混合菌種發酵雞骨泥香精基料工藝條件優化

馬瑩 田玉潭 劉軍 劉敦華

摘要：為充分開發雞骨的利用價值，該研究以雞骨泥酶解基料為原料，使用植物乳桿菌和戊糖片球菌對其進行發酵處理，分析不同菌種配比、發酵溫度、發酵劑接種量和發酵時間對發酵液氨基酸態氮含量、多肽含量、游離氨基酸含量以及感官評分的影響，采用單因素實驗和響應面實驗對發酵過程工藝條件進行優化。結果表明，發酵溫度對發酵效果的影響最顯著，其次是發酵劑接種量，最后是發酵時間，優化后最佳發酵溫度為33 ℃，發酵劑接種量為6%，發酵時間為49 h。經過驗證實驗，得到氨基酸態氮含量為0.222 1 g/100 g，多肽含量為2.784 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.79 mg/100 g。該研究建立的發酵工藝可為酶解發酵工藝提供技術參考，為肉制品副產物的資源化利用提供一定的理論依據。

關鍵詞：雞骨；酶解；發酵；響應面優化；氨基酸態氮

中圖分類號：TS251.94????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）12-0103-08

Optimization of Process Conditions of Chicken Bone Paste

Essence Basic Material by Mixed Strain Fermentation

MA Ying1， TIAN Yu-tan1， LIU Jun2， LIU Dun-hua2*

（1.School of Food Science and Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021， China;

2.School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： In order to fully develop the utilization value of chicken bone， with the enzymolysis basic material of chicken bone paste as the raw material， Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus are used for fermentation treatment. The effects of different strain ratios， fermentation temperatures， inoculation amount of starter and fermentation time on the content of amino acid nitrogen， polypeptides and free amino acids as well as the sensory score of the fermentation broth are analyzed. Single factor experiment and response surface experiment are used to optimize the process conditions during fermentation. The results show that the fermentation temperature has the most significant effect on the fermentation effect， followed by the inoculation amount of starter and the fermentation time. After optimization， the optimal fermentation temperature is 33 ℃， the inoculation amount of starter is 6% and the fermentation time is 49 h. After verification experiment， the content of amino and nitrogen is 0.222 1 g/100 g， the content of polypeptides is 2.784 g/100 g， and the content of total free amino acids is 67.79 mg/100 g. The fermentation process established in this study can provide technical references for enzymatic hydrolysis fermentation process and some theoretical basis for the resource utilization of meat by-products.

Key words： chicken bone; enzymatic hydrolysis; fermentation; response surface optimization; amino acid nitrogen

近年來，我國肉類產業發展迅猛，年產1 700多萬噸畜禽骨副產物，約含有165萬噸動物蛋白。按目前我國人均每日消耗75 g蛋白質計算，可以滿足約8 000萬人對蛋白質一年的需求量[1]。畜禽副產物中的畜禽骨含有豐富的蛋白質、骨膠、氨基酸、黏多糖等營養成分以及鈣、磷、鐵、鋅等微量元素，尤其在骨蛋白的水解產物中基本包含了蛋白質組成的所有氨基酸以及人體所必需的部分氨基酸，因此加工利用畜禽骨具有很高的實用價值[2]。

酶解和發酵可以顯著提升雞骨的可利用價值，雞骨經酶解后必需氨基酸、多肽含量得到提升[3]，蛋白質和脂肪通過發酵分解產生酚、多肽及醇類等風味成分[4]。與僅酶解或僅發酵骨副產品相比，在酶解的基礎上利用發酵技術可以很大程度上提升畜禽骨的利用率，生產高附加值的產品[5]。系列研究表明，使用混合發酵劑發酵產品，能有效降低產品中生物胺含量，提升風味，使產品具有較好的感官評價[6]，其發酵效果優于單一發酵劑，能彌補單一發酵劑的種種缺陷。因此，如何選擇恰當的菌種配比組合和工藝條件，提高發酵后氨基酸態氮含量、多肽含量、游離氨基酸含量及感官風味成為當前亟需解決的問題。

本研究主要采用植物乳桿菌和戊糖片球菌組合，在不同菌種配比、發酵溫度、發酵劑接種量和發酵時間的條件下對雞骨泥酶解基料的發酵情況進行監測，通過氨基酸態氮含量、多肽含量、游離氨基酸含量的變化探究不同的條件對雞骨泥酶解基料發酵效果的影響。該研究對發酵畜禽骨香精基料制品的工業化生產具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雞骨：購于市場；植物乳桿菌凍干粉：寧夏海達生物科技開發有限公司；戊糖片球菌凍干粉：上海北諾生物科技有限公司。

