基于STAT3-CASP4/5 通路誘導銀屑病細胞焦亡基因調控網絡的構建及潛在藥物預測

王家悅，陳朝霞，王 燕，趙京霞，底婷婷，胡雪晴，曲保全，李 萍

首都醫科大學附屬北京中醫醫院，銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京市中醫藥研究所，北京 100010

銀屑病是一種常見的自身免疫性疾病，其發病機制尚不完全清楚[1]。目前普遍認為，銀屑病的發病是由表皮角質形成細胞（keratinocyte，KC）與免疫細胞互作異常引起的自身炎癥反應，導致皮膚受累。近年來，研究發現半胱氨酸蛋白酶-11（cysteine aspartatespecific proteinase-11，Caspase-11，CASP-11）促進了與細胞焦亡相關的銀屑病的發展。對缺乏CASP-11 的小鼠進行組織學和基因表達研究表明，CASP-11 的表達可以通過促進KC 增殖、免疫細胞浸潤和新血管生成來增強咪喹莫特誘導的銀屑病癥狀，以支持該過程中異常增殖的KC 的代謝需求[2]。又有研究證實，CASP-11 可激活銀屑病小鼠骨髓源性巨噬細胞中的炎癥小體，焦孔素 D（gasdermin-D，GSDMD）作為炎性CASP 的共同底物蛋白被切割釋放其N 端結構域，破壞細胞膜的功能，導致膜上孔隙形成，致使促炎細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的成熟和分泌并啟動細胞焦亡[3]。雖然這些證據表明，細胞焦亡過程是銀屑病發病的途徑之一，它們之間的聯系是通過抑制CASP 驅動的細胞焦亡干預誘導的銀屑病小鼠的病理癥狀來建立的，但是調控CASP基因表達進而誘發細胞焦亡過程轉錄機制尚不清晰。因此，本研究采用基于基因調控網絡的方法來識別與銀屑病病理過程中細胞焦亡相關的基因進而揭示在銀屑病的病理學中CASP 誘發細胞焦亡上游調控機制。

在銀屑病的西醫治療方法中，環孢素 A（cyclosporine A，CysA）作為一種高選擇性免疫抑制劑用于控制嚴重的斑塊型、膿皰型銀屑病，效果明顯[4]。最近的研究表明，CysA 可以通過抑制線粒體滲透性過渡孔的開放來減少細胞焦亡的發生，提示CysA 可能通過調控異常的細胞焦亡過程來治療銀屑病[5]。此外，中藥治療銀屑病的療效確切，經臨床實踐及動物研究證明，中藥在抑制炎癥細胞浸潤、抑制KC 異常的增殖分化過程等方面具有明顯優勢[6-8]，并有研究表明中藥還可干預細胞焦亡的進程[9-10]。本研究通過分析銀屑病病患的基因表達數據構建CASP基因上游轉錄調控網絡，通過整合臨床知識和生物醫療數據庫預測在銀屑病發病過程中調節細胞焦亡基因表達的中西藥物（研究流程見圖1），為銀屑病的治療提供新的研究方向。

圖1 STAT3-CASP4/5 通路誘導銀屑病細胞焦亡基因調控網絡構建及潛在藥物預測的研究流程Fig. 1 Research process of constructing regulatory network for psoriatic cell pyroptosis gene induced by STAT3-CASP4/5 pathway and potential drug prediction

1 材料與方法

1.1 數據收集

利用NCBI 的基因表達Omnibus 數據庫（GEO）獲得銀屑病患者皮損區和非皮損區樣本的基因表達數據（GSE109248）。使用GEOquery 包（2.66.0 版本）從GEO 數據庫中下載 17 例銀屑病樣本（GSM2935867～GSM2935883）和14 例健康皮膚對照組樣本（GSM2935853～GSM2935866），樣本分布信息見圖2-a，樣本標準化情況見圖2-b。此外，通過檢索細胞焦亡相關文獻報道[11-14]，收集前期研究已鑒定出的52 個細胞焦亡相關基因。

