作為接骨草藥材的評價指標。初始因子載荷矩陣，見表5，將其進行正交旋轉，旋轉后得到的9 個共有峰成分在3 個主成分中的旋轉矩陣，反映了各變量對主成分的貢獻大小，其絕對值越大對該成分在決定樣品區分中的作用越大。載荷矩陣結果表明主成分1 信息主要來自3 號峰（綠原酸）、5 號峰、9 號峰，主成分2 信息主要來自1 號峰（新綠原酸）、4 號峰（隱綠原酸），主成分3 信息主要來自7 號峰。并根據主成分載荷矩陣，計算3 個主成分得分，3 個主成分得分表達式：L1＝?0.079X1＋0.023X2＋0.546X3＋0.157X4＋0.518X5＋0.197X6＋0.119X7－0.075X8＋0.315X9；L2＝0.716X1＋0.454X2＋0.190X3＋0.371X4＋0.242X5＋0.006X6＋0.187X7＋0.447X8－0.004X9。L3＝0.033X1－0.014X2－0.014X3＋0.119X4－0.014X5＋0.042X6＋1.396X7＋0.689X8＋0.350X9。將17 批樣品各特征向量標準化，代入主成分得分表達式中計算主成分得分，再以每個主成分所對應的貢獻率占所提取主成分總的貢獻率之和的比例作為權重計算主成分綜合模型[9]：L綜＝0.220X1＋0.098X2＋0.325X3＋0.226X4＋0.330X5＋0.103X6＋0.362X7＋0.240X8＋0.209X9，3 個主成分得分及綜合得分情況見表6，其中S10 綜合得分為2.866 遠高于其他批次，可單獨聚為一類；S6、S9 和S13 綜合得分均大于1 而小于2，將該3 批聚為一類；S2～S5、S7～S9、S11～S12、S14～S17 綜合得分均為小于1，因此將該13 批樣品聚為一類，這與聚類分析結果一致。根據綜合得分可知，其值越大表明峰面積相對越大，說明藥材含量相對含量越高[10]，可知S10 批次含量最高，S6、S9 和S13 批次次之，然后為S1、S8、S11 批次，S2～S5、S7、S9、S12、S14～S17 樣品批次排最后。

表4 特征值及累積方差貢獻率Table 4 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

表5 初始因子載荷矩陣Table 5 Initial factor load matrix

表6 主成分得分和綜合得分Table 6 Principal component score and comprehensive score table

用SIMAC14.1 軟件對17 批接骨草藥材樣品進行主成分分析，以指紋圖譜中的9 個共有峰峰面積為變量，以此構建17×9 的原始數據矩陣，繪制17 批不同產地接骨草樣品的PCA 得分圖，見圖4，結果顯示3 個主成分能反映不同產地接骨草的主要特征，說明不同產地接骨草在化學成分含量上存在一定差異。

圖4 接骨草PCA 得分散點圖Fig. 4 PCA scores of S. javanica

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 為了進一步區分不同產地的接骨草組內質量差異，將17 批樣品9 個共有峰峰面積導入SIMAC14.1 軟件進行OPLS-DA 方法分析，建立OPLS-DA 模型，見圖5，結果顯示17 批接骨草樣品被分為3 類，與聚類分析和主成分分析結果一致，結合OPLS-DA 模型中變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）（圖6）進行分析,以VIP＞1 為條件篩選出差異標志物，篩選出4 個差異標志物，對接骨草樣品的影響程度依次為3 號峰（綠原酸）＞4 號峰（隱綠原酸）＞5 號峰（未知）＞1 號峰（新綠原酸），其對應的VIP 值依次為1.155、1.152、1.093、1.086，見表7，說明綠原酸（3 號峰）、隱綠原酸（4 號峰）、5 號峰及新綠原酸（1 號峰）是不同產地的接骨草有的差異標志物。

圖5 接骨草樣品OPLS-DA 得分圖Fig. 5 OPLS-DA scores of S. javanica

圖6 17 批接骨草樣品的OPLS-DA 的VIP 圖Fig. 6 VIP value from OPLS-DA load diagram of 17 batches of S. javanica

