姜荷花桑巴雜種后代鑒定及遺傳多樣性

柯玲俊，彭坤樺，陸鑾眉，余惠文*

（1.閩南師范大學生物科學與技術學院，福建 漳州 363000；2.閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室，福建 漳州 363000）

姜荷花（Curcumaalismatifolia）為姜科姜黃屬球根花卉，在夏秋季節開花，其不育苞片形態類似荷花，花形一般較大，具有顏色艷麗、瓶插期長的特點.因姜荷花具有形花色優美，觀賞價值高；花期長，在熱帶亞熱帶適種地區花期可從5 月一直持續到11 月；種球不易發生退化現象，病蟲害少，易栽培等優點，近年來作為園林花境、花壇、盆花以及鮮切花等被廣泛推廣應用.但當前國內姜荷花品種資源的數量較少，一定程度上限制了姜荷花的市場應用.雜交育種是選育姜荷花新品種行之有效的一種方法[1]，而雜種后代及時的甄別，去偽存真，是進行雜交育種工作的重要環節.

SSR (simple sequence repeats)即簡單重復序列，是一種以特異引物PCR 為基礎的分子標記技術.SSR分子標記被廣泛應用于植物遺傳多樣性分析及育種研究.胡偉等[2]進行了姜黃屬花卉種質資源表型性狀分析的研究，對16 份姜黃屬植物的11 個數量性狀及7 個質量性狀進行因子和聚類分析，毛俐慧等和Taheri等以前期高通量測序結果為基礎，對轉錄組數據的SSR位點進行發掘和分析，研究分析了姜荷花全長轉錄組微衛星序列的組成，開發了姜荷花SSR 標記，且SSR 被用于研究姜荷花品種遺傳多樣性[3-6].這些研究為姜荷花雜種后代的鑒定及遺傳多樣性研究打下了堅實的基礎.

分別采集來自漳州的29 份姜荷花桑巴×黃色夢幻及27 份桑巴×清邁粉雜交子代，利用SSR 分子標記技術對其進行真雜種鑒定，并開展遺傳多樣性分析，闡明其親緣關系及遺傳結構，為下一步進行姜荷花新品種選育提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 植物材料

所采用的樣品黃色夢幻（'Siam TM Sitrone'）、桑巴（'Siam TM Samba'）、清邁粉（'Chiang Mai Pink'）、桑巴×黃色夢幻、巴×清邁粉（圖1）及桑巴后代的采集來自均漳州.實驗所用材料為各種質材料生長良好的健康葉片.

圖1 3份姜黃屬種質資源親本及子代Fig.1 Three parents germplasms of Curcuma and offsprings

1.2 SSR及數據分析

在前人合成的84對SSR 引物[3-4]和閩南師范大學閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室開發的97對引物中篩選出了11 對條帶清晰，多態性高，重復性好的SSR 引物（表1）用于56 個姜黃屬種質資源的真雜種鑒定和遺傳多樣性分析.PCR 擴增體系為10 μL，由ddH2O 3.4 μL、正反向引物各0.3 μL、Thermo Scientific? DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 5 μL、濃度為100 ng/μL 的模板DNA 1 μL 組成.循環步驟為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性45 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個循環；72 ℃總延伸5 min.用6%聚丙烯酰胺凝膠對變性PCR 產物進行電泳檢測.運用PowerMarker 3.25 分析多態性信息量(polymorphism information content，PIC)[7].用MEGA 6中的鄰接法進行系統發育分析[8].

表1 SSR引物Tab.1 SSR markers used in this study

2 實驗結果與分析

2.1 真雜種鑒定

利用5對具有父本特征條帶的SSR引物對以黃色夢幻為父本和7對具有父本特征條帶的SSR引物對以清邁粉為父本的2 個雜交群體和對應親本分別進行分子鑒定.桑巴×黃色夢幻的29 株F1 采用引物c20439、c20865、CuA51、CuA60、CuAl15 進行鑒定.引物c20439 可將25 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為86.21%；引物c20865可將23株材料鑒定為真雜種，鑒定率為79.31%；引物CuA51可將23株材料鑒定為真雜種，鑒定率為79.31%；引物CuA60 可將26 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為89.66%；引物CuAl15 可將26株材料鑒定為真雜種，鑒定率為89.66%.5對SSR引物鑒定桑巴×黃色夢幻的29株子代均為真雜種.

桑巴×清邁粉的27 株F1 采用引物c20865、c12365、c27068、CuA7、CuAl20、CuAl25、CuA62 進行鑒定.引物c20865可將20株材料鑒定為真雜種，鑒定率為74.07%；引物c12365可將24株材料鑒定為真雜種，鑒定率88.89%；引物c27068可將19株材料鑒定為真雜種，鑒定率為70.37%；引物CuA7可將9株材料鑒定為真雜種，鑒定率為70.37%；引物CuAl20可將22株材料鑒定為真雜種，鑒定率為81.48%；引物CuAl25可將22 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為81.48%；引物CuA62 可將22 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為81.48%.7對SSR引物鑒定桑巴×清邁粉的27株子代均為真雜種.

