基于指紋圖譜結合化學模式識別對狗脊藥材的質量評價

賈天寧，劉 芳，陳 鵬，李先寬，馬 琳*，黃欽華

1. 天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381

2. 國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381

3. 天津中醫藥大學，天津 301617

4. 廈門醫學院附屬第二醫院，福建 廈門 361021

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz(L.) J. Sm.的干燥根莖，別名“金毛狗脊”。主產于廣西、廣東、福建、湖北等地，具有祛風濕、補肝腎、強腰膝之功效。臨床上可治療風濕痹痛、腰膝酸軟、下肢無力等癥狀[1]。近年來對狗脊化學成分研究發現其化學成分主要有蕨素類，水溶性酚酸類、鞣質、淀粉、揮發油、糖及糖苷類等化合物[2]。本課題組對國家中藥標準化項目-生血寶合劑標準化建設進行研究，狗脊是生血寶七味藥之一，對狗脊進行質量控制不可忽視。《中國藥典》2020 年版[3]，僅對其原兒茶酸這單一指標進行含量測定，也曾有文獻對狗脊中原兒茶醛等5 個成分進行含量測定[4]，但中藥成分復雜，無論是單一成分或多成分測定，都難以全面反映狗脊整體質量的優劣。而指紋圖譜在中藥分析方面具有整體、靈敏反映樣品特征的優點，結合化學模式識別對指紋圖譜進行數據降維、識別和分類，尋找藥材間的差異性，用于篩選質量差異標志物。查閱文獻發現，狗脊的指紋圖譜和化學模式識別的文獻較少，故本實驗以狗脊為研究對象，通過高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜結合化學模式識別技術整合分析指紋圖譜中提取共有峰的面積數據，得到不同產地的特征化學成分并含量測定，建立狗脊有效成分以期為狗脊的質量標準研究、相關制劑的質量控制以及資源開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀Shimadzu SPD-20AT，色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；AB135-S 型十萬分之一電子分析天平（Mettler Toledo 公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）。

1.2 試劑

對照品5-羥甲基糠醛（批號20051201）、原兒茶醛（批號20082402）、原兒茶酸（批號20082901）、紫云英苷（批號19042203）成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸（批號110885-201703）中國食品藥品檢定研究所，質量分數均≥98%。分析純甲醇購自天津市化學試劑供銷公司，色譜純甲醇購自美國Sigma 公司，冰醋酸（分析純，天津市化學試劑供銷公司），水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

狗脊藥材采自廣東、廣西、浙江、福建等，共16 批次。經天津中醫藥大學馬琳教授鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊C.barometz(L.) J. Sm.的干燥根莖。狗脊樣品來源見表1。

表1 16 批次狗脊來源Table 1 Sample information of C. barometz

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動相1%冰醋酸水溶液（A）-甲醇（B），流動相梯度洗脫程序為0～17 min，93%～85% A；17～25 min，85%～76% A；25～30 min，76%～74% A；30～45 min，74%～65% A；45～52 min，65%～40% A；52～55 min，40%～10% A；55～65 min，10%～93%A；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測波長280 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別取對照品5-羥甲基糠醛（5-HMF）、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、紫云英苷適量，精密稱定，置量瓶中，加入甲醇-1%冰醋酸水溶液（70∶30）制成含5-HMF 679 μg/mL、原兒茶醛 24.0 μg/mL、原兒茶酸 15.0 μg/mL、咖啡酸42.5 μg/mL、紫云英苷45.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品粉末（過三號篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸水溶液（70∶30）混合溶液50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30min，放冷，用甲醇-1%冰醋酸水溶液（70∶30）混合溶液補足減失的質量，搖勻，0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一狗脊供試品（S1）溶液，連續進樣6 次，進樣量20 μL，以5-HMF 為參照峰（S），計算其他各個特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，考察儀器的精密度，各特征峰相對保留時間的RSD 值分別為0.42%、0.82%、0.54%、0.69%、0.76%，各色譜峰相對峰面積的RSD 值分別為0.55%、1.29%、0.84%、1.47%、1.53%，均小于2.0%。

2.3.2 重復性試驗 取同一狗脊供試品（S1），按“2.2.1”項下制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，進樣量20 μL，以5 -HMF為參照峰（S），計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，考察方法的重復性。各特征峰相對保留時間的RSD 值分別為0.82%、1.76%、0.73%、0.51%、0.74%，各色譜峰相對峰面積的RSD值分別為0.16%、1.57%、1.04%、0.92%、1.24%，均小于2.0%。