表7 接骨草各成分VIP 值Table 7 VIP values of each component of S. javanica

2.7 接骨草差異特征成分的含量測定

采用指紋圖譜結合CA、PCA 及PLS-DA 對不同批次的接骨草樣品進行研究分析，通過PCA 可知3 號峰（綠原酸）、5 號峰、9 號峰，1 號峰（新綠原酸）、4 號峰（隱綠原酸）以及7 號峰是影響不同批次接骨草樣品質量的特征化學成分。由PLS-DA 結果可知VIP＞1 的有3 號峰（綠原酸）、4 號峰（隱綠原酸）、5 號峰及1 號峰（新綠原酸），表明不同批次間的含量差異較大，是接骨草的差異性特征成分，基于劉昌孝院士[11-13]提出的于質量標志物（quality marker，Q-Marker）的五大原則既有效性、特有性、傳遞性與溯源性、可測性，推測5 號峰不適合作為接骨草質量標準控制的特征指標。綜上，本實驗以綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸作為接骨草差異特征成分進行含量測定。

2.7.1 線性關系考察 取新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸混合對照品5 mL，用50%甲醇逐級稀釋2 倍成6 個對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的峰面積，繪制標準曲線，計算線性回歸方程及相關系數（r），結果見表8。

表8 對照品的線性方程、相關系數和線性范圍Table 8 Linear equation, correlation coefficient and linear range of reference substance

2.7.2 精密度試驗 取混合對照品一份，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積的RSD值分別為1.07%、0.26%、0.27%，結果顯示儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗 取接骨草（S1）樣品按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸質量分數的RSD 值分別為0.54%、0.43%、0.44%，結果表明該方法的重復性良好。

2.7.4 穩定性試驗 按“2.2”項下方法制備供試品一份，按“2.1”項下色譜條件分別在0、4、10、14、24 h 進樣，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積的RSD 值分別為0.73%、2.23%、1.01%，表明供試品24 h 內穩定。

2.7.5 加樣回收率試驗 精密稱S1 樣品0.25 g，共6 份，分別加入一定量的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品，按“2.1”項下色譜條件進樣，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的加樣回收率分別為95.26%、96.68%、98.07%，RSD 分別為1.52%、1.31%、0.99%。

2.7.6 樣品含量測定 取17 批接骨草樣品，按“2.2”項下方法制備供試品，按“2.1”項下色譜條件，進樣分析，測定17 批樣品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量，結果見表9，接骨草藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸平均質量分數分別為0.034%、0.190%、0.036%。

表9 17 批接骨草樣品中差異特征成分的含量Table 9 Contents of Q-Markers in S. javanica

3 討論

本實驗考察了不同提取溶劑（水、乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇和30%甲醇）、不同提取時間（15、30、45、60 min）、不同提取方法（超聲、回流）、不同料液比（1∶20、1∶40、1∶60）對接骨草藥材指紋圖譜色譜圖及含量測定的影響，結果發現：提取時間、提取方法及料液比對接骨草指紋圖譜色譜圖及含量測定無明顯改變，而50%甲醇提取的色譜峰較多新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸含量較高。故選擇料液比為1∶20，50%甲醇超聲提取30 min 為最佳提取方法。同時在《中國藥典》2020 年版和文獻的洗脫方法基礎上進行優化，考察了甲醇-純水、乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脫2 種流動相體系，結果發現以乙腈-0.2%磷酸水為流動相時，樣品的分離度最佳，故選擇乙腈-0.2%磷酸水作為流動相；通過全波長掃描，比較不同波長色譜圖，發現在327 nm 處色譜峰目標成分分離度最佳，故選擇327 nm 作為接骨草藥材指紋圖譜的檢測波長。

綜上，本實驗采用指紋圖譜結合相似度評價、CA、PCA、PLS-DA 分析對不同產地接骨草藥材進行質量評價研究，篩選出特征性指標成分并進行定量分析。利用HPLC 建立了17 批接骨草藥材指紋圖譜有9 個共有峰，指認了其中3 個特征峰，分別為新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸。相似度表明 17 批接骨草藥材的相似度均大于0.9，說明不同接骨草藥材批次整體相似度較高。在聚類分析中，將17 批樣品聚成3 類，既S10為單獨一類，S6、S9、S13 聚為一類，其余13 批次聚為一類。PCA 和OPLS-DA 與CA 結果一致，表明17 批接骨草樣品化學成分既有相似性又有差異性，采用OPLS-DA 模型VIP 值篩選出綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸是接骨草的差異性特征成分。研究表明綠原酸具有調控成骨細胞增殖和分化的能力，也可促進成骨細胞的增殖，抑制成骨細胞堿性磷酸酶活性，從而具有一定的成骨活性，是接骨草的成骨活性成分之一[14]，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸具有治療免疫性關節炎的作用[15]，與接骨草的接骨功效有一定關聯性。結合化學模式識別對指紋圖譜中提取共有峰的面積進行分析，并基于中藥Q-Marker 的“五大原則”，推測綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸為接骨草藥材的 QMarkers，為接骨草藥材質量評價及臨床應用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突