2.2 親緣關系分析

基于GenAlEx 6.5分別計算2個桑巴姜荷花雜交組合的子代間的遺傳距離，利用MEGA 6中的鄰接法（Neighbor-joining）法進行親緣關系分析，構建出系統發育聚類圖(圖2).桑巴×黃色夢幻雜交后代29 份姜荷花種質資源可分成兩個組群，其中：紅色部分為亞群1，綠色部分為亞群2.亞群1 包括9 個雜種，該9 個雜種與父母本遺傳距離較近，亞群2包括20份雜種，該20個雜種與父母本遺傳距離較遠，這部分或產生綜合父母本優良性狀的新品種的可能性更高.桑巴×清邁粉雜交后代27份姜荷花種質資源可分成三個組群，紅色部分為亞群1，綠色部分為亞群2，藍色部分為亞群3.亞群1 包括9 個雜種，該9 個雜種與父本清邁粉遺傳距離較近，亞群2 包含4 個雜種，該4 個雜種與母本桑巴遺傳距離較近，亞群3 包括14 個雜種，與父母本遺傳距離較遠，這部分或產生綜合父母本優良性狀的新品種的可能性更高.

圖2 2組姜荷花子代種質資源鄰接法聚類分析Fig.2 Neighbor-joining clustering analysis of 2 groups offspring germplasm resources of Curcuma alismatifolia.

2.3 遺傳多樣性分析

使用PowerMaker 軟件分析了桑巴后代56 份姜荷花種質資源的遺傳多樣性.桑巴×黃色夢幻雜交后代篩選出的引物見表2，基因多樣性平均值為0.696，最高的引物為CuA60（0.807）.雜合度平均值為0.755，最高的引物為CuAl15 和CuA60（0.903）.引物多態信息含量（PIC）平均值為0.646，其中PIC 最高的為CuA60（0.781）.桑巴×清邁粉雜交后代篩選出的引物見表3，基因多樣性平均值為0.744，其中基因多樣性最高的為CuA7（0.797）.雜合度平均值為0.640，其中雜合度最高的為CuA62（0.828）.引物多態信息含量（PIC）平均值為0.703，最高的引物為CuA7（0.766）.篩選出的11 對引物均為高多態性引物（PIC＞0.5）.

表2 桑巴×黃色夢幻的SSR分析Tab.2 SSR analysis of 'Siam TM Samba' × 'Siam TM Sitrone'

表3 桑巴×清邁粉的SSR分析Tab.3 SSR analysis of 'Siam TM Samba' × 'Chiang Mai Pink'

3 討論

雜交是品種選育、群體構建和重要基因定位等操作的基礎.目前，雜交育種仍是新品種選育的有效手段，通過雜交重組可實現多目標性狀基因的改良.但是在雜交過程中，人工操作不規范、自花授粉等原因易造成雜交后代混雜，因此對雜交后代進行早期真雜種鑒定，淘汰假雜種是植物種質創新工作中的重要環節，也能為后期其他分子標記輔助育種如指紋圖譜和遺傳圖譜的構建等工作提供參考[9-10].種質資源收集鑒定是育種工作的基石，而種質資源的鑒定及優良基因的發現，均離不開分子標記對種質資源的遺傳多樣性分析.

SSR 標記技術具有操作簡便、多態性高、成本較低，在種質資源鑒定和遺傳多樣性的研究中廣泛被應用.賴小群等[11]應用SSR分子標記進行新臺糖25號×云蔗89-7真雜種鑒定.田春艷等[12]利用SSR分子標記進行甘蔗野生種割手密F1 代的鑒定和遺傳分析.桃汪陽等[13]應用SSR 分子標記鑒定黑麥草F1 代雜種鑒定.應用EST-SSR 標記進行花楸樹和少葉花楸雜交F1 代群體的遺傳關系分析和雜種鑒定[14].李洋益等[15]利用ISSR引物分子標記分析國產姜黃屬植物的遺傳多樣性等不同標記類型以及表型分析.

本研究中應用篩選的11 對SSR 標記引物c20439、c20865、c12365、c27068、CuA7、CuA51、CuA60、CuA62、CuAl15、CuAl20和CuAl25均為高多態性引物其PIC值均高于0.5，將桑巴兩個雜交組合的56個雜種鑒定為真雜種.研究結果通過親緣關系分析和和遺傳多樣性分析表明姜荷花桑巴×黃色夢幻和姜荷花桑巴×清邁粉后代類群具有較高的遺傳多樣性.研究中使用的SSR分子標記僅能對子代進行真雜種鑒定，未能對具有育種目標性狀的子代進行早期篩選和鑒定.因此，在未來的姜荷花相關研究中，可擴大研究群體的范圍，選擇遺傳背景差異大且親緣關系相對較遠的姜荷花材料作為親本，根據育種目標開發與目標性狀相關聯的分子標記，在子代早期進行鑒定和篩選，以此增加獲得優勢雜種以及優良性狀的姜荷花新品種的幾率，提高育種效率并加快育種進程.