基于網絡藥理學的消巖湯治療胃癌機制探討*

牛瀟菲，張暢，

（1.東營職業學院，東營 257091；2.平煤神馬集團總醫院，平頂山 467000；3.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；4.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

胃癌是一種常見的消化系統腫瘤，據世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的全球最新癌癥負擔數據預估，2020 年全球胃癌新增人數達109 萬，位居第5 位，死亡人數達77 萬，位居第4 位[1]。2020 年中國胃癌新發病例47.8 萬例，占全球胃癌發病的43.9%；胃癌死亡病例37.4 萬例，占全球胃癌死亡的48.6%[1]。無論是在全球范圍，還是在中國，胃癌患者的發病率和死亡率均居于所有癌種的前列。由于胃癌早期癥狀不明顯，中國90%的胃癌患者被發現時已是進展期，錯過了最佳診療時機，一定程度上加大了胃癌的治療難度。近幾年來，隨著醫療水平的提高和相關藥物的研發，胃癌的西醫治療已從手術、放療、化療時代逐步走向免疫、靶向精準醫療時代，一定程度上延長了患者的生存時間，但胃癌患者的整體預后仍未得到明顯改善，總體生存率仍未有明顯提高，如何突破現有的治療瓶頸，改善胃癌患者的生存預后是臨床迫切要解決的難題。

中醫藥在改善胃癌患者癥狀、延長患者生存期等方面具有獨特的優勢。消巖湯作為天津中醫藥大學第一附屬醫院的院內制劑，已應用于臨床治療10 余年，此方以黃芪、太子參為君藥培補正氣，姜黃、郁金為臣藥行氣散結、活血祛瘀，白花蛇舌草、夏枯草、生牡蠣為佐藥清熱解毒、軟堅散結，共奏扶正抗癌之效[2]。臨床研究數據[2-8]表明：消巖湯具有提高患者免疫力、延緩腫瘤進展、提高患者生存質量等療效。諸多臨床案例[9]顯示此方可有效改善胃癌患者的預后，使得更多的胃癌患者從中獲益。現代藥理學研究[10-16]表明，消巖湯水煎液可抑制多種腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡，并可有效逆轉肺癌細胞的順鉑耐藥。但中藥復方成分復雜、靶點眾多，其具體的有效成分及作用機制尚不明確，本研究利用網絡藥理學方法全面闡述了消巖湯治療胃癌的作用機制，為消巖湯治療胃癌提供理論支撐，并為其進一步的深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 消巖湯化合物篩選 運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）分別檢索消巖湯的組成藥物：黃芪、郁金、姜黃、白花蛇舌草、太子參、夏枯草，獲取其對應的化合物，并以OB≥30%和DL≥0.18 作為篩選條件進行篩選，其中OB 代表藥物口服利用率，DL 代表類藥性。運用中醫藥綜合數據庫（TCMID）和BATMAN-TCM（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine）數據庫檢索TCMSP 未收錄的牡蠣的化學成分。

1.2 消巖湯藥物靶點篩選 運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）查找與所得化合物相對應的蛋白靶點，利用Uniprot 查詢蛋白靶點所對應的基因名稱；運用BATMAN-TCM 數據庫對TCMSP 未收錄的化合物進行靶點查詢，并匯總整理。

1.3 胃癌靶點篩選 分別利用DrugBank、GeneCards（設置Relevance score≥9.81）、OMIM 數據庫檢索胃癌對應的疾病基因，并對3 個數據庫的檢索結果進行合并，去除重復和假陽性的靶點基因。

1.4 藥物-化合物-交集靶點網絡構建 獲取藥物靶點基因和胃癌靶點基因的交集，并利用交集基因對化合物進行反向篩選，運用Cytoscape3.7.2 軟件繪制藥物-活性成分-交集靶點網絡圖。

1.5 蛋白相互作用網絡構建 將獲得的交集靶點基因輸入String 數據分析平臺（https：//string-db.org）進行數據分析，置信度設置為≥0.900，隱藏游離節點，構建蛋白相互作用（PPI）網絡，運用Cytoscape3.7.2 軟件繪制相關圖譜，并運用MCODE插件對PPI 網絡進行Cluster 模塊分析。

1.6 GO 富集分析和KEGG 富集分析 運用Metascape數據庫對交集靶點基因進行KEGG 富集分析及GO富集分析，設定物種為人（Homo sapiens），分別選擇生物過程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）、細胞組成（Cellular Components）、KEGG通路（KEGG Pathway）進行富集分析，并繪制水平柱狀圖及氣泡圖。

