黃酮類化合物抗骨關節炎機制研究進展

楊泓毅，林龍飛，劉宇靈，李 慧,4,5*，黃璐琦

1. 江西中醫藥大學 院士工作站，江西 南昌 330004

2. 中國中醫科學院中藥資源中心，北京 100700

3. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700

4. 中國中醫科學院中醫藥健康產業研究所，江西 南昌 330006

5. 江西中醫藥健康產業研究院，江西 南昌 330000

骨痹又稱骨關節炎（osteoarthritis，OA），是一種常見退行性關節疾病，尤其多發于膝、髖、手和足等關節。中國目前骨關節炎患病率已達到每10 萬人9 337.15 例，相較于1990 年的患病率，增長率達到了113.53%[1]，骨關節炎在不同程度上影響患者的生活質量，并具有高致殘率的特點。目前產生骨關節炎的原因仍有待明確，多使用非甾體抗炎藥及透明質酸制劑進行保守治療，但現有的治療方法無法逆轉骨關節炎的發展。骨關節炎的發病可能與關節損傷、年齡、家族遺傳、肥胖以及性別相關，是一種多因素導致的全關節疾病。與骨關節炎相關的病理檢查結果包括關節軟骨的破壞以及關節間隙狹窄、滑膜炎、軟骨下骨硬化和囊腫形成[2]。隨著中國老齡化程度的加深，未來骨關節炎患病人群將會不斷增加。

黃酮類化合物是以色酮環和苯環為基本母核的一類化合物的總稱，是廣泛存在于植物內的次生代謝產物?，F代藥理學研究表明黃酮類化合物具有抗炎[3]、心臟保護作用[4]、抗癌[5]、抗菌[6]、抗抑郁[7]等多種藥理作用。黃酮類化合物可以調節疾病過程中的各種分子靶點和信號通路，在預防和治療骨關節炎中發揮積極作用。黃酮類化合物治療骨關節炎的主要作用機制包括抑制炎癥介質、抑制軟骨降解和凋亡、促進軟骨細胞增殖和基質合成以及調節氧化應激等。近年來黃酮類化合物抗骨關節炎的研究取得了一定進展，但仍需要更多的研究來充分證明黃酮類化合物在骨關節炎中的作用機制，并為其臨床應用提供參考。

目前黃酮類化合物在骨關節炎發病機制及臨床治療中的作用和價值尚不明確，因此本文綜述黃酮類化合物抗骨關節炎機制的研究進展，探討其防治骨關節炎的潛力。

1 抑制炎癥反應

骨關節炎患者經常出現滑膜炎的癥狀，表現為滑膜增生和滑膜內層低度炎癥浸潤以及血管的生成[8]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6是骨關節炎出現的主要促炎細胞因子，在關節軟骨退化的過程中起著重要作用[9-10]。IL-1β 由關節中軟骨細胞、成骨細胞及脂肪細胞等多種細胞產生，可強烈誘導蛋白水解酶的表達和釋放，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和聚集蛋白聚糖酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS）[11]。MMP-13 和ADAMTS-5 是2 種分別負責降解II 型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的關鍵分解代謝酶，目前認為ADAMTS-5 是治療骨關節炎的突破口之一，ADAMTS-5 抑制劑GLPG1972/S201086 可顯著且高選擇性抑制大鼠和人ADAMTS-5[12]。而中藥小分子成分是骨關節炎新藥開發與研究的重要來源[13]。大多數黃酮類化合物可抑制關節軟骨中促炎細胞因子誘導的MMPs 表達和分解代謝活性起到抗炎作用。