MRS肉湯培養基、平板計數瓊脂培養基：北京陸橋生物技術有限責任公司；氯化鈉：上海廣諾化學科技有限公司；甲醛溶液：天津市瑞金特化學品有限公司；考馬斯亮藍G-250：廣東誠信生物科技有限公司；牛血清蛋白：酷爾化學科技（北京）有限公司；無水乙醇、磷酸：徐州天鴻化工有限公司；三氯乙酸：廣州市金華大化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。福林酚試劑甲液、乙液：合肥博美生物科技有限責任公司；木瓜蛋白酶、風味蛋白酶（均為食品級）：河南萬邦實業有限公司；食鹽：中鹽上海市鹽業有限公司；葡萄糖：北京紅星化工廠。

1.2 儀器與設備

DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；T6型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-2F型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-150-B型生化培養箱 廣州瑞豐實驗設備有限公司；TDL-5-A型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；SE-150型高速粉碎機 北京科一科技有限公司；L-8900型全自動氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 雞骨泥酶解基料的制備

選擇木瓜蛋白酶和風味蛋白酶為水解酶，將新鮮雞骨粉粹成泥，與水按1∶1混合，85 ℃磁力攪拌30 min后調整適宜pH和溫度，加入水解酶充分酶解，90 ℃加熱滅酶后冷卻至室溫，過濾后添加葡萄糖和食鹽，4 ℃腌制5 h滅菌后備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種特性測定

將戊糖片球菌和植物乳桿菌的凍干粉用MRS培養基活化。將活化好的兩種菌株分別接種到10支10 mL的試管中，在37 ℃培養箱中培養，每4 h測定OD600 nm值和pH值；另將活化好的兩種菌株吸取10 mL，加入到0%、3%、6%、9%、12% NaCl的耐鹽性培養基中，在37 ℃培養48 h后，測定OD600? nm值；接種1%活化后的菌種，培養至對數生長期，采用系列稀釋和平板計數法對活菌進行計數。

1.4.2 雞骨泥酶解基料發酵工藝優化研究

1.4.2.1 單因素實驗設計

控制單一因素參數，研究菌種配比、發酵劑接種量、發酵溫度、發酵時間4個主要因素對發酵工藝的影響。具體操作：固定接種量為6%（107 CFU/mL），在30 ℃發酵36 h，研究不同菌種配比（植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例分別為1∶1、2∶1、1∶2）對發酵效果的影響；固定植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例為1∶1，在30 ℃的培養箱中培養36 h，研究不同發酵劑接種量2%、4%、6%、8%、10%（107 CFU/mL）對發酵效果的影響；固定植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例為1∶1，發酵劑接種量為6%（107 CFU/mL），發酵時間為36 h，研究不同發酵溫度20，25，30，35，40 ℃對發酵效果的影響；固定植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例為1∶1，發酵劑接種量為6%（107 CFU/mL），發酵溫度為30 ℃，研究不同發酵時間24，36，48，60，72 h對發酵效果的影響。

1.4.2.2 響應面優化實驗

依據單因素實驗結果，選取發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）以及發酵溫度（C）為響應因素，以氨基酸態氮含量、多肽含量、總游離氨基酸含量為響應值，根據Box-Benhken原理設計三因素三水平實驗，優化雞骨泥酶解基料的發酵工藝。實驗因素及水平設計見表1。

1.4.3 發酵指標測定

1.4.3.1 氨基酸態氮含量的測定

氨基酸態氮含量參考GB/T 5009.39－2003《醬油衛生標準的分析方法》[7]進行測定。

1.4.3.2 多肽含量的測定

多肽含量參考付曉燕等[8]的方法進行測定，稱取樣品2～3 g，用15%三氯乙酸溶液溶解并定容至25 mL，混勻，靜置5 min，過濾。取1 mL樣液，加入福林酚試劑甲液5 mL，混勻，30 ℃下保溫10 min；再加入福林酚試劑乙液0.5 mL，混勻，30 ℃下保溫40 min，于500 nm處測定吸光值，通過牛血清蛋白標準曲線方程y=1.247x+0.083 3（x為濃度，mg/mL；y為吸光值，R2=0.995 7），計算多肽含量。