1.7 生存分析 利用Kaplan-Meier Plotter 數據庫（http：//kmplot.com/analysis/index.php?p =service） 探索關鍵基因靶點對胃癌患者OS 的影響，繪制相關基因高低表達的生存曲線，以評估每個基因靶點的預后意義。

2 結果

2.1 活性成分篩選結果 利用TCMSP 數據庫分別收集消巖湯中活性成分的基本信息，以OB≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，共得到消巖湯活性成分64 個，其中：黃芪20 個、白花蛇舌草7 個、太子參8 個、夏枯草11 個、郁金15 個、姜黃3 個；利用TCMID 數據庫和BATMAN-TCM 數據庫收集牡蠣的活性成分，獲得活性成分10 個。剔除重復的活性成分及未找到對應靶點的活性成分，最終獲得消巖湯活性成分41 個，表1 列出了符合條件的消巖湯活性成分的基本信息。

表1 消巖湯活性成分信息

2.2 交集靶點預測結果 通過TCMSP 數據平臺及BATMAN-TCM 數據庫對消巖湯藥物組成中的活性成分所對應的蛋白靶點進行搜集整理，并利用UniProt 數據庫將其轉換為對應的人類基因名稱，共得到266 個靶點基因。通過檢索DrugBank、GeneCards （設置Relevance score≥9.81）、OMIM 數據庫，合并去重后共獲得胃癌靶基因1163 個。將消巖湯藥物靶基因與胃癌靶基因進行映射，得到交集靶基因共116 個（見圖1）。

圖1 消巖湯組方藥物與疾病交集靶點

2.3 中藥—活性成分—交集靶點網絡構建 利用Cytoscape3.7.2 軟件繪制消巖湯治療胃癌的藥物—活性成分—交集靶點網絡（見圖2），其中黃色菱形代表消巖湯藥物組成，藍色矩形代表交集靶點所對應的活性成分，紫色橢圓形代表消巖湯治療胃癌的交集靶點。

圖2 消巖湯藥物—活性成分—交集靶點網絡

2.4 蛋白相互作用網絡圖 將消巖湯治療胃癌的交集靶點導入String 數據庫，進行數據分析及PPI網絡構建，并運用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制蛋白相互作用網絡圖譜，設置節點大小與顏色以反映Degree 值，設置連線粗細與顏色以反映Combine score值，最終得到圖3。圖中共有109 個節點，512 條連線，其中Degree 值排名前十的蛋白依次為TP53、JUN、AKT1、MAPK3、RELA、MAPK1、ESR1、MAPK14、IL6、FOS，表明這些蛋白為消巖湯治療胃癌的關鍵靶點蛋白。為進一步了解PPI 網絡的生物作用，利用MCODE 插件對PPI 網絡進行Cluster 模塊分析，共獲得5 個Cluster 模塊，圖4 列出了排名前三的Cluster 模塊（具體信息見表2）。分別對三個Cluster模塊進行GO 分析，發現Cluster1 主要對脂多糖的反應、對生長因子的反應、對細胞白介素-1 的反應、上皮細胞增殖等生物過程相關；Cluster2 主要與外源性凋亡信號通路、上皮細胞遷移調節、防御反應的調節、脂多糖應答、巨噬細胞分化等生物過程相關；Cluster3 主要與線粒體膜通透性的調控、凋亡信號通路、P53 類介導的固有凋亡信號通路、線粒體膜通透性的正調節、成纖維細胞增殖的調控等生物過程相關。

圖3 消巖湯治療胃癌的有效靶點PPI 網絡

圖4 消巖湯治療胃癌MCOED 基因簇聚類分析

表2 消巖湯治療胃癌的Cluster 模塊數據

2.5 GO 功能富集分析 運用Metascape 數據庫對消巖湯治療胃癌的交集靶點基因分別進行GO 生物過程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）以及細胞組成（Cellular Components）的富集分析，并繪制水平柱狀圖（圖5），條形的長度代表對應條目所富集的基因數目，條形的顏色代表不同的GO 富集類別，富集結果主要包括：凋亡的信號通路、對無機物質的反應、對氧化應激的反應、對化學應激的反應、活性氧反應、細胞死亡的正調控等生物過程；轉錄因子結合、蛋白激酶結合、蛋白結構域特異性結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、蛋白激酶活性等分子功能；膜筏、膜微區、囊腔、細胞質囊泡腔等細胞組成。

