基于虛擬篩選技術的清感冬飲防治新型冠狀病毒感染的潛在活性成分與作用機制研究*

張敏，李紫璇，陳佩佩，顏久興，曹蔚然，柴美紅，王躍飛，于飛

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津 300070；3.西安市中醫醫院藥劑科，西安 710021）

新型冠狀病毒感染傳染性強，傳播速度快，對社會經濟發展和人類生命健康安全構成巨大威脅，臨床表現主要為發熱、干咳、乏力等，部分患者出現鼻塞、流涕、咽痛、嗅覺味覺減退或喪失、結膜炎、肌痛和腹瀉等癥狀[1]。截至2023 年4 月12 日，世界衛生組織（WHO）報告了超過7.6 億例確診病例，死亡人數近690 萬例[2]，給全球公共衛生安全帶來巨大挑戰。

COVID-19 由新型冠狀病毒感染引起，隨著病毒不斷變異，奧密克戎變異株成為現階段主要流行的病毒株，臨床循證醫學證據表明，中醫藥的早期介入有利于阻斷COVID-19 的發生發展[3-4]。《天津市新型冠狀病毒肺炎中醫藥防治方案（試行第六版）》密切接觸者預防方案和無癥狀感染者治療方案中，“清感飲”系列茶藥被列為推薦的有效藥物[5]。清感冬飲作為防治COVID-19 的推薦藥物，在臨床中廣泛應用[6]。該方由黃芪、虎杖、炒牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫蘇葉、金銀花、焦山楂、甘草片和紅茶11 味中藥組成，具有益氣固表、清熱解毒、清咽利喉、宣肺止咳等功效。

目前，清感冬飲的研究主要聚焦成分表征、組方分析及臨床療效評價等[6-8]，尚無其防治COVID-19的活性物質及作用機制研究的報道。因此，本研究基于已報道的清感冬飲中所含化學成分，通過網絡藥理學探究組方中發揮防治COVID-19 作用的潛在活性組分和作用靶點，并進一步構建分子對接模型，評價活性化合物與關鍵靶點間的相互作用，初步闡釋清感冬飲防治COVID-19 的可能作用機制，為后續研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 網絡藥理學研究方法

1.1.1 清感冬飲的信息收集和靶點篩選 基于文獻中已報道的化學成分，借助TCMSP 數據庫[9]（https：//tcmsp-e.com/）和SwissTargetPrediction 數據庫[10]（http：//swisstargetprediction.ch/）獲取相應靶標，并通過UniProt 數據庫[11]（https：//www.uniprot.org/）檢索靶標對應的基因，獲得確切靶標信息。

1.1.2 “藥材-制劑-成分-靶點”網絡構建 將清感冬飲的化學成分及其靶標信息導入Origin 中，構建“藥材-制劑-成分-靶點”網絡圖。

1.1.3 疾病靶點檢索 在GeneCards 數據庫[12]（https：//www.genecards.org/） 和DrugBank 數據庫[13]（https：//go.drugbank.com/） 中以 “novel coronavirus pneumonia”和“COVID-19”為關鍵詞檢索疾病相關靶點基因，將基因根據“relevance score”值排序篩選，通過Venny 2.1 進行映射，獲得清感冬飲防治COVID-19 的潛在作用靶點。

1.1.4 蛋白- 蛋白相互作用（protein -protein interaction，PPI）網絡構建及核心靶點篩選 將1.1.3中共有靶點導入STRING 數據庫[14]（https：//cn.string-db.org/），物種限定為“homo sapiens”，置信度為0.400，得到PPI 網絡。將結果導入Cytoscape[15]軟件，根據degree 值進行核心靶點篩選。網絡節點面積越大、顏色越明亮，表示degree 值越高；邊越粗、顏色越明亮，表示combined score 值越高。

1.1.5 靶點通路分析 將1.1.4 中核心靶點基因列表導入DAVID 6.8 數據庫[16-17]（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物種為“homo sapiens”，進行基因本體論（gene ontology，GO） 和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，篩選P＜0.05 的生物過程及信號通路，將結果可視化處理。

1.1.6 清感冬飲主要成分的歸經網絡 從2020 年版《中華人民共和國藥典》[18]和文獻[19]中獲取藥材的歸經信息，并使用Cytoscape 軟件繪制清感冬飲“藥材-歸經”網絡。