2.3.3 穩定性試驗 取同一狗脊供試品（S1）溶液，分別于配制后0、2、5、10、15、24 h 進樣測定，進樣量20 μL，以5-HMF 為參照峰，計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，考察供試品溶液的穩定性，各特征峰相對保留時間的RSD 值分別為0.17%、0.72%、1.01%、1.02%、1.25%，各色譜峰相對峰面積的RSD 值分別為0.62%、0.73%、0.89%、1.41%、1.85%，均小于2.0%。

2.4 狗脊指紋圖譜的建立

2.4.1 狗脊對照指紋圖譜的生成 分別精密稱定16 批 狗脊樣品約2.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版）軟件”，對16 批狗脊樣品HPLC 圖譜進行分析，以S1 為參照圖譜，采用中位數法，時間窗的寬度默認為0.1 min，經過多點校正之后進行自動匹配，生成16 批狗脊藥材的HPLC 指紋圖譜和對照圖譜（R），見圖1、2。

圖1 狗脊HPLC 指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of C. barometz

圖2 樣品色譜圖 (A) 與對照品色譜圖 (B)Fig. 2 Chromatograms of sample (A) and reference (B)

2.4.2 特征峰的指認 16 批狗脊藥材有10 個共有峰，其中指認1、2、3、5 和10 號，5 個主要特征峰：分別為5-HMF，原兒茶酸，原兒茶醛，咖啡酸，紫云英苷。

2.4.3 相似度評價 對16 批狗脊樣品的指紋圖譜進行相似度計算分析，選取樣品中出峰時間穩定、分離度好5-HMF 作為參照峰（S），以其保留時間和峰面積為1，計算16 批狗脊樣品的共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各共有峰的相對保留時間RSD 值均小于 2.0%，相對峰面積的 RSD 在64.81%～86.64%，說明不同批次樣品中各成分含量差異較大，相對峰面積結果見表2。16 批狗脊樣品色譜圖與對照指紋圖譜的相似度在0.695～0.954，表明各個產地狗脊差異較大，這可能與狗脊野生狀態種植有關。相似度結果見表3。

表2 16 批狗脊指紋圖譜相對峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks in fingerprints of 16 batches of C. barometz

表3 16 批狗脊指紋圖譜相似度評價結果Table 3 Results of similarity evaluation of 16 batches of C.barometz

2.5 化學模式識別分析

2.5.1 聚類分析 16 批樣品HPLC 指紋圖譜的10個共有峰的峰面積導入SPSS 軟件進行系統聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA），采用組間連接的聚類方法，以平方歐式距離進行分析，結果見圖3。當分類距離10 時，顯示16 批樣品可共聚為兩類，其中來自廣西的S1 和S2 聚為一類，其余地產可聚為一類。

圖3 狗脊樣品聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis diagram of C. barometz samples

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）分析 為了進一步區分各不同產地狗脊，將16 批樣品的指紋圖譜的10 個共有峰的峰面積為原始數據導入SPSS 軟件進行處理，進行PCA。首先，進行降維因子分析，結果顯示KMO 值為0.773，大于0.5，表明各變量相關性較好，以特征值大于1提取主成分，得到2 個主要成分，累積方差貢獻率為88.298%，見表4；其次，用碎石圖轉折點檢驗保留主成分個數，進一步說明可提取前2 個主成分，見圖4。成分矩陣（表5）結果顯示，第1 個主成分信息主要來自1～7 號峰和9 號峰，其中1～3 號峰分別為5-HMF，原兒茶酸，原兒茶醛，5 號峰為咖啡酸，第2 個主成分信息主要來自第10 號峰（紫云英苷）。最后，將16 批樣品的10 個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，得到16 批不同產地樣品的主成分得分圖，見圖5，R2X（cum）為0.75，Q2（cum）為0.645，說明該模型可靠。結果顯示2 個主成分能反映不同產地狗脊的主要特征，與上述聚類分析結果一致，提示不同產地的狗脊在化學成分含量上存在差異。