圖5 GO 生物學功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 運用Metascape 數據庫對消巖湯治療胃癌的交集靶點基因進行KEGG 通路的富集分析，表3 列出了排名前十位的KEGG 通路（P 值越小表明富集越顯著）：腫瘤相關信號通路、乙型肝炎、丙型肝炎、膀胱癌、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、內分泌抵抗、前列腺癌、查加斯病（美國錐蟲病）、PI3K-Akt信號通路。并以節點大小反映基因數，以節點顏色反映P 值高低，繪制KEGG 通路富集氣泡圖（圖6）。

2.7 關鍵基因的生存分析 利用Kaplan-Meier Plotter 數據庫，分別對TP53、JUN、AKT1、MAPK3、RELA、MAPK1、ESR1、MAPK14、IL6 九個Degree 值排名靠前的關鍵基因的表達與胃癌患者相關數據進行了多因素Cox 回歸分析。分析結果顯示，TP53、AKT1、MAPK3、RELA、ESR1 高表達的患者總生存顯著低于低表達組，JUN、MAPK1、MAPK14 高表達患者的總生存則顯著高于低表達組，IL-6 的高低表達與患者的總生存無明顯相關性（P＞0.05）。

3 討論

胃癌，據其臨床表現，可歸屬于中醫“積聚”“反胃”“癥瘕”“伏梁”“胃脘痛”“心腹痞”等病范疇。胃癌的發生發展過程中，正氣虧虛為根本，痰、瘀、毒邪相互搏結是基本病機，其中脾虛是所有病機共用的主線，“陰陽氣不相順接”，脾胃之氣的“耗散”是其病機轉化的關鍵[17]。消巖湯以“扶正抗癌，黜濁培本”的治療大法，重用黃芪培補元氣；加以太子參益氣健脾，以防脾氣耗散；臣以姜黃、郁金活血祛瘀；佐以白花蛇舌草、夏枯草、生牡蠣清熱解毒、軟堅散結，以達扶正氣、散積聚、化瘀毒之功。

本研究借助網絡藥理學分析方法，構建 “藥物—活性成分—靶點”網絡圖，對中藥復方消巖湯治療胃癌的作用機制進行了系統全面的分析。利用數據平臺分別對藥物和疾病的靶基因進行篩選，將藥物活性成分對應的靶基因以及疾病對應的靶基因進行對比，獲得交集基因116 個，篩選到潛在化合物35 種，其中部分化合物的有效性及作用機制已得到證實。黃芪、白花蛇舌草、夏枯草均富含槲皮素。現代藥理學研究表明，槲皮素可以直接抑制腫瘤，誘導多種腫瘤細胞株的凋亡，有效發揮抗癌作用。研究數據[18]顯示，槲皮素通過增加ROS（活性氧）的產生、降低線粒體膜電位水平而誘導AGS 細胞凋亡。此外，研究[19]發現槲皮素能夠通過調節NF-κb、PKC-δ、ERK1/2 和AMPKα，阻斷uPA/uPAR 功能，從而發揮抗胃癌細胞轉移的作用。黃芪和夏枯草中均含有一種常見的黃酮類化合物—山柰酚，一項關于山柰酚抑制胃癌腫瘤生長的體內外研究[20]顯示，山柰酚對胃癌MKN28 和SGC7901 細胞的增殖有明顯的抑制作用，而實驗劑量下對GSE-1 正常胃上皮細胞株無明顯抑制作用，此外，山柰酚處理后胃癌細胞出現明顯的凋亡和G2/M 期細胞周期阻滯，體外的研究顯示山柰酚還對胃癌移植瘤的生長有明顯抑制作用。另有研究表明[21]：山柰酚可以通過IRE1-JNK-CHOP 途徑誘導胃癌細胞自噬死亡，從而起到抗癌的作用。太子參的主要活性成分木犀草素同樣具有抗腫瘤的藥理活性，其通過調控Notch1[22-23]、PI3K-Akt[24]、MAPK[24]、mTOR[25]、STAT3[25]等信號通路，抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移以及血管生成，促進胃癌細胞凋亡，起到抗癌的功效。上述化合物多數具有較高的度值，提示這些化合物對應的靶點基因可能在消巖湯治療胃癌過程中起主要作用。