1.1 抑制NF-κB 通路

NF-κB 是人體中重要的炎癥信號傳遞的轉錄因子，在骨關節炎的病程中也起到重要作用[14]。在骨關節炎中，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解產物與關節軟骨細胞表面受體、纖連蛋白片段、機械力、機體老化、促炎因子等共同作用，可激活NF-κB 信號通路。NF-κB 信號通路可單獨或與其他信號通路聯合作用，抑制軟骨細胞合成代謝，并觸發幾種基質降解蛋白酶的表達，如 MMPs 和ADAMTS，導致關節軟骨侵蝕。此外，骨關節炎軟骨細胞會產生大量NF-κB 介導的分解代謝細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-8 和核因子受體激活因子-κB（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），其增加MMPs 的分泌，減少膠原蛋白和蛋白多糖的產生，并以正反饋循環的方式增強NF-κB 的激活[9,15]。NF-κB 信號通路通過誘導NO、環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）促進關節損傷，從而增加分解代謝細胞因子的產生，促進軟骨炎癥。NF-κB 信號通路還可參與軟骨細胞凋亡，影響凋亡相關蛋白的表達[16]。NF-κB 通過介導Toll 樣受體2（toll like receptor 2，TLR-2）表達抑制軟骨細胞的生長并促進細胞凋亡[17]。此外，在骨關節炎軟骨細胞中，NF-κB 介導一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）過表達并促進NO 增加，可促進ECM 和蛋白多糖的降解、Caspase-3/9 的上調、B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的下調以及誘導軟骨細胞凋亡來導致骨關節炎的發展[18-19]。

Hu 等[20]研究發現異牡荊素可在體外通過核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/NF-κB 軸調節IL-1β 誘導的骨關節炎軟骨細胞中炎癥因子含量并維持ECM穩態。Yang等[21]發現在小鼠胚胎瘤成軟骨細胞ATDC5 中IL-1β可誘導MMPs 含量升高和ECM 降解，燈盞花乙素（25～50 μmol/mL）可劑量相關性通過NF-κB 通路抑制IL-1β 誘導的總核因子κB 抑制因子α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）蛋白含量下降和p-IκBα 和磷酸化核因子κB 激酶α（phospho-inhibitor of kappa B kinase α，p-IKKα）的上調，阻斷p-p65 進入細胞核，并在大鼠體內也顯示出了關節保護作用。Luo 等[22]使用IL-1β 干預小鼠關節軟骨細胞，導致細胞中NFκB 異常激活和ECM 降解，而預先使用15～60 μmol/mL 燈盞花乙素處理的細胞可以抑制這一過程，燈盞花乙素可劑量相關性地抑制NF-κB 活性，并通過Nrf2/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路減弱ECM 降解，小鼠骨關節炎模型也證明燈盞花乙素可通過降低關節軟骨破損程度起到關節保護作用。柚皮苷是一類廣泛存在于植物中的黃酮類物質，具有廣泛的藥理作用。Xu 等[23]發現柚皮苷可抑制碘乙酸鈉誘導的SD 大鼠骨關節炎癥狀，且對脂多糖處理的RAW264.7 細胞中PGE2、NO、IL-6 和TNF-α 的產生有顯著抑制作用。彭侃等[24]發現柚皮苷可在體內外抑制軟骨中NF-κB 和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體信號通路，降低SW1353 細胞中IL-1β 誘導的NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-6、IL-18、MMP13和ADAMTS-5的mRNA 表達量升高達到抗炎作用。

1.2 抑制MAPK 信號通路

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）信號通路是參與炎癥反應調控的重要信號通路，其參與調控關節軟骨細胞增殖、分化、凋亡，炎癥因子以及疼痛遞質的產生，在骨關節炎發展中起著重要作用。此外，該通路還能調節軟骨細胞的增殖分化和MMPs 的合成。王象鵬等[25]發現100 μmol/L 槲皮素可抑制由IL-1β 誘導的雄性SD大鼠膝關節軟骨細胞中炎性因子TNF-α、IL-1β 表達量升高，并且可阻斷p38 MAPK 通路中p38、pp38 等相關因子表達，進而起到保護關節軟骨的作用。蘇友新等[26]通過IL-1β 誘導新西蘭兔膝關節軟骨細胞退變建立體外骨關節炎模型，研究顯示5 μg/mL 柚皮苷能顯著抑制IL-1β 引起的兔膝關節軟骨細胞中窖蛋白（caveolin-1，Cav-1）、p-p38 及磷酸化激活轉錄因子2（activating transcription factor 2，p-ATF-2）的升高，表明柚皮苷可通過調控caveolinp38 MAPK 通路對骨關節軟骨細胞的炎癥反應和損傷起到保護作用。