表4 特征值和方差貢獻率Table 4 Eigenvalues and variance contributions

圖4 主成分分析碎石圖Fig. 4 Scree plot of PCA

圖5 狗脊PCA 得分圖Fig. 5 PCA scores of C. barometz

表5 成分矩陣Table 5 Component matrix

初始因子載荷矩陣見表5，由表可見，第1 主成分主要反映了除峰8 和10 的信息，即原始指標色譜峰1～7、9 的信息，第2 主成分主要反映來自原始指標色譜峰10 的信息（載荷值＞0.7）。其中峰1 為5-HMF，峰2 為原兒茶酸，峰3 為原兒茶醛，峰5 為咖啡酸，峰10 為紫云英苷。以降維得到的2個主成分得分作為X、Y、Z 軸，得到10 個樣品的PCA 得分圖，結果見圖5，S1、S2、S8 均與其他樣品偏離，與聚類分析結果大致相同，說明廣西來源的2 個樣品雖然聚類分析是一類，但是可能因為生長環境或者采收季節的原因，經過PCA 分析，仍可以將S1 和S2 區別開。

2.5.3 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 建立PLS-DA 模型，可以更好地分析不同產地樣本間的組內差異。結果顯示，所有排列在左邊的R2（cum）和Q2（cum）值都低于右邊的原始點，并且Q2（cum）點的藍色回歸線有負截距，說明原始PLS-DA 模型有效，確認該分析內容在統計學層面上可信。PLS-DA 得分圖及3D 圖，見圖6、7。結果結果顯示16 批樣品分可為4 組，廣西2 個樣品S1 和S2 以及廣東樣品S3 3 個產地各為一組，其余一組。結合變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）（圖8）可知VIP＞1 的色譜峰（數值由高到低）分別為2、3、10、8 和1 號峰（原兒茶酸、原兒茶醛紫云英苷、未知化合物和5-HMF），說明這些化學成分是不同產地狗脊樣品的差異性標志物。

圖6 狗脊樣品PLS-DA 得分圖Fig. 6 PLS-DA scores of C. barometz

圖7 狗脊樣品PLS-DA 分析3D 圖Fig. 7 3D image of C. barometz by PLS-DA

圖8 狗脊樣品PLS-DA 的VIP 圖Fig. 8 VIP value from PLS-DA load diagram of C.barometz

2.6 狗脊中有效成分的含量測定

PCA 分析表明指紋圖譜中1～3、5 號峰是影響不同產地狗脊質量的特征化學成分，分別為5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸，是影響不同產地狗脊質量的特征化學成分。PLS-DA 結果顯示，有5 個成分VIP＞1，分別對應2（原兒茶酸）、3（原兒茶醛）、10（紫云英苷）、1（5-HMF）4 個成分，以及8 號峰（未知成分）。說明不同產地這些成分含量差異較大，是產地的差異性特征有效成分，故本實驗篩選5-HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷作為狗脊指標性成分進行含量測定。

2.6.1 線性關系考察 精密吸取各對照品儲備液適量，吸取“2.2.1”項下對照品溶液混合對照品溶液1、2、5、15、50、100 μL，成，按“2.1”項下色譜條件測定5-HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷的峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算線性回歸方程和相關系數（r）。結果見表6。

表6 對照品的線性方程、相關系數和線性范圍Table 6 Linear equation, correlation coefficient and linear range of reference substance

2.6.2 精密度試驗 取混合對照品，按“2.1”項色譜條件重復進樣6 次，測得5 -HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷峰面積的RSD 值分別為1.07%、1.28%、1.12%、0.98%，結果表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取S1 樣品共6 份，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，測5-HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷含量，RSD 值分別為1.16%、2.26%、2.12%、1.28%，表明該方法的重復性良好。

2.6.4 穩定性試驗 取混合對照品，分別于配制后0、2、5、10、15、24 h 進樣測定，按“2.1”項色譜條件重復進樣6 次，測得5-HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷峰面積的RSD 值分別為1.29%、2.07%、1.18%、1.73%，結果表明樣品穩定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 取測定的S1 號狗脊樣品粉末6 份各1.000 g，精密稱定，分別加入等量的上述4 種有效成分混合對照品溶液，按“2.2.2”項制備供試液，按“2.1”項色譜條件進行測定，5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛、紫云英苷加樣回收率分別為99.27%、98.21%、99.62%、101.18%，RSD 分別為0.84%、1.89%、0.48%、1.50%。

2.6.6 樣品含量測定 根據“2.2.2”項下方法制備狗脊藥材供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測得5-HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷的含量，結果見表7。由結果可知，《中國藥典》規定狗脊中的原兒茶酸應大于0.02%，16 批狗脊樣品中原兒茶酸含量差異較大，部分樣品中的原兒茶酸的含量尚未達到《中國藥典》的標準。