圖2 銀屑病皮損區和正常區皮膚組織樣本分布Fig. 2 Distribution of skin tissue samples from psoriasis lesions and normal areas

1.2 方法

1.2.1 銀屑病差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的分析和篩選 使用R 語言（4.2.2 版本）在Ubantu 平臺（22.04 版本）上進行數據分析。使用Limma 包（3.54.2 版本）分析GSE109248 數據集中銀屑病患者皮損區和非皮損區組織樣本之間的差異表達基因（銀屑病DEGs），篩選條件為P≤0.01。使用 DrawVennDiagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be）工具繪制韋恩圖鑒定比較銀屑病DEGs 和52 個細胞凋亡DEGs 相關基因的交集。

1.2.2 細胞焦亡銀屑病DEGs 基因本體（gene ontology，GO）富集分析 使用WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit（WebGestalt 2019）[15]對銀屑病和細胞焦亡相關基因進行富集分析，篩選條件為P≤0.01，鑒定相關生物過程及對應拓撲關系。

1.2.3 構建轉錄調節網絡 基于Python（3.8.16 版本）在Ubantu 平臺（22.04 版本）上預測銀屑病DEGs的轉錄調節關系網絡。使用基于隨機樹基因相關性算法GENIE3[16]預測銀屑病DEGs的上游轉錄因子，并提取相關性最高的0.5%調節關系。從預測的調節關系中，分別提取直接調節細胞焦亡和間接調節細胞焦亡的調節因子并使用Cytoscape 軟件（3.8.0 版本）繪制預測的調節網絡。

1.2.4 化學藥篩選 使用Coremine 綜合數據庫（https://coremine.com/medical/）和DGIdb 綜合數據庫（https://www.DGIdb.org）[17]預測作用在核心基因（Hub）轉錄因子的批準的藥物分子，數據庫包含NCBIEntrez、DrugBank、PharmGKB 等臨床試驗數據及PubMed 發表的工作內容。

1.2.5 中藥篩選 將細胞焦亡過程和銀屑病發病過程的交集基因及調節這些基因的轉錄因子提交至CTD綜合數據庫（https://ctdbase.org/），查找能夠調控這些基因的化學成分，選取CTD 數據庫中文獻支持數較高的化學成分，在COREMINE 數據庫（https://coremine.com/medical/）中尋找包含對應化學成分的中藥。參考《中國藥典》《中藥大辭典》《中華本草》《中藥學》等對這些中藥進行性味歸經和藥物分類的統計分析。

2 結果

2.1 銀屑病患者皮損區和非皮損區樣本的基因表達分析

根據篩選結果顯示，共有6408 個探針樣本表現出差異表達，且差異顯著（P值為0.01）。銀屑病DEGs 總計為5172 個。結果見圖3。

圖3 銀屑病DEGs 均值-差異圖Fig. 3 Mean-difference plot of psoriasi s DEGs

對銀屑病DEGs 進行富集分析，發現其涉及多個生物過程，具體見圖4。研究結果表明，在皮膚病變區域中，銀屑病DEGs 與細胞凋亡、細胞增殖、細胞遷移等生物過程密切相關，這些過程異常狀態下涉及T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等免疫細胞的活化和功能異常。這些異常的免疫細胞活動往往伴隨著銀屑病的發生，并導致病變區域出現角化不良、表皮屏障功能紊亂、炎癥細胞浸潤和鱗屑形成等病理特征。因此，研究結果顯示銀屑病DEGs 的差異表達與銀屑病病程的發展密切相關。