1.3 調控Wnts 信號通路

Wnts 通路在骨關節炎中的作用體現在其影響骨形成、軟骨內骨化、骨生長和修復以及關節發育的能力[27]。經典Wnt 信號通路主要與卷曲蛋白（Frizzled）受體結合，導致β-連環蛋白（β-catenin）的積累并且向細胞核內聚集[28]。Corr[29]在軟骨退化的過程中觀察到Wnt 蛋白和β-catenin 水平升高。過表達的Wnt 會促進骨形成，這一過程可能與骨贅的形成有關。此外，還有2 種Wnt 調節蛋白sFRP-3和Dkk-1 的血清水平可能與骨關節炎的發病和加深相關。而Wnt/β-catenin 過高或過低的表達均可導致軟骨細胞病變和軟骨丟失[30-31]，這表明Wnt/βcatenin 可能在骨關節炎發病機制中發揮雙重作用。Lietman 等[32]使用Wnt 抑制劑處理人滑膜成纖維細胞和經膝關節內側半月板失穩術（destabilization of the medial meniscus，DMM）造模的骨關節炎大鼠膝蓋，發現Wnt 通路可影響體外滑膜成纖維細胞的增殖并降低膠原蛋白水平，并在體內實驗中顯示出關節保護作用。Wnt/β-catenin 可調控蛋白聚糖 4（proteoglycan 4，Prg4），Prg4 是一種維持關節表面層潤滑和體內平衡所必需的細胞外基質分子，與骨關節炎的發展相關[33]。已有研究表明Prg4 的表達可產生關節保護作用[34]，此外Prg4 還可上調缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-3α 水平而抑制軟骨分解代謝和軟骨細胞肥大[35]。

Wu 等[36]研究表明使用25～100 mg/kg 5,7,3′,4′-四甲氧基黃酮可顯著降低骨關節炎大鼠關節液中IL-1β、TNF-α 和PGE2的含量，改善關節軟骨破損程度，5,7,3′,4′-四甲氧基黃酮可以劑量相關性地抑制Wnt/β-catenin 通路及其下游COX-2基因的表達，從而減輕炎癥反應，從而發揮抗骨關節炎的作用。Liu 等[37]在IL-1β 處理人骨關節炎軟骨細胞后，使用5～20 μmol/mL 燈盞花乙素處理，發現其能抑制MMPs、ADAMTS-5、Wnt3a 和Frizzled 7 的表達并阻止β-catenin 向細胞核易位。此外，燈盞花乙素還能調節Wnt/β-catenin 和MAPK 信號通路，并增加II 型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的產生，延緩骨關節炎的發展。

黃酮類化合物通過抗炎作用防治骨關節炎的機制見表1 和圖1。

圖1 黃酮類化合物抗炎機制Fig. 1 Anti-inflammatory mechanism of flavonoids

2 抑制氧化應激

氧化應激是指體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）成分與抗氧化系統之間穩態失衡所引起的一系列反應。失衡將導致炎癥細胞因子表達上升，從而導致細胞大分子如蛋白質、脂質和DNA的氧化，使其改變或喪失功能。ROS 主要產生的位點包括線粒體、過氧化物酶體和其他含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、黃嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶的膜結構。軟骨細胞中ROS 的過量產生所誘導的氧化應激是骨關節炎的主要發病機制之一[60]。在ROS 產生增加的條件下，針對氧化應激的細胞機制被激活，包括過氧化氫酶、過氧化還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等，從而從細胞中有效地去除ROS。有研究表明IL-1β可促進鐵內流并導致軟骨細胞鐵過載，加劇ROS 的產生，導致線粒體功能障礙。Qiu 等[61]對采用半月板切除術（meniscal transection，MNX）進行骨關節炎造模的SD 大鼠使用100 mg/kg 槲皮素治療，發現槲皮素可以抑制ROS 的產生并上調軟骨細胞NAD-依賴性去乙?；窼irtuin-1（NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，SIRT1）/AMPK 信號通路，增加谷胱甘肽及其合成酶谷胱甘肽過氧化物酶的表達，并逆轉骨關節炎模型小鼠的線粒體功能障礙來減輕骨關節炎嚴重程度。黃酮類化合物防治骨關節炎的抗氧化應激作用機制見表2。

