基于細胞響應譜的注射用雙黃連（凍干）質量評控研究

馬麗娜，顧媛媛，何 婷，毛柳英，郭媛媛，趙 薇，曹俊嶺，鄢 丹，肖小河

1. 北京中醫藥大學東方醫院 藥學部，北京 100078

2. 北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700

3. 首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京 100050

4. 中國人民解放軍總醫院 第五醫學中心 肝病醫學部研究所，北京 100039

注射用雙黃連（凍干）是由金銀花、連翹、黃芩提取物制成的一種中藥注射劑，為中藥抗菌抗病毒的著名方劑[1]，臨床廣泛用于治療急性呼吸道感染，因其使用方便、療效確切，被國家中醫藥管理局指定為全國中醫治療急診的首批15 種必備藥物之一。然而，近年來隨著其在臨床的廣泛使用，有關其不良反應報道日漸增多[2-8]，引起國家食品藥品監督管理總局廣泛重視，先后2 次因過敏性休克發布暫停銷售或使用的不良反應通報[9]。雖然很多學者分別從注射劑致敏成分[10-14]、輔料[15-17]及過敏/類過敏現象機制[18-20]等不同角度對中藥注射劑臨床發生不良反應的可能原因進行了系統和深入的研究，但是依然無法避免臨床不良反應的發生。

中藥注射劑臨床不良反應[21-30]，主要表現為過敏，尤其是類過敏，首次用藥即可發生，即藥物可通過靜脈給藥直接作用于肥大細胞引發脫顆粒效應，釋放出組胺、β-氨基己糖苷酶等大量過敏介質，從而導致系列癥狀的產生，且具有明顯的劑量相關性。而中藥注射劑因給藥途徑特殊，無首過效應，相對來說其全息成分可能直接作用于免疫細胞，為通過體外細胞實時動態監測，表征類過敏反應提供了可能，且可關聯體內外試驗結果。生物評價作為一種直接關聯藥物活性的評價方法，已越來越受到人們的重視，尤其適合類似中藥復雜體系的質量控制。細胞響應譜法具有非侵入、無標記、實時在線、靈敏專屬、定性定量、指紋特性等優點，能夠讓細胞在接近生理或病理條件下以活體狀態進行細胞生物學特性監測，通過該技術可完整地呈現藥物和細胞之間發生的系列生化反應。

因此，本研究在深入分析引發中藥注射劑不良反應現象及原因的基礎上，借鑒生物藥品的質量評控模式，結合中藥注射劑不良反應特點，引入可實時在線監測的細胞響應譜方法，通過相似度評價和聚類分析，考察不同批次產品間生物效應的一致性和穩定性，以補充常規制劑通則和化學指紋譜無法檢測到的變化信息，探索建立基于細胞響應譜監測的中藥注射劑質量一致性預警方法，以減少中藥注射劑臨床不良反應/事件發生。

1 材料

1.1 細胞

大鼠嗜堿性細胞白血病RBL-2H3 細胞購自中國科學院細胞庫，采用15% DMEM 高糖培養液在37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境培養。

1.2 樣品

正常雙黃連樣品（編號NS1～NS5）、過期雙黃連樣品（編號OD1～OD5）及臨床導致過不良反應的雙黃連樣品（編號AR1～AR5）由哈藥集團中藥二廠生產。其中過期樣品按照藥品說明書有效期，過期時間分別為16、10、28、20、31 個月，不良反應樣品為企業提供的臨床上曾發生發熱、皮疹等不良反應的樣品。此外，為模擬雙黃連（凍干）樣品在運輸儲藏過程中可能出現的情況，同時制備了雙黃連凍干粉特殊處理樣品。高溫加速變質樣品（編號TS1～TS5）：60 ℃恒溫箱中放置10 d；光照加速變質樣品（編號LS1～LS5）：光照強度（4500±500）Lx 的可調光源下持續照射10 d；開放環境放置樣品（編號ES1～ES5）：開瓶放置于室溫避光開放環境10 d 制得（以上特殊處理所用樣品均為同一批次的正常樣品）。

1.3 試劑

DMEM 高糖培養基（批號11995-065）、胎牛血清（批號10099-141）、青霉素-鏈霉素（批號15140-148）、0.25%胰酶（批號25200-072）購自美國Gibco公司；PBS 緩沖液（批號P1020-500）購自北京Solarbio 科技有限公司；Compound 48/80（批號073M4050V）購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.4 儀器