圖4 銀屑病DEGs 的有向無環圖Fig. 4 GO directed acyclic graph of psoriasis DEGs

2.2 銀屑病相關細胞焦亡基因的篩選及其富集分析

為進一步探究細胞焦亡基因在銀屑病發病過程中的作用，比較2 個生物過程涉及的表達基因，發現了13 個共同的DEGs（圖5-a）。這些基因包括與細胞凋亡途徑相關的半胱氨酸蛋白酶 5（cysteinasparate protease 5，CASP5）、CASP4、CASP3、CASP9和CASP8基因；與調節細胞內分泌途徑和蛋白質分解途徑相關的帶電多囊體蛋白6（charged multivesicular body protein 6，CHMP6）、CHMP2A和CHMP7基因；與炎癥途徑相關的IL-1β基因；參與核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide binding oligomerization domain containing，NOD）樣受體途徑的NOD1和PYD 和CARD 結構域包含蛋白（PYD and CARD domain containing，PYCARD）基因；與B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族凋亡相關的Bcl-2 相關X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）基因；以及編碼蛋白激酶A 家族的cAMP 依賴性蛋白激酶α催化亞基（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha ，PRKACA）基因，基因名稱如表1 所示。

圖5 銀屑病相關細胞焦亡基因的篩選及其富集分析Fig. 5 Screening and enrichment analysis of psoriasis related pyroptosis genes

表1 銀屑病與細胞焦亡共同差異表達基因Table 1 Differential expression genes of psoriasis and pyroptosis

進一步對篩選出來的13 個共同的DEGs 進行富集分析，GO 分析結果見圖5-b，GO 有向無環圖結構見圖5-c。結果顯示，包括CASP4、CASP5、CASP8在內的細胞焦亡基因在銀屑病中參與程序性細胞死亡的調節、蛋白酶活性的調節、內肽酶活性的調節、IL-1β 的產生等過程。進一步預測這些共同DEGs 的上游轉錄調節機制，以識別調控細胞焦亡生物過程和銀屑病病理過程的關鍵轉錄因子，進而描繪2 個生物過程交互的可能基因調控網絡。

2.3 銀屑病與細胞焦亡共同DEGs 的上游轉錄調控網絡

通過基因相關性分析，篩選出54 個轉錄因子調控7 個細胞焦亡和銀屑病共同DEGs（CHMP7、CASP8、CASP5、CHMP2A、CASP4、IL1B、BAX），共對應64 個轉錄調控關系（圖6）。預測的轉錄調控網絡模型并不完全聯通，而是劃分為CASP8調控網絡（圖6-a）、CASP5/CASP4調控網絡（圖6-b）、Bax調控網絡（圖6-c）、IL1B調控網絡（圖6-d）、CHMP2A調控網絡（圖6-e）、CHMP7調控網絡（圖6-f）6 個獨立的上游轉錄調控網絡。這可能意味著這些基因的表達機制在銀屑病的發病過程中呈現出相互獨立的模式。

圖6 銀屑病-細胞焦亡基因調控網絡模型Fig. 6 Regulatory network model of psoriasis-pyroptosis gene

研究發現與細胞焦亡過程和銀屑病發病過程共同DEGs（圖6 中以橘黃色標記）直接調節的轉錄因子（以紅色標記）比間接調節的轉錄因子（以藍色標記）具有更多的輸入調節和輸出調節關系，表明直接調節因子在調控網絡中可能具有重要的功能。更具體地，對于在細胞焦亡過程中發揮重要作用的CASP基因，發現轉錄調節因子維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）、鈣調蛋白結合轉錄激活因子2（calmodulin binding transcription activator 2，CAMTA2）和鋅指E 盒結合同源盒蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）可能直接調節CASP8的轉錄過程；轉錄因子轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、堿性亮氨酸拉鏈ATF 樣轉錄因子2（basic leucine zipper ATF-like transcription factor 2，BATF2）和催乳素調節元件結合蛋白（prolactin regulatory element binding，PREB）直接調節CASP4、CASP5的轉錄過程。根據以往研究，銀屑病的發病機制之一涉及通過抑制CASP 驅動的細胞焦亡來干預誘導銀屑病小鼠的病理癥狀[2-3]。尋找的上游轉錄因子可能是通過調節細胞焦亡過程逆轉銀屑病癥狀的關鍵基因節點。此前本團隊研究表明，在咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠模型的皮損中，pSTAT3 表達明顯上調。K5.STAT3C 轉基因小鼠也表現出典型的銀屑病樣皮損改變。通過STAT3 抑制劑或沉默干擾RNA阻斷STAT3 的激活，可以抑制模型的皮損發生。這些研究證明了STAT3 在銀屑病中的調節功能，并驗證了本研究預測的包括STAT3 在內的CASP基因上游轉錄調節因子，可能被用于尋找逆轉銀屑病病癥的藥物分子。隨后將系統篩選作用于這些重要轉錄因子的藥物分子，旨在尋找可能逆轉異常細胞焦亡過程的治療銀屑病的方案。