表7 16 批狗脊4 種指標性成分含量測定結果Table 7 Content determination of four chemical components in 16 batches of C. barometz

3 討論

《中國藥典》2020 年版采用乙腈-1%醋酸作為流動相，本實驗還考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、1%甲酸水-甲醇等流動相體系，在結合文獻基礎上對流動相進行優化[5-7]，結果發現以1%醋酸（A）-甲醇（B）為流動相梯度洗脫，樣品的分離效果較好，最后采用1%醋酸-甲醇進行梯度洗脫。

中藥材的內在質量受生長環境（海拔、土壤、水源、光照等）、采收時間以及加工方法、炮制方法等多方面影響。僅采用單成分或者多成分考察某種藥材的質量，難以體現不同產地藥材質量優劣，為了更好地區分產地對質量的影響，本實驗運用相似度評價、聚類分析、PCA 分析和PLS-DA 的化學計量學方法對不同產地狗脊進行質量研究。聚類分析可知，9 個產地的狗脊樣品可聚為2 類，其中廣西狗脊聚為一類，其他產地狗脊聚為一類，說明產地的生態環境、氣候條件等因素相關造成不同的差異性。在PCA 分析中可看出，9 個產地的狗脊樣品可分成3 類，化學成分存在一定的差異，PCA 分析與聚類分析大致相同，說明廣西來源的兩個樣品雖然通過聚類分析是一類，但是經過PCA 分析，仍可以將S1 和S2 區別開，可能與生長環境或者采收季節的原因有關。PLS-DA 分析也可以看出，廣西2 個樣品有所區別，廣東和廣西產地的3 個樣品S1、S2和S8，分別偏離其他產地的樣品。這兩個產地的狗脊化學成分與其他產地的樣品存在一定的差異。16批狗脊樣品HPLC 指紋圖譜，指認出10 個共有峰，其中《中國藥典》2020 年版的狗脊以原兒茶酸為含量測定指標，說明以原兒茶酸具有特征性。本研究在此基礎上，結合PCA 分析和PLS-DA 化學計量學方法，發現5-HMF、原兒茶醛、紫云英苷是產地的差異性特征有效成分，在考察狗脊質量時可以增加這些成分的考察。PCA 結合PLS-DA 結果分析，篩選出5-HMF、原兒茶醛、原兒茶酸、紫云英苷作為狗脊的有效成分。

5-HMF 具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗炎、降血糖改善慢性炎癥性疾病、阿爾茨海默病等，5-HMF 其本身不存在嚴重的健康風險，但其代謝產物5-磺甲基糠醛具有一定的毒副作用，如腎毒性、黏膜刺激、橫紋肌損傷等，如何控制其轉化以及控制一定的含量還需深入研究[8]。

通過文獻調研發現，原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸[1]以及紫云英苷是狗脊發揮祛風濕、補肝腎、強腰膝功效的物質基礎。原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸以及紫云英苷均為酚酸類成分。已經證實，原兒茶酸具有抗炎、鎮痛、增強免疫力、修復缺血損傷、抑制血小板凝集等藥理作用[9]。近年來，還有學者發現，原兒茶酸可減輕退變軟骨細胞的損傷[10]。而原兒茶醛體現了更多活血化瘀類的作用，如擴張冠狀動脈、抑制血小板聚集、抑制單核細胞趨化游走和趨化游走過程中產生的IL-8 活性等作用[11]。紫云英苷是黃酮類成分，黃酮類成分在治療類風濕關節炎[12]、預防骨質疏松[13]以及抗缺血損傷、抗驚厥、抗癡呆等多種神經保護作用[14]。選取5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛、紫云英苷作為狗脊的有效成分不僅僅是化學模式識別的結果，也符合其祛風濕，補肝腎，強腰膝的作用機制。

本研究建立了16 批不同產地狗脊的HPLC 指紋圖譜，確立了10 個共有峰，結合化學模式識別評價方法，在5 個已知化合物中篩選出了4 個影響狗脊質量的差異性標志物，并對這4 個成分進行了含量測定。本研究建立的HPLC 指紋圖譜、化學模式識別方法以及含量測定方法穩定、可靠，為狗脊藥材的質量控制和相關資源開發的深入研究奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突