培養瓶、培養板、凍存管、離心管、移液管（購美國Corning 公司）；xCELLigence 實時細胞電子傳感系統（艾森生物有限公司）；TC-10 型自動細胞計數儀（美國Bio-Rad 公司）；Synergy H1 型全功能酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；NAPCO 5410 型二氧化碳培養箱（法國JOUAN 公司）；SINCE 1889 型立式高壓滅菌鍋（重慶雅馬拓科技有限公司）；超凈工作臺（北京冠鵬凈化設備有限責任公司）；AB135-S 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；0.22 μm 針頭式過濾器、Milli-Q 超純水系統（美國Millipore 公司）。

2 方法與結果

2.1 注射用雙黃連（凍干）樣品的細胞響應譜方法建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取注射用雙黃連（凍干）內容物，混勻，精密稱取粉末適量，置棕色量瓶中，加生理鹽水制成30 mg/mL 的溶液，用0.22μm 微孔濾膜濾過即得。

2.1.2 細胞接種濃度和給藥時間的選擇 細胞接種濃度和給藥時間是影響體外細胞活性評價的重要因素。采用實時細胞電子傳感系統監測不同濃度RBL-2H3 細胞生長曲線（圖1-A）。結果顯示，當接種濃度低于2.5×105個/孔時，細胞生長36 h 后才能進入對數生長期，實驗周期過長；當超過2.5×105個/孔時，細胞對數生長期時間過短，實驗不易操作、重復性差、誤差較大。因此，選擇2.5×105個/孔作為RBL-2H3 細胞優化接種濃度。

在體外細胞實驗中，一般選擇細胞敏感的對數生長期（cd 段）作為加藥時間點，如圖1-B 所示，ab 段為RBL-2H3 細胞快速貼壁產生的細胞指數（cell index，CI）響應曲線；隨著溶液中細胞貼壁的完全，CI 值響應曲線出現暫時的停滯（bc 段），這期間也是細胞調整自身生理活動以適應外界環境的過程，準備進入指數生長期的前奏，經過一段時間的潛伏期后，細胞進入大量分裂的對數生長期（cd段），CI 值響應呈線性增加趨勢；在細胞生長的后期，培養液被消耗殆盡，細胞死亡，CI 值響應下降，CI 曲線重新回到基線（de 段）。因此，本研究結合上述原則，將CI 值接近于1 時的合適時間確定為給藥時間，即細胞接種后24h作為合適的加藥時間點（圖1-B）。同時為減少實驗誤差、分析數據方便，采用實時在線檢測儀進行數據處理時，將加藥時間點的CI 值歸一化為1。

2.1.3 注射用雙黃連凍干溶液的細胞響應譜表征取適量注射用雙黃連（凍干）正常樣品，設置系列質量濃度，檢測其對RBL-2H3 細胞作用，如圖2 所示，注射用雙黃連（凍干）正常樣品，在0.8～3.2 mg/mL 對RBL-2H3 細胞的作用呈明顯的時效關系，且0.8 mg/mL 藥效曲線變化穩定，故后續實驗中選取0.8 mg/mL 作為注射用雙黃連（凍干）的給藥質量濃度。

圖2 注射用雙黃連（凍干）作用于RBL-2H3 細胞的實時細胞響應譜Fig. 2 Real-time cell response spectrum of RBL-2H3 cells treated with Shuanghuanglian Lyophilized Injection

2.1.4 特征參數提取 為評價所得實時細胞響應譜中各曲線相似性，在課題組前期相關研究[31-33]基礎上，提取以下特征參數：

（1）脫附時間（ΔT）：即從加藥開始到CI 值接近于0 的時間間隔[34]。

tde表示CI 值接近于0 的時間點，tadd表示給藥的時間點

（2）曲線下面積（AUC）[35]：加藥開始至CI 值接近于0 的曲線下面積。

（3）抑制率：藥物作用于RBL-2H3 細胞12、24 h 后CI 值。根據公式（2）計算細胞抑制率（I12、I24）。

I為抑制率，CIB為相應時間點空白組的CI 值，CIi為相應時間點實驗組的CI 值

（4）相似度：采用夾角余弦法計算不同批次藥物作用于RBL-2H3 細胞所得細胞實時響應譜各曲線間相似度。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度實驗 取同一供試品溶液，采用實時細胞分析系統同一通道連續進樣5 次，記錄CI 曲線。結果ΔT和AUC 的RSD 均小于3%，各CI 響應曲線相似度均大于0.90，說明在本實驗條件下xCELLigence 實時細胞分析系統精密度良好。