2.4 藥物-基因相互作用

為進一步探索尋找逆轉銀屑病病癥的藥物分子，在COREMINE 數據庫中搜索了作用于CASP基因的關鍵轉錄因子（包括STAT3）的治療藥物。結果顯示，與STAT3 相互作用的藥物有151 個，與VDR 相互作用的有52 個，與ZEB2 相互作用的有31 個，與BATF2 相互作用的有11 個，與PREB 相互作用的有6 個，與CAMTA2 相互作用的有4 個（P＝0.01）。其中，CysA、MTX 和異維A 酸與VDR和STAT3 均有作用，表明這3 種藥物可能通過作用于包括VDR 和STAT3 在內的多個基因靶點來逆轉銀屑病癥狀。這些藥物的銀屑病調節功能可以通過DGIdb 數據庫得到驗證。

進一步探索多靶向藥物分子是否作用于其他CASP 通路基因，發現這3 種藥物均調節CASP4和CASP8基因，而CysA 還作用于ZEB2 轉錄調節因子。在銀屑病-細胞焦亡網絡藥物篩選結果中，CysA、MTX 和異維A 酸這3 種藥物已被廣泛應用于治療銀屑病和其他自身免疫性疾病。研究結果表明，這3 種藥物可能通過調節細胞焦亡過程中的CASP 活性，在銀屑病的治療中發揮一定的作用。此外，本研究還進一步探索可能作用于CASP 家族基因及其上游基因調節網絡的中藥。

2.5 基于銀屑病-細胞焦亡基因網絡的中藥預測

為探索治療銀屑病的中醫藥解決方案，希望預測中藥及其化學成分通過干擾細胞焦亡與銀屑病的互作通路表達實現診療效果。為此，提交CASP 及其直接的上游轉錄因子至CTD 數據庫，并檢索對這些基因具有調控作用的化學成分。選擇CTD 數據庫中文獻支持度高的化學成分，將這些化學成分提交至COREMINE 數據庫檢索含有這些化學成分的中藥，選擇具有顯著統計學差異（P＜0.05）的中藥。結果顯示，99 味中藥作用于CASP基因及其上游調節因子，其中61 味中藥作用于細胞焦亡與銀屑病重疊基因CASP4、CASP5、CASP8，66 味中藥作用于轉錄調節因子 STAT3、VDR、ZEB2、CAMTA2、PREB 和BATF2（表2）。其中土茯苓、甘草、白花蛇舌草、白術、當歸、茯苓、赤芍、地黃、牡丹皮、防風、茜草、黃芩、丹參、川芎、蒼術、菟絲子、桂枝17 味中藥在本課題組的臨床實踐中得到廣泛應用[18]。這17 味中藥有11 味歸肝經，8 味歸脾經，意味著肝經和脾經在銀屑病和細胞焦亡過程中可能發揮重要作用。這與本課題組之前的研究結果相一致，研究發現通過咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠在肝郁狀態[19]或脾虛狀態[20]下皮損嚴重程度尤為顯著。這些發現不僅驗證了基于基因網絡模型尋找到的中藥治療方案，也為中醫歸經論治提供了新的思路。基于此，對發現的99 味中藥進行性味歸經統計，旨在進一步探索經絡和細胞焦亡調節的銀屑病發病過程的關系。

表2 作用于細胞焦亡與銀屑病重疊互作的直接調節因子Table 2 Direct regulator of overlapping interactions between pyroptosis and psoriasis