1.2 分子對接研究方法 以清感冬飲的潛在活性成分作為配體，從PubChem 數據庫[20]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載其3D 化學結構，并通過PDB 數據庫[21]（http：//www.rcsb.org/）查找篩選獲得的與COVID-19 相關的4 個主要靶點，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（PDB ID：1FT4）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）（PDB ID：3O96）、血管內皮生長因子A（VEGFA）（PDB ID：6ZFL）以及血管緊張素轉化酶Ⅱ（ACE2）（PDB ID：1R4L），下載蛋白3D 結構作為受體，采用BIOVIA Discovery Studio 2020（簡稱DS）軟件進行分子對接。

1.2.1 蛋白準備 將蛋白結構導入DS 軟件，進行加氫、去水、調整鍵序、標準化原子名稱等前處理，以原配體所在的腔隙及文獻報道的具有相互作用的關鍵氨基酸殘基作為活性位點，去除原配體后將文件保存待用。

1.2.2 配體準備 將小分子3D 結構導入DS 軟件進行配體結構優化，小分子經加氫及能量最小化等操作后保存待用。

1.2.3 分子對接 將準備好的蛋白質受體與配體小分子在CDOCKER 模式下進行精準對接。以對接自由能（-CDOCKER INTERACTION ENERGY）為評價標準，指數較高的小分子構象即為最優構象，使用PyMOL 進行可視化分析。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 化學成分與靶點收集的結果 根據文獻[7]報道，清感冬飲通過質譜分析共鑒定了101 個化學成分，在TCMSP 數據庫和SwissTargetPrediction 數據庫中獲取化合物的作用靶點，使用UniProt 數據庫進行處理，得到藥材相關的具有潛在活性的化合物45 個，詳見表1，相關靶點基因260 個。

2.1.2 “藥材-制劑-成分-靶點”網絡的構建 采用Origin 軟件，以清感冬飲組方里的藥材篩選獲得的45 個成分，以及成分對應的靶點，構建“藥材-制劑-成分-靶點”網絡，結果如圖1 所示，組方里所含的多個化學成分與多個靶點相互作用，協同發揮功效。

圖1 “藥材-制劑-成分-靶點”網絡圖

2.1.3 COVID-19靶點檢索 在GeneCards和Drugbank數據庫中以“novel coronavirus pneumonia”和“COVID-19” 為關鍵詞檢索合并得到699 個疾病作用靶點。將篩選得到的疾病靶點與藥物靶點進行映射，得到66 個共有靶點，如圖2 所示。

圖2 清感冬飲與COVID-19 靶點韋恩圖

2.1.4 化學成分與靶點的PPI 網絡構建 將清感冬飲與COVID-19 的共有靶點輸入STRING 數據庫進行蛋白間相互作用分析，設定置信度為0.400 并隱藏游離節點，得到PPI 網絡，如圖3 所示。運用Cytoscape 軟件的Network Analyzer 工具進行網絡可視化，如圖4，該網絡共包含65 個節點和812 條邊，節點的平均degree 值為25.0。拓撲分析后選取degree 值排名前30 的靶點，如圖5 所示，提示這30個靶點可能是清感冬飲防治COVID-19 的潛在關鍵靶點。

圖3 PPI 網絡

圖4 PPI 網絡的拓撲分析

圖5 根據degree 值選擇的30 個核心基因

2.1.5 核心靶點通路分析結果 運用DAVID 6.8對2.1.4 中30 個核心靶點基因進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析（P＜0.05），選擇P 值排名前20 的條目繪制水平柱狀圖，如圖6～9 所示。GO富集分析獲得生物過程324 個、細胞組分24 種以及分子功能45 種，KEGG 信號通路富集分析獲得123 條信號通路，主要包括Toll 樣受體（TLR）、白介素-17（IL-17）、COVID-19 及炎癥性腸病（IBD）等信號通路及相關靶點基因，與免疫調節、炎癥修復、病毒抑制等生理過程密切相關，提示清感冬飲的活性成分具有抑制病毒入侵、改善炎癥反應、調節免疫功能等潛在的生理活性，多組分協同，多靶點、多途徑發揮防治COVID-19 的功效。

圖6 生物過程富集分析結果

圖7 細胞組分富集分析結果

圖8 分子功能富集分析結果

圖9 KEGG 信號通路富集分析結果

2.1.6 “藥材-歸經”網絡 根據2020 版《中國藥典》中清感冬飲主要藥味的歸經信息構建“藥材-歸經”網絡，如圖10 所示，11 味中藥中有9 味歸肺經，多數藥材歸為肺、胃、脾經，提示組方藥材對肺部疾病具有靶向性，具有化痰、宣肺、平喘的作用，與報道的組方可改善胸悶、咳嗽、呼吸不暢等肺部癥狀結論一致。