2.2.2 穩定性實驗 取同一供試品溶液，采用實時細胞分析系統，分別于0、1、2、4、8 h 檢測其對RBL-2H3 細胞作用，記錄CI 響應曲線，結果ΔT和AUC 的RSD 均小于3%，各CI 響應曲線相似度均大于0.90，說明供試品溶液在8 h 內基本穩定。

2.2.3 重復性實驗 取同一批次樣品，平行制備供試品溶液6 份，采用實時細胞分析系統分別監測6份樣品對RBL-2H3 細胞作用，記錄CI 曲線，結果ΔT和AUC 的RSD 均小于3%，各CI 響應曲線相似度均大于0.90，說明方法重復性良好。

2.3 不同注射用雙黃連（凍干）樣品細胞響應譜分析

分別將5 批正常樣品（NS1～NS5），制成0.8 mg/mL 供試品溶液，按照“2.1.3”項下方法，建立正常樣品的細胞響應譜，如圖3-A 所示。提取特征圖譜數據，使用平均數法擬合正常樣品的標準對照細胞響應譜（reference standard biological fingerprint，RSBF）。

圖3 基于RBL-2H3 細胞的注射用雙黃連（凍干）細胞響應譜Fig. 3 Cell response spectrum of Shuanghuanglian Lyophilized Injection based on RBL-2H3 cells

同法制備注射用雙黃連（凍干）高溫加速變質樣品（TS1～TS5）、光照加速變質樣品（LS1～LS5）、開放環境放置樣品（ES1～ES5）及過期和不良反應樣品溶液，采用實時細胞監測儀，建立特殊樣品細胞響應譜，如圖3-B～F 所示。

2.4 注射用雙黃連（凍干）樣品細胞響應譜結果分析

2.4.1 相似度分析 根據“2.1.4”項下方法提取相關參數：ΔT、AUC、I1、I2、相似度。進行相似度分析，結果顯示，正常組樣品與標準細胞響應譜相比具有較高的相似度，均大于0.98，而其他不合格樣品相似度均低于0.98（除過期組樣品OD2、OD3 和不良反應組AR3、AR5 外），其中開放環境放置組樣品（ES）和不良反應組樣品（AR）相似度最低。因此以相似度大于0.98 為評價標準，采用細胞響應譜方法在25 批樣品中共檢出不合格樣品21 批，檢出率為84%，說明細胞響應譜方法能夠有效區分正常組樣品和高溫、光照、暴露及多數過期和不良反應注射用雙黃連（凍干）樣品。

2.4.2 聚類分析 以不同批次注射用雙黃連（凍干）樣品細胞特征圖譜各項參數為指標，采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件，對注射用雙黃連（凍干）正常樣品與特殊樣品進行聚類分析，結果見圖4，正常組樣品、高溫樣品、光照樣品、過期樣品均能夠各自聚為一類，提示細胞特征譜所提取的參數不僅能將正常樣品和其他樣品區分開，而且能夠將高溫組、光照組、過期組樣品和其他組分別區分開，但是不能將開放環境組和不良反應組分開。

圖4 注射用雙黃連（凍干）樣品細胞響應譜聚類分析圖Fig. 4 Cluster analysis of cell response spectrum of Shuanghuanglian Lyophilized Injection samples

2.4.3 主成分分析 在聚類分析的同時，采用SIMCA-P11.5 軟件對細胞響應譜所提取參數進行相關分析，得到樣品得分圖（圖5）。結果顯示，細胞響應譜方法可有效區分注射用雙黃連（凍干）正常組與其他特殊樣品（光照、高溫、暴露、過期及不良反應組樣品），但是亦不能有效區分開放環境組和不良反應組樣品。

表1 注射用雙黃連（凍干）樣品細胞特征圖譜參數提取Table 1 Parameters from cell characteristic curve spectra of Shuanghuanglian Lyophilized Injection samples

圖5 注射用雙黃連（凍干）樣品作用于RBL-2H3 細胞的特征譜主成分得分圖Fig. 5 Principal component score of characteristic spectrum of RBL-2H3 cells treated with Shuanghuanglian Lyophilized Injection samples

針對從細胞特征圖譜中所提取的各項參數，借助主成分分析方法進一步挖掘其中蘊藏的特征信息，尋找其代表性評價指標。本研究對所提取的I1、I2、ΔT、AUC、相似度（分別以X1～X5代表，標準化值用Z1～Z5表示）進行計算。由主成分分析的初始特征值和提取的載荷平方和可知，前2 個主成分的特征值均大于1，累積貢獻率超過85%。由成分負荷矩陣可知，提取了2 個主成分，用F表示，其表達式如下：