2.6 用藥頻次分析

為探索細胞焦亡調節的銀屑病發病過程中的經絡特點，根據《中國藥典》《中藥大辭典》《中華本草》《中藥學》等藥典書籍對被篩選出的中藥進行統計，發現中藥功能以清熱藥（20 次）、補虛藥（16次）為主；藥味以苦（55 次）、辛（44 次）、甘（41次）為主；藥性以寒/微寒（38 次）、溫/微溫（32 次）、平（17 次）為主；歸經以肝經（48 次）、肺經（43次）為主，較多涉及脾經（38 次）、心經（37 次）、胃經（31 次），見圖7。用藥頻次結果與本課題組臨床用藥習慣一致，意味著肝經用藥可能通過調節細胞焦亡影響銀屑病發病過程。同時，本研究結果也與近年來針對銀屑病作為心身疾病的屬性所提出的“從肝論治銀屑病”的理論相一致。首都醫科大學附屬北京中醫醫院皮膚科采用清肝涼血解毒方作為從肝經論治銀屑病的基礎方，相關研究結果表明從肝經論治銀屑病在治療過程中表現出良好的療效。此外，《素問·五臟生成篇》中提到“肺之合皮也，其榮毛也”的理論，說明肺在銀屑病治療中的重要地位。因此，歸經屬肝、肺和脾經的中藥可能通過影響細胞焦亡過程影響銀屑病病程。

圖7 用藥頻次分析Fig. 7 Analysis of medication frequency

3 討論

抑制CASP 驅動的角質形成細胞過度增殖是細胞焦亡過程調節銀屑病發病的機制之一，但是對于發病過程中的CASP基因表達的上游轉錄調節研究尚且缺乏。通過對銀屑病皮損組織和對照組織進行基因表達譜分析，發現包括CASP4、CASP5、CASP8、Bax、IL1B、CHMP2A以及CHMP7在內的13 個基因參與細胞焦亡調節的銀屑病發病過程，其中一些基因已被現有研究證實與細胞焦亡及銀屑病相關。臨床研究表明，細胞焦亡的特征是KC 產生IL-1β[21]，其在皮膚組織中的表達升高導致銀屑病患者皮損區域膿皰和水腫現象增多[22-23]，并且在咪喹莫特誘導的小鼠體內也能觀察到IL-1βmRNA 表達增強[24]。銀屑病慢性期表皮CASP8的表達下調可介導p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子-κB（nuclear factor kappa B subunit，NF-κB）/aspase-1/IL-1α 信號通路，導致S100 鈣結合蛋白A7（S100 calcium binding protein A7，S100A7）和IL-1α 分泌增加；銀屑病急性期CASP8表達下調可導致銀屑病患者皮膚中抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的持續釋放增加，有助于防御皮膚感染[25]。CASP4、CASP5聯合CASP11、細菌脂多糖形成非經典炎癥小體復合物，參與細胞膜破裂和裂解以及炎性因子如IL-18 和IL-1β 的釋放過程，導致銀屑病的發生和發展[26]。此外，細胞焦亡相關的Bax基因高表達可抵抗銀屑病皮損組織KC 凋亡[27]，從而減輕銀屑病的癥狀。這些研究驗證了細胞焦亡可通過基因表達異常、多種細胞因子失衡和信號轉導異常方面調控銀屑病的發病進程。