1.4.3.3 游離氨基酸含量的測定

游離氨基酸含量參考馬浩然[9]的方法進行測定。取5 g雞骨泥酶解基料發酵樣品于25 mL容量瓶中，用10%的三氯乙酸溶液定容至刻度，超聲振蕩30 min，混勻后靜置1 h，用雙層濾紙過濾后以10 000 r/min離心10 min，取適量發酵液于氨基酸自動分析儀中檢測。

1.4.4 感官評價

量取5 mL發酵液置于一次性口杯中，評定小組由10名食品專業的同學組成，對樣品進行評分，感官評定標準見表2。

1.5 數據分析

所有數據平行測定3次，取平均值，采用Excel 2016對數據進行統計并計算標準差，采用Origin 2022對數據進行繪圖。運用Design-Expert 8.0進行響應面分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌種特性分析

2.1.1 菌種生長曲線和產酸特性分析

菌種生長曲線和產酸特性見圖1。

一般來說，菌種的高活性時期是在對數生長期末期到穩定期前期[10]。由圖1可知，隨著發酵的進行，兩種菌種均在4 h后進入對數生長期，在4～8 h生長速率加快，20 h后進入生長穩定期。除了在剛進入對數生長期時，植物乳桿菌的生長速率比戊糖片球菌快，其余生長期內的速率均呈同步趨勢，從同時期菌種產酸特性來看，菌種在4～8 h隨著其生長趨勢的增長，其產酸速率隨之加快。兩種菌均具有高產酸能力，隨著生長環境pH降低，同時存在厭氧環境，更有利于菌種生長繁殖，到20 h時pH降低至3.8左右后，兩種菌株的生長速率不再增加，原因可能是菌種在對數生長期生長代謝活躍，相關酶活性較強，加快了乳酸的生成速率，進入穩定期后營養物質被過度消耗以及積累了大量的代謝產物，從而抑制了菌種的生長代謝，使得產酸速率降低。彭健斌等[11]利用乳酸菌發酵羊肉，發現兩種乳酸菌均在4 h后生長速率加快，植物乳桿菌和戊糖片球菌分別在18 h和16 h進入穩定期，與本研究結果類似。說明植物乳桿菌、戊糖片球菌均具有較大的產酸量，在發酵過程中處于優勢地位，有助于改善發酵產品的風味，同時能夠在發酵過程中抑制其他微生物的生長。由此可知，植物乳桿菌和戊糖片球菌的最佳收獲期為：植物乳桿菌12～16 h，戊糖片球菌12～16 h。

2.1.2 菌種耐鹽特性分析

菌種耐鹽特性見圖2。

由圖2可知，兩種菌株在食鹽濃度為0%～6%時，OD600? nm值較穩定，說明菌株在此范圍內生長不受食鹽濃度的影響。當食鹽濃度大于6%時，菌株的OD600 nm值迅速降低，說明該階段菌株的生長受到食鹽濃度的抑制。高濃度的鹽使得微生物細胞的外界滲透壓升高，細胞嚴重失水，生長代謝受到抑制。張超等[12]在對菌種耐鹽特性的研究中也得到類似的結果。肉制品在發酵過程中食鹽的適宜添加量為2.5%～3.0%[10]，菌種在此食鹽濃度范圍內均具有較高的活性，因此這兩種菌株均適用于發酵骨制品的生產。

2.1.3 活菌計數

菌種的活菌計數結果見表3。

在生產發酵肉制品時，發酵劑的最適接種量為106 CFU/mL[13]。由表3可知，菌種的計數結果均高于106 CFU/mL，因此這兩種菌株的接種量均符合骨制品在發酵過程中的要求。

2.2 最佳工藝配方的篩選

2.2.1 菌種配比對發酵效果的影響

不同菌種配比對酶解雞骨發酵液氨基酸態氮含量和感官評分的影響見圖3。

由圖3可知，菌種配比為1∶2組的氨基酸態氮含量（0.15 g/100 g）較其他兩組高，菌種配比為1∶2和2∶1兩組的感官評分較高。由于微生物在發酵過程中自身生長代謝，有助于分解骨中的蛋白質和脂肪，從而產生游離氨基酸和游離脂肪酸，同時也會產生多種風味物質，如乙酸、雙乙酰和丙酸等，有益于發酵產品形成獨特的風味[14]。片球菌屬作為骨制品發酵過程中的優勢菌株，發酵雞骨風味的形成與其生長代謝有很大的關聯[15]。綜合來看，菌種配比為1∶2組的氨基酸態氮含量和感官評分均最高。因此，兩種菌株的適宜配比為植物乳桿菌∶戊糖片球菌為1∶2。