由靶點蛋白相互作用網絡圖可知，TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK3 等靶點節點較大，與其相連的成分較多，可能為消巖湯治療胃癌的關鍵靶點。TP53 是與人類腫瘤相關性最高的基因之一，也是胃癌中最常見的突變基因，本研究利用Kaplan-Meier Plotter 數據庫的相關數據進行生存分析，結果顯示TP53 的高表達提示較差的胃癌預后。免疫組學分析[26]顯示TP53 突變能夠抑制胃癌的腫瘤免疫，通過檢測TP53 突變狀態有助于對胃癌患者某種免疫治療的反應進行分層。AKT1 屬于AKT 基因家族，能夠推動胃癌的進展并促進胃癌細胞的增殖[27]。沉默AKT1 可抑制胃癌細胞增殖，增加細胞凋亡，同時還會導致胃癌細胞對順鉑的化療敏感性明顯增強，這可能與PI3K/Akt1 信號通路失活相關[28]。MAPK1、MAPK3 均屬于MAPK 家族，通常形成多層通路，在基因表達調控和細胞質功能活動中發揮關鍵作用。研究表明，多種LncRNA[29-31]通過直接或間接靶向MAPK1 調控胃癌細胞的增殖和遷移。生存分析的數據顯示，MAPK3 的高表達與胃癌患者的不良預后相關，MAPK1 高表達則多提示較長的總生存。

分別對交集基因進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析以探討其具體的功能作用和相關通路。GO 功能富集結果顯示，消巖湯主要通過調控細胞因子介導的信號通路、凋亡的信號通路、對無機物質的反應、對毒性物質的反應、細胞死亡的正調控等達到抗胃癌的功效。KEGG 通路富集分析結果顯示，消巖湯治療胃癌主要涉及PI3K-AKT、IL-17、TNF 等信號通路以及癌癥中的蛋白多糖、microRNA、鉑類耐藥等分子機制。其中PI3K-AKT信號通路作為消巖湯治療胃癌的關鍵通路，在調控包括細胞增殖[32-33]、凋亡[33]、血管生成[34]、侵襲和轉移[32]在內的多種細胞功能中起著至關重要的作用。另有研究[35]發現，可以通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路改善胃癌對順鉑的化療敏感性。慢性炎癥被認為是包括胃癌在內的許多上皮癌的關鍵促瘤因子[36]。IL-17 是一種促炎細胞因子，參與多種疾病的發生發展，IL-17 介導的LCN2 可以通過靶向SLPI 影響胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和細胞周期[37]。相關研究表明，IL-17 是一把雙刃劍，其不僅可以通過調節腫瘤血管生成[38]和增強腫瘤免疫逃逸在腫瘤發生中發揮致癌作用，還可以通過增強自然殺傷細胞（NK）和細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）的激活、向腫瘤組織中募集中性粒細胞、NK 細胞、CD4+和CD8+T 細胞等，發揮抗腫瘤作用[39]。TNF 信號通路主要參與調控胃癌細胞的遷移、侵襲以及上皮-間充質轉化（EMT）[40]等生物學行為。此外，有研究發現腫瘤相關的巨噬細胞可以通過IL-6 和TNF-β 信號傳導誘導胃癌細胞中的PD-L1 表達[41]，腫瘤內肥大細胞增加可以通過TNF-α-PD-L1 途徑促進免疫抑制和胃癌進展[42]。由此可見，消巖湯治療胃癌的作用機制以調控腫瘤細胞的功能及干預腫瘤相關信號通路為主[43]。

本研究亦存在一定的局限性：1）由于TCMSP數據庫未收錄牡蠣的活性成分信息，本研究借助TCMID數據庫和BATMAN-TCM 數據庫對牡蠣的活性成分進行收集，但限于數據庫條件限制，無法利用OB 值以及DL 值對牡蠣的活性成分進行篩選。2）網絡藥理學是一種計算與預測的學科，隨著數據庫的不斷更新和新研究的出現，網絡藥理學的結果也會不斷變化，需要及時更新[44]。3）本研究在檢索成分時沒有對相關文獻進行整合篩選，需要日后研究進行補充完善[44]。

4 結語

綜上所述，本研究利用網絡藥理學手段對消巖湯治療胃癌的靶點、生物學途徑以及相關通路進行初步預測，同時也初步探討本方發揮藥效的主要活性成分，為本方治療胃癌的作用機制提供了客觀依據，也為今后臨床的中醫藥應用以及本方的優化提供了一定的參考，但結果的準確性仍需進一步基礎及臨床研究驗證。