圖10 “藥材-歸經”網絡

2.2 分子對接分析 本研究基于網絡藥理學分析獲得的45 個具有潛在活性的中藥小分子與PPI 網絡分析所得潛在關鍵靶點，即TNF -α、AKT1、VEGFA，以及與病毒入侵相關的重要靶點ACE2 進行分子對接，其對接自由能如表1 所示，對接結果如圖11 所示。對接自由能取負值后進行排序，將取負值后的對接自由能在40-70 kcal/mol 之間定義為中等結合，大于70 kcal/mol 定義為強結合，結果顯示：與TNF-α 對接的化合物中，中等結合強度的有2 個（山柰酚-3-O-蕓香糖苷和鳶尾苷）；與AKT1對接的化合物中，中等結合強度的有33 個，強結合的有9 個（蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、原花青素B1、牛蒡酚E、鳶尾甲苷B、牛蒡子素A、牛蒡苷、原花青素B2、鳶尾苷）；與VEGFA 對接的化合物中，中等結合強度的有24 個，其中結合能大于50 的有12 個（蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、鳶尾苷、鳶尾甲苷B、牛蒡酚E、異綠原酸B、原花青素B1、異綠原酸A、原花青素B2、鳶尾甲苷A、牛蒡子素A、牛蒡苷）；與ACE2 對接的化合物中，中等結合強度的有13 個，強結合的有30 個，其中結合能大于80 的有15 個（山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異綠原酸B、原花青素B2、原花青素B1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、異綠原酸A、大黃素-8-O-葡萄糖苷、虎杖苷、牛蒡苷、蘆丁、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、牛蒡酚E、牛蒡子素A、馬錢酸、鳶尾甲苷B）。配體小分子與文獻報道的作用位點的關鍵氨基酸殘基具有氫鍵、π-π 共軛、鹽橋等相互作用，能夠結合于靶蛋白的活性作用口袋，對靶蛋白具有潛在的親和作用。通過歸一化后綜合排序評估，山柰酚-3-O-蕓香糖苷和蘆丁是組方中最具有抗病毒和抗炎潛力的化合物。

圖11 分子對接結果

3 討論

本研究通過網絡藥理學探究清感冬飲防治新冠肺炎的潛在物質基礎與作用機制，并通過分子對接篩選活性成分與靶點的最優復合物結構，評價小分子與靶點的結合方式，基于受體-配體相互作用模式，探究清感冬飲防治新冠肺炎的機制。

清感冬飲由黃芪、虎杖、炒牛蒡子等11 味中藥組成，據研究報道COVID-19 致病因素為濕毒，病位在肺[22]，組方中黃芪補肺健脾[23]，虎杖能夠改善肺血管重構，抑制肺纖維化[24]，紫蘇宣降肺氣[25]，牛蒡子宣肺袪痰、潤肺止咳[26]，金銀花清熱解毒、宣散風熱[27]，射干降火解毒、祛痰利咽、散結消炎、消腫止痛[28]，桔梗宣肺祛痰、利咽排膿[29]，赤芍清熱涼血、散瘀止痛[30]，焦山楂消食化積、行氣散瘀[31]，甘草鎮咳祛痰[32]，配以紅茶，性溫調和脾胃。組方11 味中藥有9 味歸肺經，多味中藥歸脾經和胃經，提示其作用機制可能與升降脾胃而祛濕敗毒密切相關，以上各藥相配伍，協同發揮益氣固表、清肺排毒、清咽利喉、宣肺止咳之功效。

本研究以組方鑒定獲得的101 個成分進行網絡藥理學分析，經網絡拓撲分析發現作用于COVID-19 的潛在活性成分有45 個，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、迷迭香酸、咖啡堿、（-）-表兒茶素、野鳶尾黃素等，涉及黃酮類、有機酸類、生物堿類、萜類等多種活性成分，其中天然黃酮類成分21 個，占比45.7%。據研究報道：黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、降壓、降血脂等多種作用，且黃酮類成分經腸道微生物降解，產生的代謝物被吸收后，可以上調I 型干擾素信號通路，進而增強機體免疫保護，激活抗病毒免疫反應[33]。