2.2.2 發酵劑接種量對發酵效果的影響

不同發酵劑接種量對酶解雞骨發酵液氨基酸態氮含量和感官評分的影響見圖4。

由圖4可知，酶解雞骨發酵液的氨基酸態氮含量隨著發酵劑接種量的增加先升高后降低，原因可能是當接種量超過一定量時，菌體會消耗更多的營養成分用于生長代謝，同時接種量過大反而會抑制乳酸菌的生長[16]，導致氨基酸態氮含量下降，接種量過低又使得發酵產生的風味物質不足[17-18]。接種量為6%、8%組的感官評分較高。楊秀娟等[19]對發酵香腸進行工藝優化，發現當發酵溫度控制在30 ℃左右時，有利于菌種的生長代謝，從而抑制腐敗微生物的生長，并且當接種量為6%時，成品無明顯酸味，風味良好，與本研究結果相一致。綜合來看，當接種量為6%時，感官評分和氨基酸態氮含量均較高，因此，發酵劑的適宜接種量為6%。

2.2.3 發酵溫度對發酵效果的影響

不同發酵溫度對酶解雞骨發酵液氨基酸態氮含量和感官評分的影響見圖5。

由圖5可知，氨基酸態氮含量和感官評分隨著發酵溫度的升高先上升后下降，氨基酸態氮含量在發酵溫度為30，35，40 ℃時均較高，感官評分在發酵溫度為35 ℃時最高，骨產品在發酵時溫度過高，可能會導致發酵初期其他雜菌快速增長，溫度過低，又不利于發酵劑菌株的生長代謝，從而抑制生物酶的分泌，影響發酵雞骨的品質[20]。張蕓等[21]基于戊糖片球菌發酵酶解鯽魚基料進行工藝優化，發現發酵溫度對發酵效果的影響高于發酵時間，與本研究結果相一致。因此，綜合來看，確定最適發酵溫度為35 ℃。

2.2.4 發酵時間對發酵效果的影響

不同發酵時間對酶解雞骨發酵液氨基酸態氮含量和感官評分的影響見圖6。

由圖6可知，酶解雞骨發酵液的氨基酸態氮含量隨著發酵時間的延長先上升后下降，可能是因為發酵時間過短不足以使微生物大量繁殖，相關酶活性減弱，風味物質沒有得以完全轉化；發酵時間過長，菌體大量繁殖，營養物質被嚴重消耗，造成發酵產物又被充當為底物再次參與反應。左勇等[22]對豬骨酶解液進行工藝優化，發酵時間對發酵效果影響的變化趨勢與本研究結果相一致。感官評分在發酵時間為36，48，60 h時較高。因此，確定最適發酵時間為48 h。

2.3 響應面工藝優化

2.3.1 響應面實驗設計及結果

綜合單因素實驗結果，以氨基酸態氮含量、多肽含量、總游離氨基酸含量為響應值，選取3個影響最大的因素：發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）和發酵溫度（C）優化雞骨泥酶解基料發酵工藝。采用Design-Expert 8.0軟件設計三因素三水平的響應面實驗，實驗結果見表4。

2.3.2 氨基酸態氮含量的響應面分析

對氨基酸態氮含量與發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）3個因素進行多元回歸擬合分析和方差分析，得到氨基酸態氮含量的二次多項回歸模型：氨基酸態氮含量=0.22+0.015A+0.007 913B－0.030C－0.004 850AB－0.022AC－0.021BC－0.005 765A2 －0.013B2－0.061C2。

回歸模型方差分析見表5。

由表5可知，各因素對氨基酸態氮含量影響的大小順序為C（發酵溫度）>A（發酵劑接種量）>B（發酵時間），R2=0.873 3，RAdj2=0.710 4，說明該回歸模型能反映71.04%響應值的變化。氨基酸態氮含量的模型顯著，失擬項不顯著，模型擬合良好，可靠性高。

由圖7可知發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）之間的交互作用對酶解雞骨發酵液氨基酸態氮含量的影響。三維響應面坡度的陡峭或平緩程度與響應值對實驗因素的改變是否敏感密切相關[23]。發酵劑接種量（A）與發酵溫度（C）對氨基酸態氮含量的交互作用最顯著，坡度相對最陡；發酵時間（B）與發酵溫度（C）之間的交互作用較顯著，坡度較陡；發酵劑接種量（A）與發酵時間（B）之間的交互作用最不顯著，坡度最緩。