系數的絕對值越大，則說明主成分與該參數的關系越密切。由上式可知，第1 主成分與I1、I2、ΔT、AUC 關系密切，第2 主成分與I2和相似度關系較為密切。

3 討論

本研究從注射劑質量控制角度出發，以注射用雙黃連（凍干）為模式藥，以具有肥大細胞許多生物學特性的RBL-2H3 細胞為模式生物[36-37]，建立了基于細胞響應譜的質量均一性評價方法，可以辨識暴露、高溫、光照及部分過期和臨床發生不良反應樣品產生的質量差異，旨在模擬考察產品在生產、儲存、運輸過程中受光照和高溫等因素影響導致的微小質量變化，為早期預警藥源性不良反應提供技術參考。

采用建立的細胞響應譜方法，通過整體相似度分析發現，正常樣品間相似度較高，特殊處理樣品相似度普遍降低，提示該方法可將注射用雙黃連（凍干）正常樣品和特殊樣品有效區分。這可能是因為一方面注射用雙黃連（凍干）制劑臨床不良反應多為過敏或類過敏反應[2-5]，且其所含成分對RBL-2H3細胞模型敏感[38-39]，即使細微的成分變化也可通過該方法有效表征，同時由于生物評價方法本身對生物信息變化敏感，這可能也是為何細胞響應譜法比化學指紋譜法更靈敏、全面的原因所在。本分析方法之所以能夠有效區分不同樣品，很重要的一點是對特殊參數的選擇，本研究中選擇了ΔT、AUC、I1、I2和相似度，共5 個代表性參數，這5 個參數基本可全面細致地刻畫整個細胞響應譜的變化。首先脫附時間主要是反映整個細胞的生存周期即生命的長度，而曲線下面積是借鑒血藥濃度曲線下面積類似生命的厚度，12、24 h 2 個時間點的抑制率反映的是不同樣品關鍵點的變化趨勢，這2 個時間點的選擇可以根據實際情況進行調整，最后相似度是對整體變化趨勢的一個量化表達，通過這5 個參數不僅可描繪出整個曲線的輪廓，同時又能夠捕捉關鍵變化點，在這一點上，希冀給同行學者啟示和參考。

此外，細胞響應譜實驗前，通過常規制劑通則和化學指紋譜的內控檢測，結果發現高溫組和光照組樣品可引起化學成分變化，而這種變化在細胞響應譜中也被充分體現并有效識別，這可能是由于雙黃連制劑中所含的綠原酸類成分和黃芩苷類成分對光和熱敏感。而臨床發生不良反應的樣品通過內檢均未發現明顯異常，但是通過細胞響應譜方法卻可檢出5 批次中的3 批樣品波動，提示細胞響應譜法在直接關聯臨床有效性和安全性的檢測中靈敏性強于常規制劑通則和化學指紋譜法。還有2 批次不良反應樣品未有效檢出，可能是由于患者本身特異質或過敏體質發生的不良反應，而這種情況通過簡單的體外檢測可能依然無法有效檢出，這也是本方法的局限性所在。還有2 批過期樣品未被檢出，經追溯發現這2 批樣品過期時間相對較短，其中OD2 為5 批樣品中過期時間最短的10 個月，提示可能過期時間越長樣品變化越大越易被檢出。OD3（過期28個月）雖然過期時間較OD1（過期16 個月）和OD4（過期20 個月）長，但是在對樣品進行前處理時，發現OD3 樣品的疏松度明顯大于后2 批樣品，提示不同批次樣品可能由于儲存、運輸環境差異造成的異常變化。另聚類分析發現該方法不能有效區分開放環境樣品和不良反應組樣品。可能是因為開放環境組樣品在放置過程中受空氣中氧氣、水分、微生物污染等因素影響，其生物活性發生了較大變化，而這種變化可能與不良反應樣品所誘導的細胞響應譜表現類似，即都跟生物敏感性相關，所以通過生物評價方法無法有效區分。

綜上，注射用雙黃連制劑對溫濕度及光和熱相對敏感，在生產、儲存、運輸過程中需特別注意，而細胞響應譜法可快速、靈敏、高通量地表征這些因素的變化，且可實現實時在線、量化、動態、全面地反映注射劑質控過程中的整體信息，有效彌補常規質控方法信息單一或靈敏性差的不足。但是該方法也存在常規體外實驗不能有效反映機體整體情況的普遍性問題，但是該方法作為一種新的、直接關聯臨床不良反應的方法，可作為當前不良反應事件頻發的中藥注射劑質控方法的有效補充，有望與其他方法一起廣泛應用于中藥注射劑的質量控制與不良反應預警。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突