清感冬飲活性成分與COVID-19 共有靶點66 個，結合PPI 網絡分析及預測，VEGFA、AKT1 和TNF-α 等為關鍵核心靶點，這些核心靶點共同參與內分泌系統、免疫系統等綜合調節，發揮防治COVID-19的作用。VEGFA 屬血管內皮生長因子，多種細胞可分泌VEGFA，具有調節血管通透性的作用[34-35]，促進腫瘤血管形成，VEGFA 在COVID-19 患者體內表達水平顯著升高，與疾病嚴重程度呈正相關性[36]，影響新生血管的形成。TNF-α 是急性肺損傷中上調的促炎細胞因子之一，參與正常的炎癥反應和免疫反應，屬于炎癥級聯反應上游啟動的關鍵細胞因子，在炎性病理狀態下顯著增加，TNF-α 抑制劑可用于減緩COVID-19 的炎性反應[37]。AKT1 又稱為蛋白激酶B α，通過調節PI3K/AKT 信號通路，調控細胞增殖與凋亡，AKT1 的活化與腫瘤的發生和發展密切相關，據報道AKT1 在炎癥的產生與肺炎癥細胞的存活和氧化應激中也發揮重要作用，影響COVID-19 等多種呼吸系統疾病的發生發展[38-40]。ACE2 受體是SARS-CoV-2 入侵宿主細胞的關鍵功能受體，介導病毒入侵[41]。SARS-CoV-2 通過表面刺突蛋白特異性識別肺泡上皮細胞表面的ACE2 受體，通過膜融合感染宿主細胞，完成病毒的復制和組裝，重新釋放，引發細胞因子風暴等炎癥反應，加速疾病的進展[42]。

富集分析結果顯示，組方治療COVID-19 可能與脂多糖（LPS）介導的信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、TLR 信號通路、IL-17 信號通路、晚期糖基化終末產物及其受體（AGEs-RAGE）糖尿病并發癥信號通路等途徑相關，參與免疫調節、炎癥修復和病毒抑制等多個生理過程。

以富集分析獲得的核心通路中的核心靶點，鎖定四個關鍵靶標，即VEGFA、AKT1、TNF-α 和ACE2，涉及基因表達、細胞增殖、細胞凋亡、藥物結合反應等多個生物過程。以分子對接驗證4 個核心靶點對45 個潛在活性成分的親和力，對接結果顯示，山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、原花青素B1、原花青素B2、鳶尾苷、鳶尾甲苷B、異綠原酸A/B、牛蒡苷、虎杖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等多個化合物與多個核心靶點具中等及以上強度的結合活性，形成較穩定的結合構象，涵蓋黃酮類、有機酸類、木脂素類、萜類等多種化合物類型，歸屬組方中包含金銀花、紅茶、虎杖、紫蘇、射干、牛蒡子等在內的多味藥材，說明組方通過有效配伍，多成分、多靶點、多途徑協同發揮防治COVID-19 的功效。

在篩選的活性成分中，通過歸一化研究分析發現山柰酚-3-O-蕓香糖苷和蘆丁對VEGFA、AKT1、TNF-α 和ACE2 均具有較好的結合活性。山柰酚-3-O-蕓香糖苷屬黃酮苷，具有抗糖化活性和神經保護作用，在治療炎癥方面，可通過抑制相關促炎因子的釋放或調控炎癥相關通路發揮抗炎作用，對炎癥誘發的疾病具有一定的治療作用[43-44]。蘆丁又稱為蕓香苷，屬于天然的黃酮苷，據研究報道，蘆丁具有抗炎、抗氧化活性，可減輕細胞和組織損傷[45-47]。山柰酚-3-O-蕓香糖苷和蘆丁作為組方中天然黃酮類化合物的代表，基于結構的特征，與核心靶點自發結合，表現出較好的結合活性，表明清感冬飲的藥效成分可能通過調控關鍵靶點，發揮抑制SARSCoV-2 入侵、緩解炎癥的作用。

4 結語

本研究基于清感冬飲分離鑒定獲得成分進行網絡藥理學分析與分子對接研究，表明清感冬飲可能通過山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁等主要黃酮類成分作用于TNF-α、AKT1、VEGFA 和ACE2 等靶點，通過調控脂質代謝與動脈粥樣硬化、TLR 信號通路、IL-17 信號通路等參與抑制病毒入侵、調節炎癥反應等多個生理途徑，協同發揮作用。組方以多個活性成分共同作用、多個關鍵靶點相互協同、多種作用途徑相互調控發揮對COVID-19 的防治作用，為清感冬飲防治COVID-19 提供了科學依據，為后續的基礎研究提供了理論支持。