表2 黃酮類化合物防治骨關節炎的抗氧化應激作用機制Table 2 Anti-oxidative stress mechanism of flavonoids in prevention and treatment of osteoarthritis

3 抗細胞凋亡

細胞凋亡主要通過3 種途徑進行誘導：（1）死亡受體介導的凋亡，主要通過受體與配體相互結合傳遞凋亡信號來介導細胞凋亡；（2）線粒體依賴性凋亡途徑，可由ROS 等多種因素誘導；（3）內質網應激凋亡，可由內源性或外源性因素誘發內質網穩態異常并導致凋亡。軟骨細胞負責ECM 的合成代謝和分解代謝平衡，保持關節軟骨的穩態。在晚期骨關節炎中，軟骨細胞數量減少并伴有腔隙產生。有研究表明，軟骨細胞的凋亡與骨關節炎的發展相關[63-64]。Wang 等[62]使用25 μmol/mL 的槲皮素對經過氧化氫叔丁醇處理的雄性SD 大關節軟骨細胞進行培養，發現槲皮素可以在體外通過激活SIRT1/AMPK 通路抑制ROS 引起的內質網應激和細胞凋亡，且對進行了DMM 的小鼠的關節退變與糜爛有緩解作用[62]。Hu 等[45]使用硝普鈉誘導軟骨細胞凋亡，發現8 μmol/mL 槲皮素可顯著降低軟骨細胞中ROS 含量，并通過抑制B 淋巴細胞瘤-2 相關X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）和Caspase-3 等促凋亡因子的表達和恢復線粒體膜電位來減輕軟骨細胞凋亡程度。黃酮類化合物防治骨關節炎的抗細胞凋亡作用機制見表3。

表3 黃酮類化合物防治骨關節炎的抗細胞凋亡作用機制Table 3 Anti-apoptotic mechanism of flavonoids in prevention and treatment of osteoarthritis

4 抗鐵死亡

鐵死亡（ferroptosis）是2012 年發現的一種新型細胞死亡，在細胞死亡過程中通常伴有大量的鐵積累和脂質過氧化[70]。Miao 等[71]發現在人骨關節炎細胞中谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的降低可直接誘發鐵死亡，且可通過MAPK/NF-κB 信號通路引發ECM 降解，這是首次證明鐵死亡與骨關節炎發展直接相關的報道。骨關節炎患者關節液中的鐵濃度會增加[71]，而過量的游離鐵可作為催化劑產生大量ROS，使得脂質過氧化物不斷積累并最終引起鐵死亡[73]。

Luo 等[74]通過使用脂多糖處理的人滑膜細胞HUM-CELL-0060 建立的滑膜炎模型來研究淫羊藿苷對滑膜炎細胞的影響，發現2、5、10 μmol/mL 淫羊藿苷能濃度相關性降低丙二醛水平和鐵含量，增加GPX 水平，通過激活胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白（system Xc-，Xc-）/GPX4 軸抑制鐵死亡以減少細胞死亡和減輕滑膜炎。目前鐵死亡與骨關節炎的相關研究正處于起步階段，具體機制有待進一步闡明。

5 抗細胞焦亡

細胞焦亡是一種由炎癥小體誘發并由消皮素（gasdermin，GSDM）蛋白引發的程序性細胞死亡。典型的細胞焦亡由炎性小體介導，伴隨GSDMD 蛋白切割和IL-1β 和IL-18 釋放。炎癥小體主要有NLRP3、核效應蛋白4（NLR family caspase activation and recruit?ment domain Containing 4，NLRC4）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、NLRP1 等幾種[75]，已有研究表明NLRP1 和NLRP3炎性小體與關節纖維化滑膜炎以及細胞焦亡的發生有密切聯系[76-77]，骨關節炎滑膜巨噬細胞中的炎癥小體進入到滑液中使得炎性小體在關節液和周圍組織中的濃度升高，這將導致IL-1β 的含量上升并刺激關節中的一系列炎癥反應，釋放更多的促炎因子，導致軟骨細胞焦亡和軟骨退化。

缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是由α（HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α）和β（HIF-1β、HIF-2β 和HIF-3β，也稱為ARNT1、ARNT2 和ARNT3）亞基組成的異二聚體轉錄因子[78]。關節軟骨處于低氧環境中[79]，這使得HIF-1α 的表達和活性加強，保障關節軟骨穩態，并抑制ECM 降解，使軟骨基因（SOX9、COL2A1、ACAN）、基質沉積、硫酸化糖胺聚糖、II 型膠原蛋白上調。生理性缺氧還可以降低肥大標記物的表達[80]，從而抑制分解代謝反應并緩解關節軟骨破壞。Li 等[81]使用碘乙酸鈉進行大鼠膝關節炎造模，發現每日ig 0.2 mg/kg 紫花牡荊素可抑制大鼠HIF-1α/NLRP3 炎性體的激活，減輕碘乙酸鈉誘導的大鼠滑膜炎癥狀。Zu 等[82]使用脂多糖誘導大鼠膝關節軟骨細胞損傷和細胞焦亡，發現5～20 μmol/mL 淫羊藿苷可以抑制脂多糖激活的NLRP3 和Caspase-1 信號通路，抑制細胞焦亡并發揮骨關節保護作用。

6 結語與展望

隨著中國老齡化帶來的影響日益明顯，骨關節炎人群的不斷增長將給社會和醫療體系帶來沉重負擔。中藥治療骨關節炎的歷史悠久，但目前僅有少量的天然化合物處于抗骨關節炎的臨床前研究階段，黃酮類化合物作為一類廣泛存在于中藥中的天然化合物，可通過多途徑發揮抗骨關節炎和關節保護作用，與傳統抗骨關節炎藥物相比具有更高的安全性，具有巨大潛力。本文從黃酮類化合物抑制炎癥反應、減輕氧化應激及抗細胞凋亡、鐵死亡和細胞焦亡方面進行總結，歸納黃酮類化合物抗骨關節炎的作用機制。黃酮類化合物通過干預炎癥相關通路，減輕體內炎性反應，降低體內ROS 水平，減少ECM 降解，影響抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 的平衡及各蛋白的表達以抑制細胞凋亡，影響GPX 水平，并通過激活Xc-/GPX4 軸降低軟骨細胞鐵死亡率和減輕滑膜炎，通過抑制多種炎癥小體抑制細胞焦亡，減少IL-1β 在軟骨細胞的含量，從而達到抑制骨關節炎發展的作用。

黃酮類化合物大多為天然成分，對機體親和性高，毒副作用相對低，對提高患者用藥依從性和長期安全性具有積極作用。隨著對醫學的認識不斷加深，越來越多的信號通路和靶點被納入與骨關節炎發病相關的范疇，人們已經認識到骨關節炎是一種復雜的全關節退行性疾病，但由于黃酮類化合物治療骨關節炎的作用機制研究較為分散，缺乏系統整理，雖已發現眾多黃酮類成分顯示出抗骨關節炎的潛力，但對黃酮類化合物抗骨關節炎的研究多集中于其抗炎作用，未能體現出黃酮類化合物在骨關節炎治療中的多信號通路、多分子靶點優勢。與許多天然產物一樣，大多數黃酮類化合物的水溶性較差，這限制了其在臨床的應用。目前已有研究嘗試通過制劑的手段解決這一問題，如Ouyang 等[83]制備出了軟骨親和肽修飾的納米粒子包載橙皮素，獲得了具有良好控釋能力和生物相容性的材料，可達到靶向給藥的目的，提高生物利用度和穩定性。未來的研究應在深入挖掘黃酮類化合物抗骨關節炎潛力的同時，加強藥物設計及臨床試驗方面的研究，這對開發出安全有效的抗骨關節炎藥物具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突