2.3.3 多肽含量的響應面分析

對多肽含量與發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）3個因素進行多元回歸擬合分析和方差分析，得到多肽含量的二次多項回歸模型：多肽含量=2.75+0.15A+0.017B－0.33C－0.072AB+0.087AC－0.15BC－0.29A2－0.072B2－0.60C2。

回歸模型方差分析見表6。

通過回歸模型的方差分析能夠判斷出該模型的可靠性，同時判斷出發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）對多肽含量影響的大小。由表6可知，各因素對多肽含量影響的大小順序為C（發酵溫度）>A（發酵劑接種量）>B（發酵時間），多肽含量的模型極顯著，失擬項不顯著，模型擬合良好，可靠性高。R2=0.951 8，RAdj2=0.889 8，說明該回歸模型能反映88.98%響應值的變化。

由圖8可知發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）之間的交互作用對酶解雞骨發酵液多肽含量的影響。發酵劑接種量（A）與發酵溫度（C）對多肽含量的交互作用最顯著，坡度最陡；發酵時間（B）與發酵溫度（C）之間的交互作用較顯著，坡度較陡；發酵劑接種量（A）與發酵時間（B）之間的交互作用最不顯著，坡度最緩。

2.3.4 總游離氨基酸含量的響應面分析

對總游離氨基酸含量與發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）3個因素進行多元回歸擬合分析和方差分析，得到總游離氨基酸含量的二次多項回歸模型：總游離氨基酸含量=67.47+2.52A－0.25B－2.29C－0.98AB－1.92AC－0.81BC－7.18A2 －7.07B2－5.34C2。

回歸模型方差分析見表7。

通過回歸模型的方差分析，能夠判斷出該模型的可靠性，同時判斷出發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）對總游離氨基酸含量影響的大小。由表7可知，各因素對總游離氨基酸含量影響的大小順序為A（發酵劑接種量）>C（發酵溫度）>B（發酵時間），總游離氨基酸含量的模型極顯著，失擬項不顯著，模型擬合良好，可靠性高。R2=0.984 5，RAdj2=0.964 5，說明該回歸模型能反映96.45%響應值的變化。

由圖9可知發酵劑接種量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）之間的交互作用對酶解雞骨發酵液總游離氨基酸含量的影響。發酵劑接種量（A）與發酵時間（B）對總游離氨基酸含量的交互作用最顯著，坡度最陡；發酵時間（B）與發酵溫度（C）之間的交互作用較顯著，坡度較陡；發酵劑接種量（A）與發酵溫度（C）之間的交互作用最不顯著，坡度最緩。

2.3.5 最優發酵工藝條件的驗證

通過Design-Expert 8.0軟件分析結果得出：在發酵劑接種量為6.64%，發酵時間為49.14 h，發酵溫度為33.55 ℃時，理論值氨基酸態氮含量為0.231 1 g/100 g，多肽含量為2.802 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.84 mg/100 g。為了適于實際生產需要，將工藝參數調整為發酵劑接種量6%、發酵時間49 h、發酵溫度33 ℃。在此工藝下進行驗證實驗，得到氨基酸態氮含量為0.222 1 g/100 g，多肽含量為2.784 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.79 mg/100 g，預測值接近于實際值，說明利用該模型優化后的工藝參數可應用于實際生產中。

3 結論

經過單因素實驗和響應面優化，得出發酵溫度對發酵效果的影響最顯著，其次是發酵劑接種量，最后是發酵時間，并且優化后最佳發酵溫度為33 ℃，發酵劑接種量為6%，發酵時間為49 h。經過驗證實驗，得到氨基酸態氮含量為0.222 1 g/100 g，多肽含量為2.784 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.79 mg/100 g。結果表明，酶解發酵技術可以提高雞骨泥原料的利用率，可為利用雞骨開發天然營養食品和食品添加劑提供新思路。

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收稿日期：2023-07-13

基金項目：國家星火計劃項目（2015GA880005）；寧夏回族自治區自然科學基金項目（2021AAC03013，2022AAC02021）；寧夏回族自治區農業科技自主創新資金項目（NGSB-2021-6-05）

作者簡介：馬瑩（1998－），女，碩士研究生，研究方向：食品營養與質量控制。

*通信作者：劉敦華（1964－），男，教授，博士，研究方向：食品質量安全控制技術與研究。