基于計算重構的細胞焦亡過程和銀屑病發生過程共同基因的上游轉錄調節網絡，探索了可能的靶點基因。發現包括STAT3、VDR、KLF3、RREB1、ATF6B、ZEB2 和KLF15 等轉錄調節因子通過調控細胞焦亡過程影響銀屑病的發生和發展。其中已有研究證實，STAT3 轉錄因子通過多個通路參與銀屑病。具體而言，KC 增殖和激活過程中分泌的C-X-C 模體趨化因子配體（C-X-C motif chemokine ligand 1/2，CXCL1/2）和IL-8 對樹突狀細胞、T 細胞和巨噬細胞等免疫細胞的活性產生刺激作用，并調節 IL-6、IL-8、IL-21、CCL20、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等細胞因子的表達。本研究預測發現，STAT3 可能作為上游轉錄因子調節CASP4基因的表達進而影響細胞焦亡過程參與銀屑病病程。此前的研究發現，CASP4和CSAP5共同參與非經典炎癥小體復合物的形成，通過激活GSDMD介導的細胞焦亡過程最終導致炎性因子的釋放，促進KC 增殖和角化異常[13]。本研究不僅預測了STAT3參與了GSDMD 相關信號通路，還發現BATF2 和PREB 以及STAT3 3 個轉錄因子共同調節CASP4和CSAP5，這意味著這些轉錄因子可能共同參與調控GSDMD的上游基因調控網絡。本研究預測了一個嶄新的機制，即STAT3 通過調節CASP4和CSAP5下游通路參與調控KC 的增殖和角化過程。另外，轉錄調節因子VDR 通過降低細胞焦亡相關蛋白的表達來調節細胞焦亡的發生。VDR 激動劑可以顯著減輕銀屑病的癥狀和促進皮膚愈合，VDR 水平越低，銀屑病的面積和嚴重程度指數（PASI 評分）越高。研究發現，在銀屑病中VDR 可以通過轉錄調節CASP8的表達，從而可能調節STAT3-GSDMEC-CASP8 通路，進而影響角質形成細胞的分化和增殖。利用COREMINE 綜合數據庫篩選了以STAT3-CASP 通路為中心的化學藥和中藥的相關信息，發現CysA、MTX 以及異維A 酸可以作用于包括STAT3、VDR 和ZEB2 在內的轉錄調節因子，以及包括CASP4和CASP8在內的Caspase 基因家族（圖8）。

圖8 STAT3-CASP4/5 通路誘導銀屑病細胞焦亡基因調控網絡 (由BioRender 網站繪制)Fig. 8 Induction of psoriasis cell apoptosis gene regulatory network through STAT3-CASP4/5 pathway (created with BioRender.com)

為探索治療銀屑病的中醫藥解決方案，本研究使用CTD 和COREMONE 數據庫獲得99 味以STAT3-CASP 通路為潛在靶點的中藥。其中清熱藥物的應用最為廣泛，涉及清熱解毒藥和清熱涼血藥，這體現了銀屑病的主要病機是以“毒”為首要致病因素，而“血分有熱”是其核心病理機制。此外，99 味預測藥物中有17 味中藥在臨床上被應用于治療銀屑病，且主要歸于肝、脾經。進一步統計預測藥物的中藥性味和歸經，發現預測的中藥藥性以寒、溫、平為主，藥味多為苦、辛、甘，歸經多屬于肝經和肺經。盡管寒與溫、苦與甘看似是相對的屬性，但在治療銀屑病時并不矛盾。這是因為銀屑病的病機主要是血熱，而苦味藥物具有清熱瀉火、涼血解毒的功效，因此臨床上常用苦寒藥物，如黃連、黃芩等。然而，由于銀屑病病程長久，為了避免久服苦寒藥物對中焦陽氣的傷害，通常會配合甘溫之品以制衡，如甘草、白術等。因此，盡管寒與溫、苦與甘看似是相對的，但當它們在配伍應用時，能夠協同作用，相互制約，共同發揮治療作用。將中醫傳統的宏觀整體辨證理論，包括識證、選方和遣藥，與基于基因和蛋白質的微觀辨證相結合，使中醫辨治更加精準化。這種結合為中醫藥的“守正創新“提供了新的途徑。

4 結論

本研究探討了參與細胞焦亡的基因在銀屑病發病機制中的共同調控作用，構建了細胞焦亡在銀屑病中差異表達的基因所涉及的信號通路網絡，以及與網絡中心節點存在相互作用的潛在中藥治療藥物。本研究為后續研究細胞焦亡基因在銀屑病發病過程中發揮的作用提供了嶄新的分析解決方案，但就目前的研究現狀來看，細胞焦亡基因的表達情況及機制仍未完全闡明，細胞焦亡基因在銀屑病發病過程中的作用仍需要進一步探索，中醫藥能否直接調控細胞焦亡通路，仍需要進一步進行大規模的基礎實驗驗證和臨床觀察。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突